Summary
本研究の目的は、翻訳動物モデルを用いて心臓動態を調べる方法を確立することにあった。記述された実験的アプローチは、孤立した無傷の豚の心臓モデルにおける電気的活動を評価するための電気生理学的研究と共に二重放出眼電図を組み込む。
Abstract
小動物モデルは、遺伝子組み換え種の入手可能性と大型動物に比べて低コストのために、心血管研究で最も一般的に使用されています。しかし、より大きな哺乳動物は、正常な心臓生理学、病態生理学、および治療薬の前臨床試験に関連する翻訳研究の質問に適しています。心臓研究でより大きな動物モデルを採用することに伴う技術的な障壁を克服するために、我々は、単離されたランゲンドルフ透過子豚心臓における生理学的パラメータを測定するアプローチを記述する。このアプローチは、2つの強力な実験ツールを組み合わせて心臓の状態を評価します:電気生理学(EP)研究とパラメータ感受性色素(RH237、Rhod2-AM)を使用した膜貫通電圧と細胞内カルシウムの同時光学マッピング。記載された方法論は、心臓伝導系、作用電位形態の変化、カルシウム処理、励起収縮カップリングおよび心臓オルタナンの発生率を調査する翻訳研究に適しています。不整脈。
Introduction
心血管疾患は、世界中の病気や死亡の主要な原因です。そのため、主な研究の焦点は、正常な心臓生理学とヒトの罹患率と死亡率に寄与する根本的なメカニズムを研究するために使用できる方法論を最適化することです。基本的な心血管研究は、伝統的にげっ歯類やウサギを含む小動物モデルに依存してきました1,2,3, 遺伝子組み換え種4,5の利用可能性のために ,低コスト、より小さな実験フットプリント、および高いスループット。しかし、豚モデルの使用は、より臨床的に関連するデータ6を提供する可能性を有する。実際、これまでの研究では、同様のイオン電流7、作用電位形状8、薬理検査9に対する応答を含む、ヒトとブタの間の心臓電気生理学(EP)の類似点が文書化されている。さらに、ブタの心臓は、げっ歯類またはウサギ10よりも人間に匹敵する収縮性および弛緩動力学を有する。イヌモデルと比較して、豚冠状解剖学は、より密接に人間の心臓11、12に似ており、心臓の発達、小児心臓学および/または先天性心不全に焦点を当てた研究のための選択のモデルである13. 豚とヒトの心臓8には違いがあるが、これらの類似点により、豚の心臓は心血管研究のための貴重なモデル14である。
心臓の逆行灌流は、オスカー・ランゲンドルフ16によって最初に確立されて以来、心臓ダイナミクスex vivo15を研究するための標準的なプロトコルとなっている。したがって、ランゲンドルフ灌流は、自律的影響がない場合に孤立した無傷の心臓を支えるために使用することができる。このモデルは健康な心臓および非健康な心臓間の心臓の電気生理学および収縮性を直接比較するための有用な用具である。心臓ダイナミクスは時間的にも空間的にも複雑であるため、1つの領域でわずかな変化が、心全体のシンシチウム17として働く能力に劇的に影響を与える可能性があります。従って、パラメータ感受性染料の高時空間イメージングは、心臓18、19の表面にわたって心臓機能を監視するのに有用なツールである。実際、電圧およびカルシウム感受性蛍光プローブの同時二重イメージングは、組織レベル20、21における電気活動、カルシウム処理および励起収縮結合の評価を可能にする。22、23、24、25、26、27、28。ランゲンドルフ灌流および/または光学マッピング技術は、以前に老化または遺伝的突然変異による心臓性能の低下を文書化し、薬理学的薬剤または環境暴露の安全性を評価するために使用されてきました29,30,31,32,33.
