Summary
이 프로토콜은 피부 심장 근구를 사용하여 심장 기능의 추출 및 평가 기술을 단계별로 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론은 마우스에서 남성에 이르기까지 다른 심장 위치에서 수집 할 수있는 작은 냉동 생검을 사용하여 myofilament 기능의 측정 및 급성 변조를 허용합니다.
Abstract
이 기사에서는 단일 과구("skinned") 심근세포를 분리하고 기능적 연구를 수행하기 위해 힘 측정 장치 및 모터에 부착하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 이러한 연구는 심근세포 강성(수동력)과 다른 칼슘(Ca2+)함유 솔루션으로 활성화하여 최대 력 개발, 근안타멘트 Ca2+-감도(pCa50),쿠퍼티움(nHill) 및 힘 재개발 속도(ktr)를 측정할 수 있습니다. 이 방법은 또한 근막에 직접 작용하는 약물의 효과와 심근세포의 활성 및 수동 적 특성모두에 외인성 재조합 단백질의 발현을 가능하게합니다. 임상적으로, 피부 심근 세포 연구는 많은 심근 질환의 병리생리학을 강조하고 myofilaments를 대상으로 치료 개입의 영향의 체외 평가를 허용. 전부, 이 기술은 열린 심혼 또는 이식 수술 도중 얻은 동물 모형 및 인간 조직에서 시험관 내 및 생체 내 파라미터 사이 상관관계를 조사하여 심장 병리생리학의 설명을 가능하게 합니다.
Introduction
전통적으로 심근 기계적 특성에 대한 평가는 주로 유두 근육 및 trabeculae1,2와같은 다세포제제에서시도되었습니다. 다세포 심장 근육 스트립은 방향 및 힘 생성의 알 수없는 패턴을 가진 수축 심근 세포를 포함하는 세포의 이질적인 인구, 전기 활동 및 스트레스 / 변형 분포뿐만 아니라 주변 결합 조직 매트릭스3,4을포함한다. 콜라겐없이 준비하고 단일 심근 세포를 포함하는 것은 매우 정확하고 제어 된 방식으로 sarcomere 길이와 크로스 브리지 수축 특성의 측정을 허용할것이다5,6. 따라서, 지난 4년 동안, 단일 심근세포6,7의기계적, 수축 및 이완 특성을 조사할 수 있도록 여러 가지 방법론이 개발되었다. 이들 세포의 수축 기능은 사코메 길이 및 크로스 브리지 사이클링 운동학3에크게 의존한다. 따라서, 단 하나 고립 된 심장 세포에서 근육 기능을 직접 조사하는 것이 바람직하다, 그것은 사메레 길이 및 성능뿐만 아니라 크로스 브리지 기능 및 수축 특성을 평가 할 수 있다는 점을 고려. 그러나, μN 수준에서 힘 측정을 기록하는 동안 합리적인 광학 sarcomere 해상도로 기능성 심근세포를 분리하고 부착하는 것은 여전히 도전적이고진화3,6이다. 다른 과제는 갓 수거된 생검에서 심근세포를 분리하기 위해 설치해야 하는 물류입니다. 인간 생검 수집의 예측 불가능성은, 예를 들면, 실험의 타당성을 위태롭게 할 수 있습니다.
더욱이, 과학적 절차에 대한 동물 실험의 교체, 감소 및 정제에 관한 윤리적 관심사 (3R의 원칙)는 세포 및 조직 수준, 바람직하게는 인간의 생검 또는 작은 동물 샘플에서 연구 변화를 촉진했다. 실제로 복잡성의 작은 수준에서 시험관 내 심장 기능을 평가하는 방법론의 점진적 개선은 전신에 결과의 적절한 통합을 허용하고 임상 시나리오7로변환할 수 있습니다. 전부, 심근구를 추출하기 위해 -80°C에 저장된 샘플을 사용하는 것이 매력적인 대안일 수 있다.
심근 조직은 작은 조각으로 절단하고 박격포와 봉제와 균질화된다. 이러한 균질화의 결과는 다양한 정도의 사콜렘말 손상을 가진 피부 뭉닝 및 분리된 세포의 현탁액으로, 이 때 근근증이 입욕 매체에 노출되고 모든 세포 성분이 씻겨나난다. 사콜마에서 멀리 떨어져 있는 근시릴과 같은 구조물은 보존되어 있습니다. 따라서, 근시릴라 장치와 관련된 사컴레 단축 및 기능성 특성은 그대로 유지되며8,9를기록할 수 있다.
심근세포 력 측정 시스템은 심근세포 길이를 조정하는 데 사용되는 전자기 모터와 동급성 심근세포 수축을 측정하는 힘 트랜스듀서로 구성됩니다. 투과, 또는 피부, 심근세포는 편안한 용액 ([Ca2+] < 10 nM)을 포함하는 실험 챔버에 배치되고 실리콘 접착2 얇은 바늘 : 하나는 모터에 부착되고 다른 하나는 힘 트랜스듀서에 부착됩니다. 광학 시스템은 심근세포 형태와 사코프레 길이를 결정하는 데 사용됩니다. 실험 프로토콜은 종종 상이한 Ca2+ 농도를 포함하는 완충액의 일련의 힘 기록, 액틴-미오신 크로스 브리지 운동제의 결정 및 미리 정의된 sarcomere 길이에서 장착된 심근세포의 수동 장력측정(그림 1)으로구성된다. 액체 질소에서 동결된 심근 샘플로부터 의 분리(그리고 이후 -80°C에 저장됨)는 단단 면적당 최대 Ca2+활성화(활성) 힘을 측정하기 위한 세포 역학 및 단백질 생화학을 활용하는 기술입니다(T 활성, kN∙m-2), Ca 2+ 독립(T 활성, kN+m-2), Ca 2+-독립(T 활성, kN+m-2), Ca 2+ 독립(T 활성, kN+m-2), Ca 2+ 독립(T활성,kN+m-2), Ca2+독립(패시브) 장력(T패시브,kN+m-2), 근안회카2+민감도(pCa50),근안회(nHill), 힘 재개발(ktr) 및 T활성,T패시브,pCa50,nHill 및 ktr의 사코머 길이 종속성.
