Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

जिलेटिन मेथक्रिलोइल हाइड्रोजेल आधारित बायोइंक्स के 3डी बायोप्रिंटिंग के प्रोटोकॉल

Published: December 21, 2019 doi: 10.3791/60545
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Fluid Power and Mechatronic Systems, School of Mechanical Engineering, Zhejiang University, 2Key Laboratory of 3D Printing Process and Equipment of Zhejiang Province, School of Mechanical Engineering, Zhejiang University, 3School of Mechanics and Safety Engineering, Zhengzhou University

Summary

यहां प्रस्तुत जिलेटिन मेथक्रिलोइल की 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए एक विधि है।

Abstract

जिलेटिन मेथक्रिलोइल (जेलमा) बायोप्रिंटिंग के क्षेत्र में एक लोकप्रिय जैव सामग्री बन गया है। इस सामग्री का व्युत्पन्न जिलेटिन है, जो स्तनपायी कोलेजन से हाइड्रोलाइज्ड होता है। इस प्रकार, आर्गिनाइन-ग्लाइसिन-एस्पार्टिक एसिड (आरजीडी) दृश्य और मैट्रिक्स मेटलोप्रोटीन (एमएमपी) के लक्षित रूपांकन आणविक श्रृंखलाओं पर रहते हैं, जो सेल लगाव और क्षरण को प्राप्त करने में मदद करते हैं। इसके अलावा, जेलमा के गठन गुण बहुमुखी हैं। मेथेक्रिलैमाइड समूह एक सामग्री को फोटोसर्जक की उपस्थिति में प्रकाश विकिरण के तहत तेजी से क्रॉसलिंक होने की अनुमति देते हैं। इसलिए, इस आशाजनक सामग्री के साथ त्रि-आयामी (3 डी) संरचनाओं के संश्लेषण के लिए उपयुक्त तरीके स्थापित करना बहुत समझ में आता है। हालांकि, इसकी कम चिपचिपाहट जेलमा की प्रिंटेबिलिटी को प्रतिबंधित करती है। यहां प्रस्तुत गेल्मा हाइड्रोगेल की 3 डी बायोप्रिंटिंग करने के तरीके हैं, अर्थात् जेल्मा माइक्रोस्फीयर, जेलमा फाइबर, जेलमा जटिल संरचनाओं और जेलमा आधारित माइक्रोफ्लूइडिक चिप्स का निर्माण। परिणामस्वरूप संरचनाओं और सामग्री की जैव अनुकूलता के साथ-साथ मुद्रण विधियों पर चर्चा की जाती है। यह माना जाता है कि यह प्रोटोकॉल पहले से लागू बायोमैटेरियल्स और जेलमा के बीच एक पुल के रूप में काम कर सकता है और साथ ही बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए जेलमा-आधारित 3 डी आर्किटेक्चर की स्थापना में योगदान दे सकता है।

Introduction

हाइड्रोगेल को बायोफैब्रिकेशन1,2,3,4के क्षेत्र में उपयुक्त सामग्री माना जाता है . उनमें से, जिलेटिन मेथक्रिलोइल (GelMA) सबसे बहुमुखी बायोमैटेरियल्स में से एक बन गया है, जो शुरू में वैन डेन बुलके एट अल5द्वारा 2000 में प्रस्तावित था। जेलमा को मेथ्क्रेलिक एंहाइड्राइड (एमए) के साथ जिलेटिन की सीधी प्रतिक्रिया से संश्लेषित किया जाता है। जिलेटिन, जो स्तनपायी कोलेजन द्वारा हाइड्रोलाइज किया जाता है, मैट्रिक्स मेटलोप्रोटीनेज (एमएमपी) के लक्ष्य रूपांकनों से बना है। इस प्रकार, जेलमा द्वारा स्थापित इन विट्रो त्रि-आयामी (3 डी) ऊतक मॉडल आदर्श रूप से वीवो में कोशिकाओं और एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के बीच बातचीत की नकल कर सकते हैं। इसके अलावा, आर्गिनाइन-ग्लाइसिन-एस्पार्टिक एसिड (आरजीडी) दृश्य, जो अल्गिनेट जैसे कुछ अन्य हाइड्रोगेल में अनुपस्थित हैं, जेलमा की आणविक श्रृंखलाओं पर रहते हैं। इससे हाइड्रोगेल नेटवर्क6के अंदर समझाया कोशिकाओं के लगाव को महसूस करना संभव हो जाता है । इसके अतिरिक्त, GelMA के गठन की क्षमता का वादा कर रहा है। जेलमा आणविक श्रृंखलाओं पर मेथेक्रिलामाइड समूह हल्के प्रतिक्रिया शर्तों के तहत फोटोसर्जक के साथ प्रतिक्रिया करते हैं और हल्के विकिरण के संपर्क में आने पर सहसंयोजक बांड बनाते हैं। इसलिए, मुद्रित संरचनाओं को सरल तरीके से डिजाइन किए गए आकारों को बनाए रखने के लिए तेजी से जोड़ा जा सकता है।

