Summary
Представленный протокол использует цитометрию потока для количественной оценки количества размножающихся и мертвых клеток в культивированных вратах мыши. Этот метод полезен для оценки влияния медикаментозного лечения на пролиферацию и выживание органов.
Abstract
Кишечный эпителий действует как барьер, который предотвращает проникновение в остальную часть тела содержимого светила, например патогенной микробиоты и токсинов. Функция эпителиального барьера требует целостности кишечных эпителиальных клеток. В то время как эпителиальная пролиферация клеток поддерживает непрерывный слой клеток, который образует барьер, эпителиальный ущерб приводит к барьерной дисфункции. В результате содержимое светильника может пересекать кишечный барьер неограниченным путем. Дисфункция кишечного барьера была связана со многими кишечными заболеваниями, такими как воспалительные заболевания кишечника. Изолированные мыши кишечные склепы могут быть культивированы и поддерживается как склеповидные структуры, которые называются кишечными органоидами или "энтероидами". Энтероиды идеально подходят для изучения пролиферации и клеточной смерти кишечных эпителиальных клеток in vitro. В этом протоколе мы описываем простой метод количественной оценки количества размножающихся и мертвых клеток в культивированных энтероидах. 5-этинил-2'-deoxyuridine (EdU) и пропидий йодид используются для обозначения размножающихся и мертвых клеток в энтероидах, а доля размножающихся и мертвых клеток затем анализируется цитометрией потока. Это полезный инструмент для проверки влияния медикаментозного лечения на пролиферацию эпителиальных клеток кишечника и выживание клеток.
Introduction
Фундаментальная функция кишечных эпителиальных клеток заключается в защите попадания содержимого светила, таких как патогенные бактерии и токсины1,2. Для выполнения такой функции, кишечные стволовые клетки непрерывно размножаться и дифференцироваться в различные эпителиальные клетки, в том числе энтероцитов и секреторных клеток, которые образуют барьер, образуя тесные соединения3. Быстрое обновление кишечных эпителиальных клеток требует строгой координации пролиферации клеток, дифференциации клеток и гибели клеток4,5. Снижение пролиферации клеток или чрезмерная гибель клеток приводит к эпителиальному повреждению и скомпрометированной функциибарьера1,6. Дисфункция кишечного барьера была связана с воспалительными заболеваниями кишечника7,8.
Ранее был разработан метод культуры кишечных склепов. Используя этот метод, изолированные мыши ные склепы растут в кишечные органоиды (enteroids), которые имеют crypt-villus как структуры и содержат все кишечной эпителиальной линии клеток9,10. 5-этинил-2'-deoxyuridine (EdU) является аналогом тимидина, который способен заменить тимин (T) в ДНК, которая проходит репликацию во время пролиферации клеток. Пролиферативные клетки могут быть быстро и точно помечены EdU окрашивания. Propidium iodide (PI) является аналогом бромида этидия, который высвобождает красную флуоресценцию при вставке в двухцепочечную ДНК. PI специально обнаруживает мертвые клетки, так как он проходит только через поврежденную мембрану клетки.
В этом протоколе мы сначала описываем, как изолировать склепы из тонкой кишки, а затем культивировать их как ветероиды in vitro. Затем мы описываем, как анализировать пролиферативные и мертвые клетки в enteroids EdU и PI включения и потока цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Кембриджского-Судаского геномного ресурсного центра (CAM-SU) при Университете Соохова.
1. Кишечная органоидная изоляция и культура
- Изоляция кишечных склепов и энтероидной культуры
- Эвтаназия 8-недельная мышь дикого типа с ингаляцией CO2. Используйте щипцы ткани и тонкие ножницы радужной оболочки, чтобы вскрыть примерно 8 см илеума.
- Промыть с помощью шприца с gavage кормления иглы около 40 мл ледяной Dulbecco в фосфат-буферный солей (DPBS), а затем вырезать вдоль с ножницами и открыть ileum.
- Разрежьте илеум на мелкие (0,5–1,0 см) кусочки. Поместите кусочки в 5 мл стерильных ледяных DPBS в 15 мл конической трубки, затем рок в течение 5 минут на льду.
- Используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать DPBS и заменить его 10 мл холодного буфера 1 (2 мМ EDTA в DPBS). Рок в течение 30 минут на льду.
- Используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать буфер 1 и заменить 10 мл холодного буфера 2 (54,9 мМ D-сорбитол, 43,4 мм сахарозы в DPBS). Встряхните вручную (80 коктейлей/мин).
- Возьмите 20 капель ногой буфера 2 содержимого после встряхивания и проинспектировать под микроскопом.
- Фильтр буфера 2 содержимое с 70 мкм стерильной ячейки ситечко, а затем собрать фильтрованный буфер с 50 мл конической трубки.
- Пипетка 20 л фильтрана на слайде, чтобы подсчитать склепы. Перенесите достаточный объем буфера 2 со шага 1.1.7, чтобы обеспечить наличие склепов/скважин ы 500 евро.
- Спин вниз на 150 х г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. После того, как спиннинг закончен, тщательно аспирируйте супернатант.
- Приостановить склепы в 50 qL подвала мембранной матрицы (например, Matrigel) на 500 склепов, пипетка вверх и вниз (будьте осторожны, чтобы избежать пузырьков), а затем поместить 50 л капли подвала мембраны матрицы / крипто смеси в центре одного колодца в 24 хорошо пластины. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах По Цельсию для полимеризации мембранной матрицы подвала.
- После 30 минут полимеризации, тщательно добавьте 600 л минигут-носителей (продвинутый dulbecco в модифицированных Eagle среды "DMEM"/F12, 2 мМ L-аланин-L-глутамамин, перо / стрептококк 100 единиц / мл, 10 мМ hepes, N2 дополнение «1:100», Дополнение B27 (1:50) с эпидермальным фактором роста (EGF; 50 нг/мл), Noggin «100 нг/мл», R-спондин (500 нг/мл) и Y27632 »10 м/м) в каждом колодце, затем верните пластину к каждому. Наблюдайте под микроскопом каждый день и меняйте носители каждые 2–3 дня.
- Энтероид проходив
ПРИМЕЧАНИЕ: Для длинных культур, enteroids должны быть разделены примерно каждую неделю.- Для прохождения входоидов поместите пластину культуры тканей на лед. Аспирировать средства массовой информации и добавить 1 мл холодного DPBS к каждой скважине. Используйте p1000 наконечник пипетка вверх и вниз, пока не твердых подвале мембраны матрицы куски остаются.
- Проходите вверх и вниз один раз через 1 мл инсулина шприц (27 G) и в 15 мл конической трубки. Спин вниз в течение 5 мин при 150 х г при 4 градусах По Цельсию.
- Используйте пипетку для удаления DPBS. Повторное в 50 зл ес подвальной мембранной матрицы/ хорошо.
- Поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы позволить мембранной матрице подвала полимеризоваться. Наложить каждую скважину с 600 мл носителей ENR (минигут-медиа, 50 нг/мЛ EGF, 100 нг/мл Ноггин, 500 нг/мл R-спондин), затем верните пластину в инкубатор.
2. Анализ цитометрии потока EdU-положительных клеток в Enteroids
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показан рабочий процесс для анализа цитометрии потока в энтероидах.
- Инкубация энтероидов с EdU
- Расти введите от шага 1.2.4 в течение 5-7 дней. Проход введите в новую 24 скважину пластины в разделении соотношение 1:2. Добавьте 600 л среды ENR к каждой скважине. Инкубировать ветроииды в течение 4-5 дней в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.
- Установите контрольную группу (необработанные ветероиды) и экспериментальную группу (энтероиды, обработанные 5 нг/мл интерлейкина 22 «IL-22»). Подготовьте по крайней мере три реплики для каждой группы.
- Добавьте EdU к среде ENR, чтобы подготовить среду EdU с концентрацией 50 мкм. Добавьте 600 кL среды EdU к каждой скважине и инкубировать в течение 2 ч в инкубаторе 37 градусов по Цельсию. Установите один колодец enteroids без лечения EdU в качестве отрицательного контроля для фонового вычитания.