이 프로토콜의 목표는 다른 종에서 냉동 된 샘플에서 분리 된 단일 피부 심근 세포의 기능적 기계적 특성을 평가하는 신뢰할 수있는 절차로 심근 세포 력 측정 시스템의 잠재력을 설명하고 요약하는 것입니다.
Protocol
모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드 (NIH 출판 번호 85-23, 개정 2011) 및 동물 복지에 대한 포르투갈법 (DL 129/92, DL 197/96)을 준수합니다. P 1131/97). 유능한 지방 당국은이 실험 프로토콜 (018833)을 승인했습니다.
1. 주식 솔루션 준비(표 1)
- 표 2의지시에 따라 심근세포 분리(RELAX-ISO)를 위한 1,000mL의 이완 솔루션을 준비한다. 위의 시약을 ≈500mL로 용해하고 KOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조정합니다. 최종 볼륨을 1000mL로 조정합니다.
- 50mL 튜브에 RELAX-ISO를 배포합니다. -20 °C에 보관하십시오.
- 표 3의지침에 따라 250mL의 활성화 솔루션을 준비한다. 위의 시약을 초순수 ≈100mL로 용해하십시오. 15°C에서 5M KOH로 pH를 7.1로 조정합니다.
참고 : 일반적으로 원하는 pH에 도달하기 위해 상당한 양의 KOH를 추가해야합니다. 15°C로 용액을 식히기 위해 얼음이 있는 상자에 체피 풍선을 넣습니다.- 최종 볼륨을 250mL로 조정합니다. 이 용액을 마그네틱 교반기와 함께 지속적으로 교반하여 편안한 용액과 혼합하는 순간까지 이 솔루션을 지속적으로 교반합니다.
- 표 4의지침에 따라 100mL의 편안한 솔루션을 준비한다. 위의 시약을 ≈50mL의 초순수수로 녹입니다. 15°C에서 KOH 5M로 pH를 7.1로 조정합니다.
참고: 일반적으로 7.1의 pH에 도달하기 위해 상당한 양의 KOH를 추가해야합니다. 체적 풍선을 얼음으로 가득 찬 상자에 놓아 용액을 15 °C로 식힙니다. 측정 중에 사용되는 솔루션의 이온 강도는 180mM에 달했습니다.- 최종 볼륨을 100mL로 조정합니다. 활성 액액과 혼합하는 순간까지 자기 교반기와 함께 이 솔루션을 지속적으로 교반합니다.
- 5표에 제시된 비율로 활성화 및 이완 솔루션을 혼합하여 5.0에서 6.0 사이의 pCa 솔루션을 얻습니다.
- 항상 긴장을 풀고 두 가지를 혼합하면서 교반 솔루션을 활성화하십시오.
- 알리쿼트 각 혼합물을 2mL 마이크로튜브에 대고 한다. 모든 마이크로튜브를 -20°C에 저장합니다.
- 각 프로토콜에 대해 다른 pCa 솔루션 배치(4.5 ~ 6.0)를 준비합니다.
2. 힘 변환기의 교정
참고: 힘 변환기의 교정은 몇 달마다 또는 교정되지 않은 것으로 의심되는 경우 수행해야 하는 일상적인 절차입니다. 힘 트랜스듀서는 매우 민감하며 쉽게 파손됩니다. 그것은 부드럽게 그것의 사용의 모든 단계에서 처리 해야 합니다., 교정 을 포함 하 여, 심 근 세포의 접착제 및 청소.
- 장치의 나머지 부분에서 힘 변환기를 분리합니다.
- 클램프의 도움으로, 바늘이 심근세포가 힘을 개발할 것과 같은 방향으로 아래쪽으로 가리키는 방식으로 힘 변환기를 수평으로 놓습니다. 이렇게 하면 알려진 가중치(탄성 밴드, 봉합사 또는 핀)가 있는 일련의 질량을 매달아 쉽게 할 수 있습니다.
참고: 이 단계로 진행하기 전에 힘 변환기의 특성을 확인하여 스케일 팩터[mg/volt]를 확인하고 트랜스듀서에 과도한 무게를 피하십시오. 힘 트랜스듀서 모델의 경우, 스케일 인자는 50(50 mg은 1볼트에 해당) 12.5에서 250 mg 사이의 5개의 가중치를 사용합니다. - 포스 트랜스듀서를 켜고 30분 동안 따뜻하게 해보세요.
- 먼저 포스 트랜스듀서에 가벼운 질량을 걸고 FORCE OUT에서 측정된 해당 전압을 등록합니다.
- 최대 5개의 가중치에 대해 이 절차를 반복합니다.
- 힘 변환기(load)와 전압에 적용된 플롯 력과 선형성을 확인합니다.
- 선형성이 없는 경우 변환기의 회로 기판에서 0을 조정하고 전위요계를 얻습니다. 자세한 내용은 해당 특정 지침을 확인합니다.
- 출력 전압이 0.0 V를 읽을 때까지 0 potentiometer를 켭니다.
- 트랜스듀서 바늘에 중간 중량을 손과 상기 게인 전위오차계를 조절하여 해당 전압을 읽습니다(예를 들어, 50 mg은 1V에 해당). 무게를 제거하고 0.0으로 0 potentiometer를 다시 조정합니다.
- 무게가 있는 출력이 정확할 때까지 2.6.2단계를 반복합니다.
- 힘 변환기를 장치에 다시 장착합니다.
3. 실험 장치 설정
- 각 활성화, 4.5, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 및 편안한 솔루션의 하나의 유리병을 해동하고 얼음에 유지합니다.
참고: ATP와 PCr은 추운 온도에서 유지되어야 하는 음순 화합물입니다. - 현미경, 테스트 장치 및 관련 컴퓨터를 준비하여 사용할 수있습니다(그림 1).
- 실내 온도계가 15°C를 읽게 되도록 온도를 조정합니다. 키나아제 및 인산염 인큐베이션(20°C)을 제외한 모든 실험을 이 온도에서 수행한다.
- 힘 변환기와 모터를 켭니다.
4. 피부 심근세포의 추출 및 투과성
- 릴렉스-ISO 솔루션의 해동 50mL.