臨床現場では、侵襲的な心臓電気生理学研究は、心臓リズム障害の調査、病理の特定、および可能な治療オプションの特定によく用いられる。同様に、正静脈節の機能を評価し、房室伝導を測定し、心筋組織の屈折を同定するために使用できるEPプロトコルについて述べています。記載されたEP研究は、光学マッピング、または眼水検査34と組み合わせて行うことができ、孤立した心臓における心臓生理学を完全に特徴付けることができる。記載されたプロトコルでは、高時空間分解能蛍光イメージングを、二重発光セットアップにおいて電圧(RH237)およびカルシウム(Rhod-2AM)色素の組み合わせで行った。さらに、心臓電気生理学のパラメータは、誤体リズムの下で、およびプログラムされた電気刺激に応答して監視された。
Protocol
すべての実験は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイド(第8版)に従って行われました。これらの研究で使用されるすべての方法とプロトコルは、NIHが発表した実験動物のケアと使用のためのガイドラインに従って、小児病院の制度的動物ケアと使用プロトコル委員会によって承認されています。この研究で使用されるすべての動物は、実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠して人道的なケアを受けました。
1. 準備
- 6 L の修飾クレブス ヘンセロイト溶液16を調製する (mM: 118.0 NaCl, 3.3 KCl, 1.2 MgSO4, 24.0 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 10.0 グルコース, 2.0 ピルビン酸ナトリウム, 2% アルブミン, 2.0 CaCl2)実験の日にCaCl2を添加すると、時間が経つにつれて、リン酸塩の存在下で、塩化カルシウムはリン酸カルシウムとして溶液から末端に沈殿する。
- 滅菌濾過後にpHを7.4に調整します(細孔サイズ:0.22μm)。溶液の浸透性を調べて、275−310 mOsm/kgの範囲を確認してください。心臓が剥離した直後に使用するために氷の上で冷却する1 L。水浴中の3Lを約37°Cに温め、カルボゲンでバブリングする(95%O2、5%CO2)。
注:冷たい液体は溶解する気体の容量が増加しているので、温暖化は気泡と潜在的な塞栓症を最小限に抑えます。したがって、修正されたクレブス・ヘンセレitメディアが灌流システムを通過して暖かくなるにつれて、ガスは気泡として放出されます。 - 心プレジアの2 Lを調製する(修飾デルニド心プレギア溶液、表1)。500 mLビーカーを満たすために氷のキューブトレイに十分な心麻痺を凍結します。
- 循環水浴を42°Cに設定します。ポンプの電源を入れ、閉じた水性加熱ループで含まれる浸透剤を循環させます(材料の完全なリストについては、材料表および図1を参照)。
注:温水循環水浴は、水上ジャケットチューブと熱交換器を温めるために使用されます。 - システムを通して水中の普遍的な洗剤の1%の溶液の2 Lを実行することによってきれいな管回路およびチャンバー。精製水の>4 Lでランゲンドルフシステムのすべてのチューブ回路とチャンバーをすすいでください。すべての水がシステムから取り除かれるまでポンプを実行します。
- 灌流ポンプ(ポリプロピレンフィルター、細孔サイズ>5μm)に沿って合成膜フィルターを追加します。80 kPaで95%O2と5%CO2のマイクロファイバー酸素供給器(ヘモフィルター)をガス化します。
注:アルブミンを使用する場合、多くの場合、チューブ回路を介して酸素化および/またはポンプ活性に関連する凍結が起こり、凍結する。泡立て防止化合物(消泡Y30エマルジョン)を定期的に(〜30分毎)にドロップワイズ添加し、発生時にクエンチすることができます。 - 大小オラの上またはバブルトラップにある圧力センサーの2点キャリブレーション(0および60 mmHg)を確認します。必要に応じてキャリブレーションを行います。
- 心臓切除の直前に、ランゲンドルフループ灌流システムにメディアを注ぎます。排煙剤が酸素化された吸腐剤でガス化されたマイクロファイバー酸素供給器(ヘモフィルター)を通過し、熱交換器を通って大成で37°Cの媒体を吸い込む温度を維持します。
- 循環水浴を42°Cなど37°Cより数度高く設定し、交換時およびシステム全体の熱損失を考慮します。循環する浸透熱温度を熱電対で監視します。
2. 心臓切除とランゲンドルフ灌流
- ケタミン(20mg/kg)とキシラジン(2mg/kg)の筋肉内注射で豚を鎮静し、気管内チューブで挿管する。誘導のために、フェンタニル(50μg/kg)およびロクロニウム(1mg/kg)の静脈内(I.V.)ボーラス注射を投与する。吸入イソフルラン(0.5−3%)、フェンタニル(10−25μg/kg)、およびパンクロニウム(1 mg/kg)で麻酔を維持します。
注:この原理実証研究では、2.5−10.5kg体重と18−137gの体重から及ぶ若年ヨークシャー豚(14-42日齢、n =18)を使用した(図2)。誘導のための追加の注射が必要な場合は、ケタミン(10 mg/kg)を注入することができます。 - 動物が完全に麻酔され、応答しない場合は、上行大小耳と右心房を露出させるために立体切り術を行う。