- Сбор энтероидов из мембранной матрицы подвала
- Используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать среду EdU и мыть 1x с DPBS. Добавьте 1 мл DPBS.
- Используйте P1000 пипетка отзыв и пипетка вверх и вниз, пока не твердых подвале мембраны матрицы куски остаются. Перенесите на трубку 15 мл и вращайтесь при 300 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант.
- Добавьте 500 qL клеточных диссоциационных ферментов(Таблица Материалов)и инкубировать в течение 15 мин при 37 градусах Цельсия. Используйте P200 пипетка отзыв и пипетка вверх и вниз, чтобы сломать enteroids в одиночные клетки.
- Добавьте 3 мл среды DMEM, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и неоднократно пипетку с наконечником пипетки P1000.
- Спин вниз на 300 х г в течение 5 минут и аспирации супернатант среды. Приостанавливайте клетки с 1 мл DPBS.
- Фиксация и пермяки клеток
- Перенесите суспензию клетки в трубку 1,5 мл, снесите 300 х г в течение 5 минут и отбросьте супернатант.
- Resuspend клетки с 1 мл 4% параформальдегида (PFA), исправить в течение 15 минут при комнатной температуре (RT), и спина вниз на 300 х г в течение 5 минут.
- Resuspend клетки с 1 мл 0,5% неионический сурфактант. Инкубировать в течение 10 минут на RT.
- Спин вниз на 300 х г в течение 5 минут и аспирации супернатанта. Вымойте 1x с DPBS и спина вниз, чтобы удалить супернатант.
- Обнаружение EdU
- Подготовьте фондовые решения для каждого компонента заранее: 1) рабочее решение Alexa Fluor azide, 2) рабочее решение 1x EdU буферреакции, и 3) 10x стоковое решение буферной добавки EdU.
- Приготовьте буферную добавку 1x EdU, разбавив 10-x раствор 1:10 в деионизированной воде. Приготовьте это решение свежим.
- Подготовка реакции коктейль в соответствии с таблицей 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте ингредиенты в порядок, указанный в таблице. Используйте реакционный коктейль в течение 15 минут после приготовления. - Добавьте 100 юаней реакционных коктейлей к каждой трубке 1,5 мл. Приготовите клетки, защитите от света, инкубируют в течение 30 мин на РТ.
- Центрифуга при 300 х г в течение 5 минут и аспирируй раствор реакции с помощью наконечника пипетки мягко.
- Добавьте 0,5% неионического сурфактанта пенантанта к каждой трубке, чтобы вымыть 1x на RT. Центрифуга при 300 х г в течение 5 минут, аспирировать супернатант с кончиком пипетки мягко, и resuspend клетки в 1 мл DPBS.
- Анализ клеток по цитометрии потока
- Фильтр resuspended клетки с 40 мкм ситечко, а затем собирать фильтрованные клетки с 15 мл конической трубки. Выполните FACS на машине обнаружения как можно скорее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если условия ограничены, образцы окрашенных клеток должны храниться в темноте при 4 градусах Цельсия и проверять поток в течение 3 дней. - Выберите подходящий канал (в зависимости от типа азида Alexa Fluor в комплекте EdU; здесь, красный канал) и напряжение (здесь, 150-350 В) для анализа цитометрии потока.
- Стратегия Гатинга
- Нарисуйте fSC-A (x-оси) против псевдоцветного участка SSC-A (y-axis) и распределите большую часть ячеек в видимый диапазон точечной карты, регулируя напряжение. Выберите популяцию клеток (R1) и исключите мусор в левом нижнем углу.
- Из r1 ячейки населения, установить FSC-A (x-оси) против. FSC-H (y-axis) псевдоцвет участок, и установить ворота, чтобы выбрать одиночные ячейки (R2), чтобы исключить ячейки сгустки.