- 원심분리기를 켜고 최대 4°C까지 빠르게 식힙니다.
- RELAX-ISO 용액 2.5mL를 함유한 페트리 접시에 심근 샘플의 3-5 μg를 해동하십시오.
- 메스 블레이드로 작은 조각으로 조직을 잘라(그림 2). 불필요한 세포 손상을 방지하기 위해 정확한 방법으로 샘플을 잘라.
- 2.5mL의 RELAX-ISO 용액을 티슈로 포터-엘베젬 유리로 옮기는 컷 파이펫 팁을 사용한다.
- 30-40 rpm의 회전 속도로 분쇄기로 조직을 기계적으로 방해합니다. 좋은 세포 현탁액을 얻기 위해 각각 2 s에 대한 조직을 3 회 누릅니다.
- 15mL 튜브에 RELAX-ISO 용액(릴렉스-ISO 2.25mL의 트리톤의 250 μL)에서 10% 트리톤을 준비하고 이 솔루션을 셀 서스펜션에 추가합니다.
- 튜브를 3번 반전시켜 부드럽게 섞습니다.
- 실온에서 1분 4분 동안 얼음을 배양합니다.
- 15mL 튜브의 상단에 RELAX-ISO를 추가하여 트리톤을 씻어; 부드럽게 혼합 (튜브의 3 배를 반전) 마지막으로 각진 원심 분리기 (348 x g에서1 분)에서 세포를 회전. 셀 펠릿 위의 상체를 최대 3mL까지 제거합니다.
참고: 셀 펠릿을 방해하지 않도록 상체를 부드럽게 제거합니다. 여전히, 상체에 있는 몇몇 세포는 필연적으로 분실될 것입니다. - 4.10 단계를 4회 이상 반복하거나 트리톤 잔류물이 생성한 더 이상 거품이 관찰되지 않습니다.
참고: 세척 단계가 많을수록 폐기된 상체로 셀이 더 많이 손실됩니다. - 마지막 세척에서, 셀 서스펜션의 5-10 mL의 부피까지 상체를 제거합니다.
5. 피부심근세포를 선택하고 접착
- 현미경 슬라이드홀더(도 1)에유리 슬라이드 위에 커버슬립에 셀 서스펜션 드롭을 놓습니다.
- 좋은 줄무늬와 크기(그림 2)와단일 막대 모양의 심근구를 선택합니다.
- 반전된 현미경의 가장 낮은 배율을 사용하여 포스 트랜스듀서와 모터의 바늘 끝을 찾아보십시오.
- 커버슬립을 회전하여 선택된 심근세포가 수평으로 배치되어 끝이 힘 트랜스듀서및모터(도 2)의바늘과 정렬되도록 한다.
- 면봉팁(그림 2)의도움으로 커버슬립 측면에 얇은 접착제 라인을 놓습니다.
- 힘 트랜스듀서와 모터의 바늘 끝을 접착제 라인에 담그고 두 팁 주위에 접착제 후광을 만듭니다.
참고: 단계 5.6 - 5.10은 전동 마이크로 포치셔를 신중하게 사용하여 수행됩니다. - 바늘 끝을 심근세포의 초점 평면에 가깝게 빠르게 이동합니다.
- 힘 트랜스듀서의 바늘 끝을 아래로 이동하여 심근세포의 한 가장자리에 붙입니다.
- 모터의 끝과 셀의 다른 단각으로이 절차를 반복합니다.
참고: 접착제가 매우 빠르게 치료하기 시작하면 이 절차는 2-3분 미만이어야 합니다. - 5-8 분 후, 바늘을 들어 ≈15 μm을 들어 올려 덮개 슬립에 셀을 붙이지 않도록하십시오. 이 작업은 두 미세 조작기를 동시에 이동하여 수행됩니다.
- 접착제를 치료하자. 이 절차는 접착제의 종류에 따라 15 분에서 45 분까지 지속될 수 있습니다. 우리의 경우, 심근 세포는 ≈ 15 분 후에 적절하게 접착됩니다.
6. 활성, 수동 및 Ca2+ 감도의 기록 힘 측정
- 이완 용액(실험 용장치에서 55-100 μL)과 제2 실험용액을 잘 채우는 제1 실험용액을 잘 채운다.
- 카메라 소프트웨어를 사용하여, 사루의 명확한 패턴으로 심근 세포의 영역에 관심 영역 (ROI)을 배치합니다.
참고: 심장 심근세포의 경우 작동 sarcomere 길이는 1.8과 2.2 μm 사이이며 최적의 사코프레 길이는 약 2.15 μm입니다. - 최적의 사코메 길이가 설정된 후 심근세포(모터에서 트랜스듀서 접착제 후광, 도 3)의두 극한 사이의 거리를 측정한다(2.2 μm). 값을 소프트웨어에서 근세포 길이로 기록합니다.
- 세포에 수직으로 배치 된 프리즘 거울의 도움으로 심근 세포 폭과 깊이를 측정합니다.
참고: 프리즘을 통해 셀을 시각화하려면 강력한 외부 광원이 필요합니다. 프리즘이 없고 심장 세포가 타원형 모양을 가지고 있다고 가정하면 심근세포 깊이는 심근세포 폭의 70 %로 유추 될 수 있습니다. - 심근세포의 타원형 형상을 가정하면 단면 영역(CSA, mm2)을계산합니다.
- 현미경 스테이지를 부드럽게 이동하여 세포가 커버슬립에서 무대 뒤쪽에 있는 이완용액을 함유하는 우물로 이동하도록 합니다.
참고: 이 절차는 셀을 쉽게 손상시킬 수 있습니다. 세포를 움직이기 전에 바늘을 조금 더 부드럽게 움직입니다. 용액에서 셀을 제거하지 마십시오. - 셀이 Ca2+ 솔루션및 이완 솔루션에서 발생할 때 발생하는 두 개의 셀 단축(초기 길이의 80%)이 포함된 소프트웨어에서 프로토콜을 선택합니다(그림1,보충 파일).