- メスを使用して、胸部入口で胸骨の上部から中線切開を行い、xiphoidプロセスにダウンさせます。焼灼器(またははさみ)で、胸骨が見えるまで下層の脂肪と筋肉を解剖する。
- xiphoidプロセスから、外科的な骨はさみまたは骨のこぎりでマニュブリウムを通して胸骨の中間線を切断する。心臓を露出させるために切開部にレトラクターを挿入します。
- 18 G針と注射器を使用して右アトリアにヘパリン(300 U/kg)のボーラス用量を提供し、臓器切除時のブロット凝固を最小限に抑えます。心臓の周りに胸腔と氷の中に吸収性パッドを置きます。
- はさみで、周膜を慎重にスライスし、周囲の結合組織から鈍い解剖によって大動脈を分離し、大動脈のアーチの最初の動脈枝のすぐ下に大動脈をクランプする。18 G針で50 mLの注射器を使用し、上昇大小突の上部を通して氷冷心プレギア(20 mL/kg)を注入します。
- 心臓につながる血管を切り取り、上行大動脈をそのままにして心臓を取り除き、切除した心臓を氷冷心麻痺に突き刺す。
- 大胸の壁をヘモスタのペアでつかみ、心臓の上に吊り下げられた氷冷心プレギアメディアの1 Lにつながるチューブに取り付けられたリブ付きカニューレに滑り込みます(〜95cmは〜70mm Hgを提供します)。気泡が血管系に入るのを防ぐために、流体がオーバーフローするまで大腸に入って満たします。
注:機械的アンカプラー(2,3-ブタンジオンモノキシム[BDM]またはブレビスタチン)の使用は、組織の酸素要求が減少するにつれて冠状動脈灌流速度を低下させる。 - アンビリカルテープを使用して大腸をカニューレに固定し、さらにカニューレからぶら下がっている心臓の重みに合う止血を結んでアンカーします(図1C)。冷たい媒体が重力を介して70 mmHgの一定の圧力で心臓を逆行させる。温めた(37°)ランゲンドルフ灌流システム(<10分)に移す準備ができるまで、心臓を冷たい心拍痛に浸しておいてください。
注:小さい心臓の大小(<50 g、2週齢の豚まで)は心臓の重みを持ちますが、より大きな心臓はカニューレから滑り落ちる危険性があります。最初のカヌレーションの間、および暖かいシステムに移動するとき、空気が大動脈に入るのを防ぎ、冠状動脈塞栓症を引き起こす可能性があります。大きなボアチューブ(>3/8"内径)を使用して、大小田に入る溶液よりも気泡が速く上昇します。 - カニューレに空気を入れることなく、ランゲンドルフシステム(37°)に心臓を移します。正常な静脈のリズムが残りの血液および心プレギアの血管系を洗い流すことを可能にする。
注:記載された研究では、単離された若い子豚の心臓で184±17mL/分の平均初期流量が観察された。機械的アンカプラー(20 mM BDM)を含む加温された媒体を注入した後、流量は70±7.5 mL/min(平均±SEM)まで低下した。心臓組織は心臓イメージングに影響を与える可能性があるので、心臓組織を沈めないでください。組織温度は、げっ歯類と比較して、その大きな体積とより小さい表面積のために豚の心臓の冠状流れによって維持されます。フルフロー下では、表脈および内膜温度はそれぞれ35°Cから37°Cの範囲であった。
注意:機械的なアンカプラーを使用する場合は、アイウェアを含む適切な個人用保護具を着用してください。心臓は、迅速かつ予期せずメディアを排出することができます。 - 衝撃的な不整脈(心室頻脈、心室細動)の場合、心臓の頂点と基部に外部パドルを配置し、5 Jで単一のショックを送ることによって心臓を除細動し、5 J刻みで増加する(または選択可能な)除細動器)50 J、カーディオバージョン、または衝撃的でないリズムまで。必要に応じて50 Jで衝撃を繰り返します。
注:提示された研究では、製剤の89%が除細動を必要としました。平衡化後(〜10分)、若年子豚の心臓に対して平均心拍数70±4.5bpm(平均±SEM)が観察された(図2)。 - 再循環することなく、修飾されたクレブス・ヘンセレit媒体の少なくとも1Lで心臓を洗い流し、残りの血液および心プレジアを除去する。メディアが心臓を通して明確に実行されたら、循環ループを閉じて、パーフューサートを再循環させます。
3. 電気生理学研究
- 研究の過程を通して標準リードII心電図(ECG)を記録するには、29G針電極を頂点近くの心室表膜に取り付け、右心房に別の電極を付けます。差動バイオアンプの正と負の入力をそれぞれ頂点と右のアトリウムに接続します。
- 右心房に1つの双極刺激電極を取り付け、ペーシングのために両側左心室に第2の双極刺激電極を取り付ける。
- 電気生理学刺激装置を使用して心臓をペースし、初期電流を拡張期閾値(1−2mA)の2倍に設定し、1ミリ秒のパルス幅35、36に設定する。
注:刺激が応答を引き出さない場合、パルス幅は最大2msまで増加し得る。より多くの電流(〜10x)は、大きな同軸電極(双極刺激)で必要とされる。 - 一貫した刺激応答を確保するために、定義されたペーシングサイクル長さ(PCL)で一連の刺激インパルス(1-2 mA、1ミリ秒のパルス幅)を適用してペーシングしきい値を特定します。
注:固有のレートが確立されると、最初のインパルス列車はわずかに短いPCLで始まるかもしれません。 -