- Из R2 ячейки населения, установить интенсивность флуоресценции (x-оси) против. номер ячейки (y-оси) участок, и использовать отрицательный элемент управления, чтобы установить ворота. Область флуоресцентного сигнала является положительной клеточной областью (R3). Сравните соотношение EdU-положительных ячеек (R3) между экспериментальными и контрольными группами.
- Фильтр resuspended клетки с 40 мкм ситечко, а затем собирать фильтрованные клетки с 15 мл конической трубки. Выполните FACS на машине обнаружения как можно скорее.
3. Анализ цитометрии потока PI-положительных клеток в Enteroids
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показан рабочий процесс для анализа цитометрии потока PI-положительных клеток в ветроидах.
- Инкубация энтероидных клеток с Pi
- Расти введите от шага 1.2.4 в течение 5-7 дней. Проход введите в новую 24 скважину пластины в разделении соотношение 1:2. Добавьте 600 л среды ENR к каждой скважине. Инкубировать ветроииды в течение 4-5 дней в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.
- Установите контрольную группу (необработанную) и экспериментальную группу (IL-22 обработанный), используя по крайней мере три реплики для каждой группы.
- Добавьте PI в среду ENR для подготовки PI-среды с концентрацией 3 мкм.
- Добавьте 600 qL среднего PI к каждой скважине и инкубировать в течение 30 минут в инкубаторе 37 градусов по Цельсию. Установите один колодец enteroids без лечения Pi в качестве отрицательного контроля для фонового вычитания.
- Урожайные ветоиды из мембранной матрицы подвала следующие шаги 2.2.1-2.2.5.
- Анализ клеток по цитометрии потока
- Фильтр resuspended клетки с 40 мкм ситечко и собирать фильтрованные клетки с 15 мл конической трубки.
- Выполните FACS на машине обнаружения как можно скорее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если условия ограничены, образцы окрашенных клеток должны храниться в темноте при 4 градусах Цельсия и проверять поток в течение 3 дней. - Выберите подходящий канал (здесь, красный канал) и напряжение (здесь, 150-350 В) для анализа цитометрии потока.
- Используйте ту же стратегию gating, описанную в разделе 2.5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Небольшие кишечные склепы были изолированы и культивированы как enteroids в подвальной мембранной матрице. Энтероиды начали образовывать бутоны через 2 дня после изоляции. На 6-й день, enteroids было много почек с большим количеством мусора (мертвые клетки) в просвете. Enteroids были готовы к прохождению на данном этапе(рисунок 3).
Многочисленные исследования показали, что воспалительные цитокины имеют важное значение для поддержания кишечного эпителиального гомеостаза. Аномальное выражение воспалительных цитокинов тесно связано с возникновением воспалительных заболеваний кишечника11. Например, наше предыдущее исследование показало, что IL-22 способствует распространению транзитных усиливающих клеток, но и истощает Lgr5и стволовые клетки12.
Энтероиды лечились IL-22 в течение 3 дней, после чего синтетическая ДНК была помечена EdU для обозначения пролиферации клеток. Il-22-обработанные энтероиды отображали увеличенное число клеток EdU(Рисунок 4 A). IL-22 увеличил пролиферирующие клетки с 40,1% до 83,5%, как анализируется цитометрией потока(рисунок 4B). IL-22 лечение также увеличилось клеточной смерти в enteroids, указывается PI окрашивания(Рисунок 5A). IL-22 увеличило мертвые клетки от 4.9% до 16.2% как проанализировано цитометрией потока(рисунок 5B).