참고: 셀의 첫 번째 "슬랙"은 활성화 용액 과 편안한 솔루션 내에서 두 번째 "슬랙"내에서 수행됩니다. 이를 통해, 사용자는2nd로부터세포의1st 및패시브포스(F 수동)로부터 셀의 총력(Ftotal)을계산할 수 있을 것이다. 수식을 사용하여 활성 력, F활성 = F합계 - F패시브를 계산합니다. 모든 크로스 브리지 레코드 힘을 분리하기 위해 셀이 80% 단축됩니다. - 심근세포가 이완에서 활성화 용액(pCa=4.5(1)으로 이동하도록 현미경 단계를 이동시킴으로써 등자극성 수축을 유도한다.
참고: 셀이 작동하는 경우 즉시 수축됩니다. - 힘 고원에 도달하면 힘 데이터를 기록하기 시작합니다.
참고: 테스트를 개별적으로 수행할 수 있습니다. 소프트웨어에 따라 Ca2+ -감도 프로토콜 내에서 다른 Ca2+솔루션에 해당하는 일련의 테스트 시퀀스를 만들 수 있습니다(그림1,보충 파일). - ~10s를 기다린 다음 활성화 용액에 침지된 셀을 전환합니다.
참고: 편안한 솔루션에 셀을 몰입하기 전에 10초를 기다려야 합니다. 셀이 너무 일찍 이동하면 셀(ktr 값)의 재개발 력을 계산하는 중요한 데이터가 손실될 수 있습니다. - 심근세포가 편안한 용액에 몰입할 수 있도록 신속하게 스테이지를 이동합니다.
- 테스트가 중지될 때까지 기다립니다.
- 반복 단계 6.8 - 6.12세포가 활성화 용액(pCa=4.5(2)에서 두 번 활성화되도록 한다.
참고: 일반적으로 첫 번째 활성화 후 심근세포 끝은 바늘 끝에서 약간 분리되어 심근세포 길이, CSA 및/또는 사코프레 길이를 변경할 수 있습니다. 원하는 sarcomere 길이로 재조정하고 소프트웨어에서 수정된 치수를 소개합니다.- Ca2+ 감도 프로토콜에 대해 6.13.2 단계를 계속하거나 데이터를 저장, 셀의 수동 및 활성 힘의 값이 필요한 유일한 매개 변수인 경우 바늘에서 세포를 분리하고 접착제를 제거하기 위해 아세톤으로 청소.
- 필요한 경우 셀의 사코리 길이를 2.2 μm로 조정하여 다시 약간 스트레칭합니다.
- 활성화 용액을 다음 Ca2+ 솔루션(55-100 μL)으로 바꿉니다. 6.8 - 6.12 단계를 반복합니다.
- 활성화 용액을 다음 Ca2+ 솔루션(55-100 μL)으로 교체하고 모든 솔루션이 테스트될 때까지 6.8 - 6.12 단계를 반복합니다(5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0).
- 마지막으로 활성화 용액(pCa4.5(3)을 통해 셀을 다시 활성화합니다. 6.8- 6.12 단계를 반복합니다.
7. 키나아제와 인산염을 가진 배양
- 선택한 기준 프로토콜을 수행한 후, 권장 농도에서 편안한 용액에서 키나아제/인산염을 희석시.
참고: 실험 전에 용량 반응 곡선을 수행하는 것이 좋습니다. - 실험 우물의 온도를 20°C로 설정합니다.
- 키나아제/인산염, 릴렉스 솔루션 및 활성화 용액(55-100 μL)으로 실험용 우물을 채웁니다.
- 현미경 단계를 부드럽게 이동하여 세포가 키나아제/인산염을 함유하는 우물에 침지되도록 합니다.
- 키나아제/포스파아아제와 심근세포에 적어도 30분 동안 또는 제조업체의 지시에 따라 배양합니다.
- 선택한 기준 프로토콜을 반복합니다.
8. 실험 마무리
- 세포를 스트레칭하여 힘 트랜스듀서와 모터의 끝에서 심근세포를 풀십시오.
- 아세톤에 담근 면봉을 사용하여 바늘 끝에서 접착제 후광을 조심스럽게 제거합니다.
- 장비를 종료합니다.
9. 데이터 분석
- 테스트된 각 심근세포에서 모든 파일을 수집합니다.
참고: 각 테스트는 하나의 파일에 해당합니다. 즉, 각 Ca2+ 솔루션 또는 사코레 길이에 대해 해당 파일이 있습니다. - 단일 심근세포의 활성 및 수동 력을 계산합니다.
- 스프레드시트(그림3A, 부록 A를 보충 파일)를사용하여첫 번째 활성화(pCa=4.5(1)에 해당하는 파일을 엽니다.
참고: 분석을 수행하기 위해 맞춤 제작 프로그램을 사용했습니다. 추가 파일에 부록 A를 참조하십시오. - 셀의 1st 슬랙(셀이 Ca2+ 용액에 침지될 때) 전과 평균 ≈60값의 평균 ≈60값). 이 2값은 각각 a 및 b에 해당합니다.
- 셀의2nd 여유(셀이 이완용에 침지될 때)에 대해 동일한 분석을 반복합니다. 이 2값은 각각 c및 d에 해당합니다.
- a와 b(총력, F 합계)의 차이를계산합니다.
- c와 d(수동 력, F패시브)의 차이를 계산합니다.
- 활성 력, F활성 = F합계 - F패시브를 계산합니다.
- 모든 힘 값을 CSA로 정규화하여 총 장력(Ttotal),수동 장력(T수동)및 활성 장력(T활성)을얻습니다.
- 2nd 활성화를 위한 9.2.1 ~ 9.2.5(pCa=4.5(2)를 반복합니다.
- 이러한 값을 분석 중인 심근세포의 T합계,T활성 및 T패시브를 나타내는 값으로 간주하십시오.
참고: pCa4.5(1)를 가진 세포의 첫번째 활성화는 일반적으로 셀 치수에 있는 변경과 연관됩니다. 이러한 이유로 pCa4.5를 사용한 2차 활성화가 더 정확하며 사용할 수 있습니다. - 각 파일/pCa 테스트 솔루션(5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)에 대해 9.2.1 ~ 9.2.5단계를 반복합니다.
- 스프레드시트(그림3A, 부록 A를 보충 파일)를사용하여첫 번째 활성화(pCa=4.5(1)에 해당하는 파일을 엽니다.