S1−S1またはS1−S2ペーシングトレインのいずれかを用いて余分な刺激ペーシングを行い、後者では6−8インパルス(S1)の列車に続いて単一インパルス(S2)を行った。キャプチャに失敗するまで、S2 PCL を段階的に 10 ミリ秒(200 ミリ秒、190 ミリ秒、180 ミリ秒など)減らします。究極のPCL(すなわち、190ミリ秒)にステップアップし、キャプチャの損失前に最も正確なPCLを見つけるために1ミリ秒間隔で減少します(すなわち、184ミリ秒)。
メモ:S1とS2(1-2 mA、1ミリ秒のパルス幅)に同じ刺激パラメータが使用されます。代表的な例については、または以前にブタ心臓の電気生理学測定37に関する値を公開した値を参照してください。- 心室有効耐火期間(VERP)を確立するには、横心室の刺激電極を使用して、S2(早期拍動)が心室脱分極を開始する最短のS1-S2間隔を特定します。
注:耐火期間は、最短達成可能なS1-S2カップリング間隔です。 - Wenckebachサイクル長(WBCL)を定義するには、右心房の刺激電極を使用して、通常の伝導経路を介して1:1の心室伝導が伝播する最短のS1-S1間隔を見つけます。
注:そうしないと、2度の心臓ブロックを表します。 - 正期節回復時間(SNRT)を定義するには、右心房の刺激電極を使用してペーシングトレイン(S1-S1)を適用し、ペーシングトレインの最後のインパルスと自発的な正心節媒介活性の回復との間の時間遅延を測定します。
- 房室ノード有効耐火期間(AVNERP)を確立するには、右心房の刺激電極を使用して、早期心房刺激の後にQRSを引き出すHisバンドル電位が続く最短のS1−S2結合間隔を見つける心室脱分極を意味する複合体。
- 心室有効耐火期間(VERP)を確立するには、横心室の刺激電極を使用して、S2(早期拍動)が心室脱分極を開始する最短のS1-S2間隔を特定します。
4. 膜貫通電圧と細胞内カルシウムの光学マッピング
注:機械的アンカプラーは、光マッピング中のモーションアーティファクトを最小限に抑え、低酸素3、38、39、40を避けるために使用する必要があります。(-/-)ブレビスタチン(5μM循環濃度)は、5mLのフルフスエート(最終濃度100x)41中で0.5mMのボーラス用量としてゆっくりと添加してもよい。あるいは、BDMは、最初は20mMの循環濃度で浸透性媒体に含まれていてもよい。
- RH237の5mgを無水DMSOの4mLに溶解して電圧色素を調製する。最大5mLのメディアと渦で色素アリコートを希釈します。RH237(500mLの食液量当たり62.1μg)を大動脈カニューレに近位にゆっくりと加えます。
注:心筋組織は、実験期間中、必要に応じてRH237で再染色され得る。 - 1mgのRhod2-AMを無水DMSOの1mLに溶解してカルシウム色素を調製する。50°Lのプルロン酸で染料を混ぜ、37°超音波浴中に10分間入れ、最大5mLの媒体で希釈します。カルシウム色素(500mLの浸透液)を大動脈カニューレに近位にゆっくりと加えます。
注:均一な染料染色を確保するために、染料をゆっくりと添加する必要があります(>30s)。Rhod-2AMはピーク蛍光に達するまでに最大10分かかりますが、RH237は1~2分以内に心臓を汚します。SNR 値は、SNR = (ピークからピーク数)/(拡張期間隔時の標準偏差)42として計算できます。 - 図 1に示すように、イメージング ハードウェア (カメラ、イメージ スプリッタ、レンズ) を配置して、適切な視野に焦点を当てます。
注:スプリッタは、RH237 を通過し、Rhod2 発光スペクトルを反映するダイクロイック ミラー(660+ nm)で構成されています。RH237(710 nmロングパス)およびRhod2(585±40nm)放出光(ロングパスET710、材料表を参照)には、高透過発光フィルタが使用されます。ワイド瞳50mm/F0.95lレンズを画像スプリッタの前面に取り付けます。この構成により、以前に検証された43,44に従って、十分な発光光分離が得られます。 - カメラをワークステーションに接続し、選択したソフトウェアを使用して画像を取得し、露出時間を 0.5 ~ 2 ミリ秒にします。ハイライトの不整列に加えて(「ソフトウェアのマテリアルの表」オプションを参照)。
- 周囲の照明からの蛍光干渉を最小限に抑えるために、室内のライトをオフにします。イメージング開始前にLEDライト(525 nm、1.4 mW/mm2)をテストし、センサーの深さによって決定される均一で最大の心筋照明を確保します。
注:各光は励起フィルタ(535±25 nm)を介して向けられる。LEDライトは、信号の直線性を最大化するために、撮影前に手動でトリガすることができます。表膜から放出された蛍光は、画像スプリッタおよび発光フィルタを通過する。スプリット画像は高速センサーに投影されます。視野は、レンズの選択と心臓からの距離に応じて、分割画像ごとに約12cm x 10cm、または5.9 cm x 4.7 cmです。 - 光マッピング研究では、正期リズム時の心筋、心室細動(図4)または動的ペーシング(S1−S1、1−2mA、1ミリ秒のパルス幅)を左心室に配置された刺激電極を介して画像化する(図5)。350 ミリ秒のペーシング サイクル長から開始し、10 ~ 50 ミリ秒ずつ減少して払戻曲線を生成する (図 5E)35,36.