Рисунок 1: Диаграмма рабочего процесса для анализа цитометрии потока EdU-положительных клеток в enteroids. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Диаграмма рабочего процесса для анализа цитометрии потока PI-положительных клеток в enteroids. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Брайтфилд изображения enteroids на 2, 4, и 6 дней после криптоизоляции. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Ил-22 увеличивает пролиферацию ветероидов. (A) Enteroids были культивированы в среде без или с IL-22 (5 нг/мл) в течение 3 дней и инкубировали с EdU (красный) в течение 1 ч. Шкала бар 100 мкм. (B) Поток цитометрии данные из enteroids культивируется без (слева) или с (справа) IL-22. Данные представляют три отдельных эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Ил-22 способствует гибели клеток в ветероидах. (A) Enteroids были культивированы в среде без или с IL-22 (5 нг/мл) в течение 3 дней и окрашены пропидий йодид (красный). Шкала бар 100 мкм. (B) Поток цитометрии данные из enteroids культивируется без (слева) или с (справа) IL-22. Данные представляют три отдельных эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Компоненты реакции | Количество колодцев из 24 колодцев | |||||
| 1 | 2 | 5 | 10 | 20 | 50 | |
| Буфер реакции 1x | 86 Зл | 172 Лл | 430 л | 860 л | 1,72 л л. | 4,3 л л |
| CuSO4 | 4 л | 8 зл | 20 зл | 40 зл. | 80 зл | 200 зл. |
| Азид Алекса Флюор | 0,25 л л. | 0,5 л л | 1,25 л л. | 2,5 л л | 5 зл | 12,5 л |
| Реакция буферная добавка | 10 зл | 20 зл | 50 зл | 100 л | 200 зл. | 500 л |
| Общий объем | 100 л | 200 зл. | 500 л | 1 зл | 2 л | 5 зл |
| ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте ингредиенты в порядок, указанный в таблице. | ||||||
Таблица 1: Реакционный коктейль EdU.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол детализирует шаги, необходимые для культуры enteroids in vitro и количественной оценки EdU- и PI-положительных клеток в enteroids цитометрией потока. Есть несколько преимуществ этой стратегии. Во-первых, маркировка EdU используется для обнаружения размножающихся клеток в ветроидающих. По сравнению с традиционным исследующим выводом BrdU метод маркировки EdU быстрее, более чувствителен и точен. EdU очень похож на тимин (T), который заменяет тимин в синтезе ДНК во время деления клеток. По сравнению с антителами BrdU, EdU легче диффузно в клетку, и обнаружение EdU не требует денатурации ДНК и антиген-антитела реакции. Во-вторых, анализ цитометрии потока может быстро и точно количественно размножающихся (EdU)и мертвых (PI)клеток в enteroids.
Для успешного выполнения всей процедуры необходимо учитывать критические аспекты. Во-первых, важно, чтобы культура enteroids при достаточных условиях. Хорошо выращенные энтероиды должны иметь много бутонов, которые содержат пролиферативные клетки. Во-вторых, важно своевременно разделить ветериды. Мусор, накопленный в просвете, содержит мертвые клетки, которые могут быть окрашены Pi. Это вредно для следующего анализа цитометрии потока. В-третьих, из-за нескольких шагов (т.е. окрашивания клеток, фиксации клеток, разрыва мембраны и центрифугирования), клетки могут быть легко потеряны во время процедуры. Таким образом, важно собрать достаточное количество энтеридов. Важно, чтобы объединить 2'3 скважины (в 24 хорошо пластины) энтероидов до фиксации. Наконец, очень важно добавить ингредиенты в буфер для того, чтобы обнаружить EdU, в противном случае реакция не будет действовать оптимально.
Таким образом, протокол детали шаги для культивирования мыши enteroids в пробирке и количественной пролиферации и мертвых клеток по потоку цитометрии. Энтероиды являются полезными инструментами для моделирования заболеваний и открытия терапевтических препаратов. Этот протокол помогает исследовать влияния воспалительных цитокинов, патогенов, и снадобья на пролиферации клетки и выживании клетки в моделях культуры enteroid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (31971062, 31900326 и 31601022), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (BK20190043, BK20180838), Научно-исследовательским фондом Государственной ключевой лаборатории фармацевтической биотехнологии, Нанкинский университет (KF-GN-202004). Фонд естественных наук высших учебных заведений Китая Цзянсу (19KJB320003), программа обеспечения жизни и технологии города Сучжоу (SYS2019030) и Программа научно-исследовательской инновационной программы для выпускников колледжей провинции Цзянсу (KYCX19-1981) . Эта работа также поддерживается Тан ученый Университета Soochow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).
- Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
- Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
- Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).