- 단일 심근세포의 pCa50 및 nHill을 계산합니다.
참고: 이 해석의 경우 파일 4.5(2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 및 4.5(3)에서 정규화되지 않은 F활성 값을 사용합니다.- 스프레드시트 파일에 배치하여 테스트한 각 Ca2+ 솔루션에 대해F 활성의 모든 비정규화 값을 배치합니다(4.5(2),5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)).
- 보정 계수 = F활성 [4.5(2)] - F활성 [4.5(3)] / 7을 계산합니다.
- F활성 - 보정 계수를 빼서 각 Ca2+ 솔루션(5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0)에 대해F 활성의 수정된 값을 계산합니다.
- 각C 활성 값을 해당 수정값으로 정규화하여 각 Ca2+ 솔루션에 대한 상대력(F상대성)을계산합니다.
참고: F상대 [4.5(3)]는 1과 같아야 합니다. 각 실험 프로토콜은 Ca2+ 농도(pCa 4.5(2) 및 4.5(3)를 포화시 제어 활성화로 시작하고 종료합니다. 이를 통해 최대 Ca2+활성화 력(Fmax)의변경 사항을 비교하여 준비 의 런다운을 강제로 정규화하고 평가할 수 있습니다. 실험 프로토콜의 끝에서 심근세포는 첫 번째 수축의 최대 힘의 70% 미만을 생성하며, 그 세포/측정은 분석에서 제외되어야 한다. - F상대체 및 해당 pCa 값을 사용하여 다음 방정식 F(Ca)= CanHill/(Ca50nHill + Ca nHill)을 사용하여 시그노이드 곡선에맞습니다.
- 위에서 언급한 방정식에서 pCa 및 nHill 값을 추정합니다.
- 단일 심근세포의 힘 재개발(ktr)의 비율을 계산합니다.
- 1st 셀 여유 직후값에 해당하는 곡선에 맞게 수행합니다.
- 곡선의 경사를 계산하면 이 값은 강제 재개발 속도에 해당합니다.
- 각 Ca2+ 솔루션에 대해 9.4.1 및 9.4.2 단계를 반복합니다.
참고: 가장 낮은 Ca-솔루션(R 제곱≤0.90)에 대해 곡선 적합성이 떨어집니다.
Representative Results
기능성 투과성 심근세포는 전체 실험 전반에 걸쳐 균일하고 일관된 결과물 패턴을 가져야 합니다. 장기간 실험 후 어느 정도의 열화와 힘 감소가 예상되지만, 활성 장력의 가치는 상대적으로 안정되어야 한다. 현물 손실 또는 상당한 힘 감소의 명확한 징후를 보여주는 세포 (< 15 kN∙m-2 또는 초기 활성 력의 80%)는 제외되어야 합니다. 표 6은 설치류, 돼지 및 인간 샘플에서 파생된 가장 중요한 매개 변수에 대해 예상되는 일반 값을 표시합니다.
얻은 매개 변수는 주로 선택한 프로토콜에 따라 달라집니다. 그림 5는 8점 만점에 3의 대표적인 힘 흔적을 보여 주며, 근필라멘트 Ca2+-감도의 프로토콜을 수행하는 데 필요한 힘 기록. 활성 용액을 함유하는 우물으로 세포를 이송함으로써 심근세포는 고원에 도달할 때까지 힘을 개발하기 시작합니다. 빠른 여유 테스트 (1 ms의 지속 시간)를 통해 심근세포가 길이의 80 %로 단축되면 제로 힘의 기준값을 얻습니다. 슬랙 테스트 후, 세포는 활성화 용액에 몰입할 때 계속해서 힘을 개발하고 있습니다. 총 힘(Ftotal)은고원 값을 최소 값에서 빼서 계산합니다. 이 곡선의 마지막 부분의 경사는 우리에게 크로스 브리지 부착 및 분리 (f응용 프로그램 및 gaap)10의명백한 속도의 척도인 힘 재개발 (ktr)(도6)의값값을 제공합니다. ktr R2 값이 & 0.90이면 ktr 값을 배제해야 하며 일반적으로 이는 낮은 Ca2+ 농도(pCa 5.6, 5.8 및 6.0)에서 발생합니다. 편안한 용액을 포함하는 우물로 세포를 다시 옮김한 후 셀이 이완되고 힘이 떨어집니다. 패시브 힘(F수동)은최소한의 값(장시간 세포 단축 후 얻어진)을 이 새로운 힘의 값으로 빼서 계산한다. 액티브 포스는 F토탈과 F패시브의차이로부터 발생합니다.
심근세포를 특징짓는 최대 활성 및 수동 력은 포화 Ca2+-솔루션(pCa = 4.5)을 가진 제2 세포 활성화에서 유래된 힘이다. 첫 번째 활성화는 일반적으로 sarcomere 길이를 재조정해야 하므로 폐기됩니다.
근필라멘트 Ca2+-감도 프로토콜을 수행하려면 최소 9개의 활성화 테스트(4.5; 4.5; 5.2; 5.6; 6.0; 5.0; 5.4; 5.4; 5.8 및 4.5)를 수행해야 합니다. 이 시퀀스는 예시일 뿐이지만 항상 4.5(두 번)로 시작하여 4.5로 끝나야 합니다. myofilament Ca2+-감도 프로토콜에 대한 데이터 수집 소프트웨어프로그래밍은 보충 파일의 그림 1에 묘사됩니다.
이러한 모든 활성화 솔루션에 대한 활성 력을 계산한 후 마지막 활성화가 초기 최대 력의 80% 이상을 산출했는지 확인합니다(그렇지 않으면 위에서 언급한 대로 이 셀 결과를 폐기해야 합니다). 실험 계열 중 Fmax의 감소를 보정하기 위해 보간 Fmax 값을 사용하여 데이터 점을 정규화할 수 있습니다. 정규화된 데이터는 다음 방정식 F(Ca) = CanHill/(Ca50nHill + CanHill)을사용하여 시그오이질 곡선에 적합할 수 있습니다. 얻어진 파라미터 값은 칼슘 민감도(ca50,pCa50로 변환될 수 있음) 및 응고성(nHill)을 나타낸다. 모든 힘 값은 단면 영역으로 정규화한 후 장력 값으로 변환할 수 있습니다. 근안 회 Ca2+-감도 및 길이 종속 활성화 프로토콜 외에 다른 테스트를 수행할 수 있습니다. 이러한 T활성,T패시브 (도 7)및 심근 세포 잔류력의 사코메 길이 종속성의 경우입니다. 잔류력 기록은 셀의 길이 변경 후 도달한 초기 힘 회수(pCa 4.5)로부터 계산됩니다(80%) 길이변경(11)전에 도달한 각 정상 상태 힘에 정규화. 잔류력의 증가는 일반적으로 느린 분리 운동과 더 높은 강성을 가진 교차 교량을 나타낸다.