5. クリーンアップ
- システムから心臓を取り除き、すべての排液を排出します。精製水でシステムチューブとチャンバーをすすいでください。
- 定期的なメンテナンスのために、必要に応じて、洗剤溶液または希釈過酸化水素溶液でシステムを定期的に洗い流します。
6. データ処理
- ビデオファイルを開き、対象地域を選択し、適切なソフトウェアパッケージまたはカスタムアルゴリズムを使用して時間の経過に伴う蛍光をプロットして、研究全体を通じて光信号の品質を確認します。
-
前述の23、33、43、45、46、活性化時間を含む作用電位およびカルシウム過渡時間パラメータを定量化するために、前に説明したように画像データを分析し、電圧-カルシウム結合時間(VmとCaの活性化時間の差)、および再分極持続時間の測定。
- しきい値を適用して蛍光心膜ピクセルを分離し、騒がしい背景データを破棄します。
注:しきい値を使用すると、大きな動画の分析が簡素化され、高速化されます。 - 図 4および図 5に示すように、3 mm x 3 mm から 5 mm x 5 mm の範囲のカーネル サイズを持つ心身表面積上の光信号を空間的にフィルタリングします。
注:後者は、作用電位特徴、カルシウム過渡形態、または波面19、47の全体的な輪郭を歪めることなくSNRを改善する。これは、大きなピクセルのセンサーを使用する場合や、取得中にビニングする場合は不要な場合があります。 - デジタルローパスフィルタ(例えば、5次バターワース)で信号を100~75Hzのカットオフ周波数で時間的にフィルタリングし、重要でない信号内容を排除する。
注:代表的な処理済みトレースの例については、図 5Cを参照してください。 - N 次多項式フィッティングを使用してドリフト除去と減算を適用し、光漂白、モーション、またはその他の重要な変動源の影響を最小限に抑えます。
- ビデオ全体にわたる光学データの処理と正規化の後、目的の作用電位とカルシウム過渡パラメータを計算します。脱分極時の最大誘導体の時間として定義された活性化時間を決定し、再分極化率と期間を計算するために蛍光ピーク(作用電位持続時間[APD]および[Ca2+]i持続時間[CaD])を参照図 5)。
- 時間パラメータを計算した後、カスタムアルゴリズム23、33を使用して、画像化された心筋表面全体にわたる単一の作用電位またはカルシウム過渡の側面を描写するアイソクロナルマップを生成します。43、45、46 .
注:例については、図 5Dを参照してください。
- しきい値を適用して蛍光心膜ピクセルを分離し、騒がしい背景データを破棄します。
Representative Results
図1Aは、チューブ回路、ポンプ、フィルタ、酸素測定器、貯蔵所および発熱体を含む単離された心臓灌流システムの図を示す。心電図(鉛II構成)とペーシング電極の配置を図1Bに示し、イメージング設定を図1Cに示す。光学部品と光路の概略を図1Dに示します。
実験的研究は、2.5−10.5 kg体重と18−137gの体重から及ぶサイズの若いヨークシャー豚(14−42日、n =18)から隔離された無傷の全心臓に対して行われた(図2A)。単離された心臓をランゲンドルフ系(37°)に移した後、心拍数は除細動の〜10分以内に70±4.5 bpm(平均±SEM)に安定化し、研究期間中一定であった(図2B)。平均流量184±17mL/min(平均±SEM)を測定し、機械的アンカプラーを含む加温媒体を用いて浸透させた後、70±7.5mL/分まで減速した(図2C)。
鉛II心電図は、静脈リズム(図3A)の間、または外部ペーシングに応答して、電気生理学的パラメータを定量するために研究の期間中に記録した。EPアセスメントでは、動的ペーシング(S1−S1)を右心房に適用してWBCLとSNRT(S1−S1開始後の回復時間、図3C)を特定し、ここでWBCLは心室伝導に対して心房を開始した最短のPCLとして示された。S1−S2ペーシングプロトコルは、心室脱分極を開始した最短の結合間隔を特定するために左心室のバイポーラ刺激電極を用いて実装され、それによってVERPを特定した(図3D)。または、図 3Eに示すように、S1-S2 アストリシンペーシング プロトコルがピンポイント AVNERP(S1-S2)に適用されます。豚心臓電気生理学パラメータの代表的な例は、以前に公開された37と密接に一致する。
オプティカルマッピング実験は、中腹リズム、自発的心室細動(図4)、または左心室(LV)の動的ペーシング中(S1-S1)の間に行われ、電気的およびカルシウムの戻り曲線を生成した。図 5.色素を装填した子豚の心臓の代表的な画像は、表心表面上の2つの領域から収集された対応する光学作用電位(Vm)とカルシウム(Ca)過渡(右心室[RV]=青、LV=赤)で図4に示されています。.未処理の信号は、静脈のリズムの間および心室細動の間に表示される。前述したように、動的心心ペーシング(S1−S1)は、本質的な心拍数のわずかな差を正規化するために光学マッピング実験中にも使用された(図5A-E)。生信号が表示されます(RV = 青、LV = 赤)、作用電位を表すために使用された- カルシウム過渡結合時間(図5C)、活性化および持続時間(図5D)、電気およびカルシウムの返還(図5E)。厚い心筋製剤の場合、カーネルサイズ〜3mm×3mmの空間フィルタリングは、心筋作用電位またはカルシウム過渡分析19、47に適している。したがって、高い空間解像度の画像(説明されている設定1240 x 1024の合計、またはチャンネルあたり620 x 512、6.5μmピクセルサイズ)は、多くの場合、取得後または後の間に空間的にビン分割されます(図5C)。画像処理を行うと、カスタムアルゴリズム23、33、43、45(図3D)を使用して、アクティベーションマップと再偏光マップを生成できます。心臓上の各画素は、作用電位またはカルシウム過渡性アップストロークの最大誘導体として定義された。
図 1: 実験的なセットアップ(A)孤立した心臓灌流系の図;矢印は流れの方向を示します。(B)カニューレされた心臓は電極配置で示される。RA=右心房、RV=右心室、LV=左心室、心電図=鉛II心電図。(C)心臓組織に近接するイメージングプラットフォーム。(D)各相補プローブ(電圧、カルシウム)の発光は、適切な発光フィルタとダイクロイックミラーを有する画像分割装置を用いて波長によって分離される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:心の重み、速度および流量測定。(A)研究で使用された各子豚の体重比に対する体重比(n=18)。(B)心拍数は除細動後約10分、研究終了時に再び測定した(約1時間)。(C) 冠状動脈の流れは、酸素需要の減少により機械的なアンカプラー(+BDM)で灌流した後に急激に低下する。スケールバーは平均± SEM を表します。
図3:中陰リズム中または外部ペーシングに応答して収集された鉛II心電図記録の代表的な例。(A) 正常な静脈のリズム。(B)サイクル長400ms(S1−S1)での心膜ペーシングの例は、撮像実験に用いた。(C) トップ: WBCL を識別するための心房ペース;成功した捕捉は、心室伝導に対する心房が観察されるS1=250msで観察される。心房ペーシングは、SNRT(外部ペーシングを発生させた後、誤審ノード放電までの時間)を決定するために使用することができることに注意してください。下: S1 サイクルの長さが 205 ミリ秒に減少すると、心室への伝導が失敗します。(D) 上: VERP を識別する心心ペーシング (S1-S2) ;正常なキャプチャはS1 = 450 ms、S2 = 300ミリ秒で観察される:S2サイクル長が250msに減少すると、心室組織は捕捉に失敗する。(E) アストリカルペーシング(S1-S2)を参照してAVNERPを識別します。上: 正常なキャプチャは S1 = 450 ms、S2 = 200 ミリ秒で観察されます。青い矢印はペーシングスパイクを示し、赤い矢印はキャプチャ('C')またはキャプチャなし('NC')を示します。S1-S1 = ダイナミック ペーシング、S1-S2 = 余分な刺激ペーシング。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:中腹リズムおよび心室細動時の光学データ左: 色素をロードした豚の心臓の代表的な画像 (Vm = 電圧, RH237;Ca =カルシウム、ロード2)、前景。静脈リズム中に豚の心臓から膜貫通電圧と細胞内カルシウム蛍光信号を空間的に濾過した(中央)。心室細動時の電圧とカルシウム信号(右)。赤と青の正方形として表される信号領域サイズ (15 x 15 ピクセル = 2.4 x2.4mm 2、30 x 30 = 4.8 x 4.8 mm2カーネル サイズ)。単位 = ΔF/F.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
図5:ランゲンドルフパーフューズドブタハートからの光学データ未加工の空間的に濾過された(A)膜貫通電圧および(B)頂点での電気ペーシング中の左右心室からの細胞内カルシウム蛍光信号。フィルタリングされていない空間的に平均化された信号は、対象領域からの光作用電位とカルシウム過渡を表します(信号単位はΔF/Fです)。(C) 正規化されたトランジェントのオーバーレイは、作用電位カルシウム過渡結合時間(75 Hzでフィルタリングされたローパス)を示す。(D)心膜表面を横切る信号を処理し、活性化時間(t作用)および80%再分極時間を含む時間パラメータのアイソクロナルマップを生成する。(E)統計的解析(右)を用いて複数の周波数(左)で生成された電気・カルシウム過渡返還曲線は、より遅いペーシングサイクル長での再分極時間の長さを示す。スケールバー = 平均 ± SEM.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 化学 | 式 | 分子量 | g/L |
| 塩化ナトリウム | 塩化 ナトリウム | 58.44 | 5.26 |
| グルコン酸ナトリウム | C6H11NaO7 | 218.14 | 5.02 |
| 三水和物ナトリウム | C2H3NaO2•3H2O | 136.08 | 3.68 |
| 塩化カリウム | Kcl | 74.55 | 0.63 |
| 塩化マグネシウム(無水) | MgCl2 | 95.21 | 0.1405 |
| 8.4% 重炭酸ナトリウム | ナフコ3 | 84.01 | 13 |
| マンニトール | C6H14O6 | 182.17 | 16.3 |
| 硫酸マグネシウム | MgSO4 | 120.37 | 4 |
| 博士 | 7.4 | ||
| オスモルリティ(モスモール/L) | 294 |
表1:変更デルニドの心プレギアレシピ。
Discussion
心血管研究モデルは細胞から生体内製剤まで多岐にわたるが、臨床的関連性と実験用有用性の間には固有のトレードオフがある。このスペクトルでは、孤立したランゲンドルフ浸透した心臓は、心臓生理学48を研究するのに有用な妥協点のままである。心臓全体モデルは、単一の細胞または組織単層よりも高いレベルの機能的および構造的統合を表すが、生体内モデルに関連する複雑さを回避する。二重光学マッピング実験における主な利点は、単離された心臓の心膜表面が観察され得ることを有し、膜貫通電位およびカルシウム処理の蛍光イメージングを心臓生理学34のモニタリングに使用することができる。