마지막으로, 우리는 이 기술이 냉동 또는 갓 수집된 샘플에서 기계적으로 추출된 피부 심근세포에서 수행될 수 있을 뿐만 아니라 효소로 분리된 멤브레인의 투과화에서 수행될 수 있음을 강조해야 합니다. 심근세포가 분리되는 방식은 이 기술에서 파생된 결과에 크게 영향을 미칩니다. 도 8은 세 가지 격리 절차 중 관찰된 차이를 나타낸다.
그림 1: 테스트 장치의 통합 구성표입니다. 시험 장치는 현미경, 현미경 및 관련 컴퓨터를 포함한다. 그림의 바닥은 모터와 힘 트랜스듀서 사이에 접착된 피부 심근세포가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 세포 절연, 투과화 및 접착 프로토콜의 흐름 차트입니다. 왼쪽 상단 모서리 이미지는 페트리 접시에서 RELAX-ISO용액(A)에서심장 샘플의 조각을 보여주는 4개의 이미지로 구성되며,(B)조직의 기계적 균질화에 사용되는 튜브에서,(C)균질화 후 조직,(D)조직은 균질화 직후 및(E)트리톤 퍼메아빌화를 위한 튜브에 있을 때. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 피부심근세포의 길이와 사코프레 길이의 결정. 셀 길이 및 폭 측정≈2.2 μm.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 길이 종속 활성화 프로토콜(시험관내 프랭크 별별 메커니즘을 모방). 근안기밀라멘트의 Ca2+ 감도프로토콜(A,1.8 μm) 및 최대 2.2 μm(B)까지 심근세포를스트레칭한 후, 근안회에서 유래한 대표적인 힘 추적 및 파라미터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Myofilaments Ca2+-감도 프로토콜. 대표적인 힘 추적 및 파생 된 매개 변수. 단순성을 위해 8개의 힘 곡선 중 3개만 묘사됩니다. 즉 포화, 중급 및 가장 낮은 Ca2+함유 용액(각각 4.5, 5,6 및 6.0)으로 활성화된 심근세포입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 상이한 칼슘 솔루션과 각각의 ktr 핏 곡선에서 활성화된 마우스 심장 세포에서 대표적인 흔적. (A)pCa 4.5; (B)pCa 5.0; (C)pCa 5.2; (D)pCa 5.4; (E)pCa 5.6; (F)pCa 6.0 및 E 값은 총, 수동 및 활성 장력, ktr 값 및 rsquare용 ktr 핏용입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: T패시브(A) 및 T 활성(B)의 사코레 길이 종속성 프로토콜. 수동장력과 활성 장력은 1.8 μm에서 2.3 μm의 사코프레 길이로 단일 심근세포로 계산하였다.
그림 8: 신선("Fresh") 및 냉동 심근 샘플("냉동")과 트리톤("Collag+Triton")을 사용한 후방 투과성으로 콜라게나아제 소화 심장(수정된 랑겐도르프 기술)에서 기계적으로 분리된 심근세포에 대한 대표적인 결과. (A) 총 장력,(B)활성 장력 및(C)≈2.2 μm의 사코메르 길이에서 pCa 4.5 용액으로 활성화된 심근세포로부터의파시스프 장력 및 (F) pCa50 및(F)nHill에 대한 각각의 값. (G)잔류력 및(H)ktr 값은 최대 활성화 용액(pCa 4.5)으로 계산된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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| 에 저장 | 스톡 솔루션 | [M] | 최종 볼륨(mL) | 무게/볼륨 | 노트 |
| 4°C | 수산화 칼륨 (KOH) | 1 | 100 | 5.611 g | pH를 조정하려면 |
| 4°C | 수산화 칼륨 (KOH) | 5 | 50 | 14.03 g | pH를 조정하려면 |
| 4°C | Bes | 1 | 50 | 10.66 g | |
| 4°C | 프로피오닉산 | 1 | 100 | 7.483 mL | 5M 또는 1M KOH로 pH를 7.0으로 조정 |
| 4°C | 다음과 같은 것으로 구성된 CaEGTA: | 0.1 | 100 | 용액을 60°C로 1시간 이상 혼합하여 가열합니다. 1M KOH로 pH를 5-6으로 조정합니다. | |
| - 카코3 | 0.1 | 1.001 g | |||
| - 티트리플렉스 (EGTA) | 0.1 | 3.804 |
표 1: 재고 솔루션 준비 지침입니다.
| 릴렉스-ISO (심근세포 분리용) | [mM] | 무게 |
| 나2ATP | 5.95 | 3.28 g |
| MgCl2.6H2O | 6.04 | 1.23 g |
| 트리티플렉스 (EGTA) | 2 | 0.76 g |
| KCl | 139.6 | 10.41 g |
| 이미다졸 | 10 | 0.68 g |
표 2: Relax-ISO 솔루션 준비를 위한 지침입니다.
| 용액 활성화(측정용) | [mM] | 중량/볼륨 |
| 나2ATP | 5.97 | 0.823 g |
| MgCl 1M | 6.28 | 1.57 mL |
| 프로피오닉산 | 40.64 | 10.16 mL |
| Bes | 100 | 25 mL |
| CaEGTA (이전에 준비된 스톡 솔루션) | 7 | 17.5 mL |
| 나2PCr | 14.5 | 0.925 g |
표 3: 솔루션 준비 활성화 지침입니다.