げっ歯類モデルは、より大きな動物とは対照的に孤立した心臓製剤に最も一般的に使用され、関連するすべての要素のアップサイジングの関連コスト(例えば、溶液量、灌流回路、染料の量および機械的アンカプラー)に関連するコストに起因する。大きな動物10、36、49における不整脈に対するより大きな不安定性および傾向と共に。豚の心臓を使用する利点の1つは、構造、サイズ、収縮率において人間の心臓によく似ているため、冠状動脈血流や心拍出量などの血行力学的パラメータをより正確にモデル化できることです。同様に、人間とブタは、同様のカルシウム処理、心電図間隔37、およびそれが12、50、51を表す基礎チャネルを含む作用電位形態を有する。 52.このプロトコルは、心筋機能を包括的に特徴付けるために再現可能な大型動物モデルを作成するためのステップを詳細に説明する。確立された電気生理学的プロトコルと組み合わせて使用される膜貫通電圧(RH237)と細胞内カルシウム(Rhod2)の同時イメージングは、変化した心臓を担当するメカニズムを特定する機会を提供します関数。記載された方法論は、前臨床安全性試験、毒性スクリーニングおよび遺伝的または他の疾患病理の調査に使用することができる。さらに、記載された方法論は、特定の研究焦点53、54、55に応じて、他の心臓モデル(例えば、イヌ、ヒト)との使用に合わせて改変および適合することができる。
より小さなげっ歯類モデルから、孤立した心臓全体の準備のためのより大きな豚モデルに移行する際に留意する重要な変更がいくつかあります。準備およびセットアップの間に、加血圧を維持し、浮腫(必要に応じて消泡剤)を減らすために、食素にアルブミンを加えることをお勧めします56,57,58,59.さらに、アルブミンを含む排腐剤はまた、媒体60、61に脂肪酸補充を必要とする代謝研究に役立つことができる。げっ歯類の心臓とは異なり、より大きな豚の心臓は、その表面対体積比が小さく、より良い温度を維持する冠状動脈血管を流れる暖かい媒体の量の増加のために暖かい媒体に沈める必要はありません。先に述べたように、温度プローブを右心室の内側と右心室の心膜表面に配置し、研究全体を通して3箇所すべてで1~2°Cのわずかな温度変動のみを観察しました。重要なことに、このようなより速い流量はまた、気泡と潜在的な塞栓症の可能性を高めることができます。この問題を回避するために、大きなボアチューブを備えたバブルトラップを使用して、大動脈カニューレにまっすぐ導くことをお勧めします。同様に、大小アタをより大きな(そして重い)心臓にカニューレするために2人の個体が連携して働くことは最も有用であることがわかりました。頑丈な止血で大腸を開いたままにする人と、臍テープを使用して大オラをカヌラに固定する人。記述された方法論では、心臓麻痺と除細動を伴う灌流は、げっ歯類の心臓製剤に反する心臓回復に不可欠であることがわかりました。私たちの経験では、少数の興奮した心臓だけが、心電化なしで正常な静脈駆動活動を再開しました。
光学イメージングエンドポイントを改善するために、吊り下げ心臓製剤は、水没した心臓で起こり得るグレアの効果を制限した。さらに、吊り下げ心臓はまた、垂直イメージングのために心臓を水平に置くときに起こり得る心臓の後部側面の冠状動脈血管の圧迫または妥協を避ける。また、バブルトラップ後に蛍光色素をロードすると(大動脈カニューレに近い)組織染色や光信号が大幅に改善されることがわかりました。最後に、心臓電気生理学エンドポイントを改善するために、より大きな同軸刺激電極の使用は、成功した心房ペーシングを容易にした。様々なEPパラメータの捕捉および捕捉の損失を同定するために心電図を使用するが、心内カテーテルまたはバイポーラ記録電極も使用することができる。
我々の研究は、孤立した無傷のブタ心臓モデルにおける二重光学マッピングおよび心臓電気生理学的評価のための方法論の開発に焦点を当てた。若年性ヒトの心臓との類似性のために、豚の心臓は小児心臓学または先天性心不全に焦点を当てた研究のための人気のあるモデルのままである。重要なことに、記述されたアプローチは、より大きな大人の心臓および/または異なる種の関心を持つ使用に適応することができる。実際、他の研究室は、イヌまたはヒトの心臓(ドナーまたは病気のいずれか)の使用が、その特定の研究焦点53、54、55に対してより適用可能であることがわかるかもしれない。この研究のもう一つの潜在的な制限は、イメージング中の動きのアーティファクトを減らすために機械的なアンカプラーを使用することです。ブレビスタチンは、心電図パラメータ、活性化および耐火期間41、62、63に対する最小限の影響による心臓イメージングアプリケーションにおける選択のアンカプラーとなっています。BDMは、より高価な選択であり、より大量の浸透量と機械的アンカプラーを必要とする大規模な動物研究では特に重要であるが、作用電位を変化させる可能性のあるカリウムおよびカルシウム電流に大きな影響を与することが知られている。形態学 64,65,66,67.BDMを使用する場合、APD短縮は衝撃誘発アリストミア68に対する心臓の脆弱性を増加させることに注意してください。逆に、ブレビスタチンを使用する主な制限は、その光感受性および光毒性であるが、これらの効果を減少させた代替製剤は69、70、71である。最後に、説明した方法論は、デュアル光マッピング実験のための単一のカメラシステムを利用していますが、心室細動および/または心膜表面全体の電気波の追跡に焦点を当てた研究研究が重要であることに注意することが重要です。他の15、19、72、73、74、75で説明されているように、このアプローチを変更して、3 次元パノラマ イメージングを含める必要があります。.
Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
著者たちは、マシュー・ケイ博士の有益な実験指導と、マネル・ラマダンとムハイミン・チャウドゥリーの技術支援を感謝の気持ちで認めている。この研究は、国立衛生研究所(R01HL139472からNGP、R01 HL139712からNI)、小児研究所、小児国立心臓研究所、シェイク・ザイード小児外科イノベーション研究所によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560-5MG | Mechanical Uncoupler |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753-100G | Mechanical Uncoupler |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
| Analog signal interface | emka Technologies | itf16USB | |
| Antifoam | Sigma-Aldrich | A5758-250ML | |
| Antifoam Y-30 Emulsion | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A5758 | |
| Aortic cannula, 5/16” | Cole-Parmer | 45509-60 | |
| Bubble trap | Sigma-Aldrich | CLS430641U-100EA | |
| CaCl2 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C77-500 | |
| Camera, sCMOS | Andor Technology | Zyla 4.2 PLUS | |
| Coaxial stimulation electrode (atria) | Harvard Apparatus | 73-0219 | |
| Defibrillator | Zoll | M Series | |
| Dichroic mirror | Chroma Technology | T660lpxrxt-UF2 | |
| Differential amplifier | Warner Instruments | DP-304A | |
| Emission filter, calcium | Chroma Technology | ET585/40m | |
| Emission filter, voltage | Chroma Technology | ET710lp | |
| EP stimulator (Bloom) | Fisher Medical | DTU-215B | |
| Excitation filter | Chroma Technology | CT510/60bp | |
| Excitation lights | Thorlabs | SOLIS-525C | |
| Filter | McMaster-Carr | 8147K52 | |
| Filter cartridge, polypropylene | Pentair | PD-5-934 | |
| Filter housing | McMaster-Carr | 9979T21 | |
| Flow transducer | Transonic | ME6PXN | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 158968 | |
| Heating coil | Radnoti | 158821 | |
| Hemofilter | Hemocor | HPH 400 | |
| Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501326 | |
| Image Splitter | Cairn Research | OptoSplit II | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P3911 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | 423-316 | |
| Large-bore tubing, I.D. 3/8” | Fisher Scientific | 14-169-7H | |
| Lens 50 mm, 0.95 f-stop | Navitar | DO-5095 | |
| Metamorph | Molecular Devices | Image Alignment | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M-7506 | |
| Mucasol detergent | Sigma-Aldrich | Z637181-2L | |
| Na Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P2256 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S-3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S-233 | |
| Needle Electrodes 29 G, 2 mm | AD Instruments Inc. | MLA1204 | |
| Noise eliminator | Quest Scientific | Humbug | |
| Perfusion pump | PolyStan | A/S 1481 | |
| Pressure transducer | World Precision Instruments | BLPR2 | |
| Reservoir, 2 L | Cole-Parmer | UX-34541-07 | |
| RH237 | AAT Bioquest Inc. | 21480 | |
| Rhod2-AM | AAT Bioquest Inc. | 21062 | |
| Stimulation electrode (ventricle) | Harvard Apparatus | 73-0160 | |
| Surgical Suture | McKesson Medical-Surgical | 890186 | |
| Transducer amplifier | World Precision Instruments | TBM4M | |
| Tubing flow console | Transonic | TS410 | |
| Umbilical tape | Jorvet | J0025UA | |
| Water bath/circulator | VWR | 89400-970 | |
| Surgical Tools | |||
| Bandage shears | Harvard Apparatus | 72-8448 | Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0 mm blade length, 17.0 cm |
| Electrocautery | Dalwha Corp. Ltd. | BA2ALD001 | Model: 200 Basic |
| Hemostat | Roboz | RS-7476 | St Vincent Tube Occluding Forceps |
| Hemostatic forceps | Harvard Apparatus | 72-8960 | Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm |
| Hemostats | Harvard Apparatus | 72-8985 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2 mm tip 14 cm |
| Mayo scissors | WPI | 501749 | 14.5 cm, Straight |
| Metzenbaum scissors | WPI | 501747 | 11.5 cm, Straight |
| Mosquito forceps | Harvard Apparatus | 72-8980 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2 mm tip width 12 cm |
| Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8828 | Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length |
| Pediatric cross clamp | Roboz | RS-7660 | Cooley-Derra Clamp 6.25" 5 mm Calibrations |
| Right angle forceps | WPI | 501240 | Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14 cm, Right Angle |
| Scalpel | Ted Pella | 549-4 | Scalpel Handle No. 4, 13.7 cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades |
| Scissors | Harvard Apparatus | 72-8380 | Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42 mm blade,12 cm |
| Straight Serrated forceps | WPI | 500363 | Dressing Forceps 15.5 cm |
| Towel clamp | WPI | 501700 | Backhaus Towel Clamp, 13 cm, Curved, Locking handle, SS |
| Weitlaner retractor | WPI | 501314 | Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2 cm, 2x 3 Sharp Prongs |
| Disposables | |||
| 3-0 prolene suture | Various vendors | Various vendors | |
| Vessel loop | Aspen surgical | 011001PBX | Sterion® Vessel Loop, 0.8 mm x 406 mm |
| Cardioplegia (Plegisol) | Pfizer | 00409-7969-05 | Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20 mL/kg |
| Heparin | Various vendors | Various vendors | 300 U/kg |
| Syringe and Needle | Various vendors | Various vendors | 60 mL & 18 G respectively |
| Umbilical tape | Ethicon | U12T |
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