| 편안한 솔루션(측정용) | [mM] | 중량/볼륨 |
| 나2ATP | 5.89 | 0.325 g |
| MgCl 1M | 6.48 | 0.65 mL |
| 프로피오닉산 | 40.76 | 4.08 mL |
| Bes | 100 | 10mL |
| 티트리플렉스 (EGTA) | 6.97 | 0.265 g |
| 나2PCr | 14.5 | 0.370 g |
표 4: 편안한 솔루션 준비 지침입니다.
| pCa = -Log [Ca2+] | 휴식 (pCa=9.0) Ml |
인티베이팅(pCa=4.5) Ml |
| 5 | 0.86 | 39.14 |
| 5.1 | 1.2 | 38.80 |
| 5.2 | 1.54 | 38.46 |
| 5.3 | 2 | 38.00 |
| 5.4 | 2.51 | 37.49 |
| 5.5 | 3.14 | 36.86 |
| 5.6 | 3.89 | 36.11 |
| 5.7 | 4.8 | 35.20 |
| 5.8 | 5.89 | 34.11 |
| 5.9 | 7.14 | 32.86 |
| 6 | 8.57 | 31.43 |
표 5: pCa 솔루션 준비 지침입니다.
| 매개 변수 | 설치류 | 돼지 | 인간의 |
| 액티브 텐션, kN.m-2 (2.2 μm) | 17 – 28 | 19 – 40 | 19 – 36 |
| 패시브 장력, kN.m-2 (2.2 μm에서) | 3.6 – 5.5 | 1.9 – 6.8 | 1.8 – 2.3 |
| pCa50 | 5.58 – 5.64 | 5.40 – 5.50 | 5.43 – 5.82 |
| n힐 | 2.60 – 2.76 | 2.95 – 3.36 | 2.99 – 3.10 |
| ktr, s-1 | 4.00 – 8.00 | 1.00 – 3.00 | 0.90 – 2.00 |
표 6: 설치류, 돼지 및 인간으로부터 단일 투과성 심근세포에서 파생된 일반적인 매개 변수 및 지수. 12에서적응 .
| 문제 | 가능한 이유 | 솔루션 |
| 최대 활성화 시 심근세포 분리 | 불충분 한 접착 시간; 접착제는 오래되어 건조되었습니다. | 접착 단계의 시간을 증가; 새로운 접착제 튜브를 여는 것을 고려하십시오. |
| 더 이상 제거할 수 없는 셀 서스펜션 솔루션에는 Triton® | 하나 또는 두 개의 추가 트리톤으로 추출 절차를 반복® 단계를 씻어 | |
| 심근세포는 통제 조건하에서 낮은 힘을 가지고 있습니다. | 추출이 잘못되어 저품질 셀을 전달했습니다. | 샘플 크기를 늘리고 새 추출을 수행합니다. 문제가 지속되는 경우 부적절한 샘플 수집 때문일 수 있습니다 - 이 샘플을 폐기합니다. |
| 셀은 눈에 띄게 수축하지만 힘이 기록되지 않습니다. 셀에는 비정상적인 힘 값이 있습니다. | 힘 변환기가 꺼져 있습니다. | 켜기 |
| 힘 변환기가 잘 보정되지 않음 | 알려진 가중치 집합을 사용하여 힘 변환기를 교정합니다(제조업체의 사용 설명서 확인). | |
| 힘 트랜스듀서 바늘이 느슨합니다. | 크리스탈 본드 509 또는 보석 상 왁스를 사용하여 다시 바늘을 붙입니다. | |
| 사리메트 길이를 결정하기에 충분하지 않은 트러리 패턴 | 불충분 한 빛 | 현미경 광을 증가하거나 커버 슬립으로 다시 세포를 이동하고 다시 sarcomere 길이를 평가 (우물은 낮은 빛 강도를 가지고) |
| 추출이 잘못되어 저품질 셀을 전달했습니다. | 샘플 크기를 늘리고 새 추출을 수행합니다. | |
| 바늘의 팁은 같은 평면에 없습니다 | 미세 조작기 사용, 집중 된 sarcomeres를 찾을 때까지 바늘의 팁을 위아래로 조정 | |
| 획득 시 길이 및/또는 힘 변형 없음 | 모터 또는 포스 트랜스듀서가 꺼져 있습니다. | 켜기 |
| 모터가 고장나셀 단축을 생성하지 않음 | 그것을 교체하거나 함수 생성기를 사용하여 보정하려고 | |
| 인수 녹음에 너무 많은 소음 | 장비 주위의 공기 흐름이 너무 많습니다. | 직접 공기 흐름으로부터 장비 보호 |
| 장비 주변의 진동이 너무 많습니다. | 안정화 테이블은 권장됩니다. 그럼에도 불구하고 압축기가 있거나 진동(냉동고, 냉장고)을 방출할 수 있는 장비를 제거하는 것이 좋습니다. | |
| Ca2+-감도 곡선에는 이상한 값이 있으며 [Ca2+]로힘 값이 증가하지 않습니다. | 활성화 및 이완 용액의 혼합물이 제대로 수행되지 않았습니다 (3.10 ~ 3.14 개의 방법 섹션, 혼합이 부족하여 확인하십시오). | 바이알을 동일한 농도로 해동하고, 동일한 비커로 모든 바이알의 함량을 수집하고, 교반기와 섞고 다시 나눕니다. 새로운 셀에서 이러한 솔루션을 다시 테스트합니다. 이 문제가 해결되면 Ca2+-포함 솔루션의 새 배치를 준비합니다. |
표 7: 문제 해결 테이블.
Discussion
피부 심근세포체를 사용하여 심장 기능의 체외 평가는 생리학적(예를 들어, 스트레치) 및 병리학적 문맥(예를 들어, 허혈)에서 심근세포 수준에서 발생하는 수정을 명확히 하는 중요한 기술을 나타냅니다. 이 방법론은 해동 된 샘플에서 얻은 심근세포에서 기능을 평가하기 위해 최소한의 심근을 요구하는 것과 같은 몇 가지 장점이 있습니다. 광범위한 종(마우스13,쥐1,14,15,토끼16,돼지17,개18,기니피그19 및 인간20)으로부터심근세포및 상이한 심장 위치를 사용하여 아리아, 좌우 심실 또는 경색 심장의 특정 부위를 포함한다. 또한 이 기술은 기본 구성에서 규제 및 수축 구조의 기능을 측정하는 동시에 Ca2+ 및 에너지(ATP)의 특정 농도를 제공할 수 있습니다.
이 기술의 단순성에도 불구하고 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 샘플 수집을 포함하여 처음부터 각 단계의 품질을 보장하는 것이 필수적입니다. 미오필라멘트 단백질은프로테아제(21)에취약하다. 따라서 수집 직후 액체 질소에 샘플을 보관해야 합니다. 이전에 동결되지 않은 신선한 샘플은 훨씬 더 높은 힘을 개발하므로 동일한 프로토콜에서 신선하고 냉동된 샘플에서 수행되는 측정을 혼합하는 것이 좋습니다. 두 번째로 가장 중요한 단계는 심근세포의 추출입니다. 이 절차 동안 대부분의 경우 얼음 샘플을 유지하는 것이 중요합니다. 프로테아제 억제제 칵테일은추출/투과화(22)동안 단백질 분해의 위험을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 셋째, 이 단계를 무시했을 때 품질 이내 세포가 감소했다고 지적했기 때문에 정확한 메스 움직임을 사용하여 샘플을 작은 조각으로 절단해야 합니다. 또 다른 중요한 단계는 트리톤을 씻어내고 (세포를 퍼미컬화하지만 그 접착을 촉진) 가능한 한 많은 세포를 유지하는 것 사이의 적절한 균형을 갖기 어렵기 때문에 심근세포를 세척하는 것입니다. 먼저 각 샘플, 종 또는 프로토콜에 대한 추출 및 세척 수를 시도하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 우리의 손에, 우리는 ZSF1 비만 쥐 조직 추출은 "지방" 양상을 가지고 있음을 지적, 접착제 동안 이러한 세포를 더 미끄러운 만든 하지만 측정하기 더 어렵지 않다. 우리가 이 문제를 우회하는 방법은 동물 당 세포의 합리적인 수를 가지고 더 많은 실험을 수행하여이었다. 또한, 접착제좋은 세포를 선택하는 것이 중요합니다, 즉 좋은 줄무늬와 합리적인 길이. 심근 세포에는 이러한 기능이 없는 경우 주로 바늘 끝에서 분리되거나 힘이 없음을 일으킵니다. 또한 세포를 바늘에 붙이는 접착제 의 시간과 효능을 고려하여 심근세포 부착에 올바른 접착제를 사용하는 것도 중요합니다. 우리의 손에, 실리콘 접착제(재료의 테이블)빠른 (10-15 분) 충분히 강한 치료. 마지막으로, 마지막 중요한 단계는 세포를 붙인 후 5 분 심근세포를 조심스럽게 들어 올리고 (커버 슬립에 세포를 붙이는 것을 피하기 위해) 우물로 이동하기 전에 (현미경 단계에 의해 끌리는 세포를 피하기 위해)와 관련이 있습니다. 표 7은 이 기술과 관련된 문제 해결, 그 근본 원인 및 빈번한 문제를 극복할 수 있는 가능한 해결 방법을 요약합니다.
이 방법의 주요 제한은 myofilaments활성화 /비활성화 얼마나 빨리 와 같은 myofilament 수축과 관련된 모든 질문에 대답 할 수 없다는 것입니다. 생체 내 설정에서 막 탈극성, 세포내 Ca2+ 증가 및 근안세포에 대한 확산은 심근세포가 수축하는 반면, 피부심근세포Ca2+ 확산에서 근막에 대한 확산은 세포가 Ca2+ 용액에 침수될 때 즉시 발생합니다. Ca2+ 확산의 이 빠른 속도는 근필라멘트 활성화/비활성화분석(23)을편향시킬 것이다.
이러한 실험은 온도, 용액 pH, 기계적 변속(느슨한 재스트레칭 대 느슨함) 및 세포 부착 절차(핀 넥타이 대 접착제)를 포함한 다양한 요인에 의해 영향을받습니다.
기술의 미래 진행은 투과성 심근세포보다는 그대로 기능적 연구를 수행하는 것을 포함한다. 이 기술은 심근세포가 갓 분리된 것에 의존하는 단점이 있습니다(이전에는 동결되지 않음). 이 방법론과 직접적인 관련이 없는 또 다른 중요한 문제는 샘플 냉동 저장의 최대 기간과 관련이 있는 데 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 구체적으로, 저장 시간 전반에 걸쳐 근안의 분해 정도를 확립하는 것이 필수적이다(즉, 추출된 심근세포로부터 파생된 양질의 기능데이터를 보장하기 위해 냉동 시료를 얼마나 오래 저장할 수 있는지).
Disclosures
저자는 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 과학 기술 (FCT), 유럽 연합( EU), 쿼드로 드 Referência 에스트라테기코 나시오날 (QREN), 푼도 유럽 유 데센볼비멘토 지역 (FEDER) 및 Programa Operacional Factores 드 Competitividade (경쟁) UnIC (UID / IC / 00051/ 2013) 연구 단위에 대한 포르투갈어 재단에 감사드립니다. 이 프로젝트는 경쟁 2020 - 프로비타 오페라 경쟁 E Internacionaléação (POCI), 프로젝트 DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003) 포르투갈 2020 파트너십 계약에 의해 지원 , 포르투갈 2020 파트너십을 통해 FEDER에 의해 지원됩니다 유럽 지역 개발 기금(ERDF)을 통해 리스본의 지역 운영 프로그램인 2020년 유럽 구조 및 투자 펀드가 지원하는 프로젝트 NETDIAMOND(POCI-01-0145-FEDER-016385)를 통해. Patrícia 로드리게스FCT (SFRH / BD / 96026/2013)에 의해 투자되었고 주앙 알메이다 - 코엘호는 유니버시다데 두 포르투 / FMUP 및 FSE - 펀도 사회 유럽u에 의해, NORTE 2020-Programa Operacional 지역 도 노르테, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma | 34580 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
| Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
| Imidazole | VWR | 24720.157 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
| N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
| Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
| Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
| Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
| Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
| Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
| Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
| Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
| Length Controller (Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
| Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
| Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
| Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
| Inverted Microscope (IX51) | Olympus |
References
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