इन गुणों के आधार पर, क्षेत्रों की एक श्रृंखला ऊतक इंजीनियरिंग, बुनियादी साइटोलॉजी विश्लेषण, दवा स्क्रीनिंग और बायोसेंसिंग जैसे विभिन्न अनुप्रयोगों को पूरा करने के लिए जेलमा का उपयोग करती है। तदनुसार, विभिन्न निर्माण रणनीतियों को भीप्रदर्शितकिया गया है 7,8,9,10,11,12,13,14. हालांकि, जेलमा के आधार पर 3डी बायोप्रिंटिंग करना अभी भी चुनौतीपूर्ण है, जो इसके मौलिक गुणों के कारण है। जेलमा एक तापमान के प्रति संवेदनशील सामग्री है। मुद्रण प्रक्रिया के दौरान, बायोइंक की भौतिक स्थिति को बनाए रखने के लिए मुद्रण वातावरण के तापमान को सख्ती से नियंत्रित करना होगा। इसके अलावा, जेलमा की चिपचिपाहट आम तौर पर अन्य आम हाइड्रोगेल (यानी, अल्गिनेट, चिटोसन, हायलुरोनिक एसिड आदि) की तुलना में कम होती है। हालांकि, इस सामग्री15के साथ 3 डी आर्किटेक्चर का निर्माण करते समय अन्य बाधाओं का सामना करना पड़ता है।

यह लेख हमारी प्रयोगशाला द्वारा प्रस्तावित जेलमा के 3डी बायोप्रिंटिंग के लिए कई दृष्टिकोणों का सारांश देता है और मुद्रित नमूनों (यानी, गेल्मा माइक्रोस्फीयर, जेलमा फाइबर, जेलमा जटिल संरचनाओं और जेलमा-आधारित माइक्रोफ्लूइडिक चिप्स) का वर्णन करता है। प्रत्येक विधि में विशेष कार्य होते हैं और विभिन्न आवश्यकताओं के साथ विभिन्न स्थितियों में अपनाए जा सकते हैं। जेलमा माइक्रोस्फीयर एक इलेक्ट्रोअसिस्टेड मॉड्यूल द्वारा उत्पन्न होते हैं, जो बूंद आकार को सिकोड़ने के लिए अतिरिक्त बाहरी इलेक्ट्रिक फोर्स बनाता है। जेल्मा फाइबर के संदर्भ में, उन्हें चिपचिपा सोडियम एल्गिनेट की मदद से एक कोक्सियल बायोप्रिंटिंग नोजल द्वारा बाहर निकाला जाता है। इसके अलावा, जटिल 3 डी संरचनाओं की स्थापना डिजिटल लाइट प्रोसेसिंग (डीएलपी) बायोप्रिंटर के साथ हासिल की जाती है। अंत में, जेलमा हाइड्रोगेल और पारंपरिक माइक्रोफ्लूइडिक चिप्स के संयोजन से, जेलमा आधारित माइक्रोफ्लूइडिक चिप्स बनाने के लिए दो बार क्रॉसलिंकिंग रणनीति का प्रस्ताव है। यह माना जाता है कि यह प्रोटोकॉल हमारी प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली जेलमा बायोप्रिंटिंग रणनीतियों का एक महत्वपूर्ण सारांश है और सापेक्ष क्षेत्रों में अन्य शोधकर्ताओं को प्रेरित कर सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल पुलिया

  1. डुल्बेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) को तैयार करें, जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है, जो मानव स्तन कैंसर सेल (एमडीए-एमबी-231) लाइनों और मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल सेल (HUVEC) लाइनों को संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है।
  2. एल-ग्लूटामाइन (DMEM/F-12) के साथ DMEM तैयार करें, 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक, बोन मैरो मेसेंचिमल स्टेम सेल (बीएमएससी) लाइनों को संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जाता है ।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2के रूप में सत्कार वातावरण सेट करें । संस्कृति एमडीए-एमबी-231, एचयूवीईसी और बीएमएससी, और 90% संगम तक पहुंचने पर 1:2 अनुपात में कोशिकाओं को पारित करें।

2. जेलमा माइक्रोस्फीयर का निर्माण

  1. एक फ्यूज्ड डिपोजिशन मॉडलिंग (एफडीएम) प्रिंटर पर पॉलीलैक्टिक एसिड (पीएलए) के साथ चित्रा 1ए के रूप में स्थिरता प्रिंट करें। स्थिरता में दो धातु की अंगूठी इलेक्ट्रोड रखें।
  2. क्रमशः जमीन और सकारात्मक ध्रुवों के साथ दो धातु की अंगूठी इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें। रिंग इलेक्ट्रोड के नीचे हाई वोल्टेज से जुड़ी मेटल प्लेट रखें और मेटल प्लेट पर सिलिकॉन ऑयल के साथ पेट्री डिश को ड्रॉपलेट रिसीवर के तौर पर रखें ।
  3. फ्रीज-सूखे GelMA (5% w/v) और लिथियम फिनाइल-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP, ०.५% w/v) में Dulbecco के फॉस्फेट-बफर खारा (DPBS) बायोइंक (10 एमएल) के रूप में भंग । बंध्यता के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बायोइंक को फ़िल्टर करें और इसे 15 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 00
  4. 3 0.25% ट्राइप्सिन के 3 मिलीएल के साथ अलग एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं-0.02% EDTA समाधान 3 मिन के लिए 3 7 डिग्री सेल्सियस पर। एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिन के लिए 100 x ग्राम पर 15 मिलीग्राम अपकेंद्रित्र ट्यूब में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
  5. अधिस्थान निकालें। बुलबुले के उत्पादन को रोकने के लिए धीरे-धीरे इसे पाइपिंग करके तैयार बायोइंक के 1 मिलील के साथ सेल पैलेट मिलाएं।
  6. बायोइंक के 1 मिलीएल (एमडीए-एमबी-231) को 3 मिलीस बाँझ सिरिंज में रखें। संकुचित हवा (~ 0.5 केपीए) के बल से बायोइंक खिलाएं। स्थिरता पर सिरिंज रखो।
    नोट: मुद्रण वातावरण को 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 50% की आर्द्रता पर सख्ती से नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  7. हाई वोल्टेज पावर को स्विच करें और 0−4 केवी के रूप में वोल्टेज सेट करें। इसके साथ ही, सिलिकॉन तेल के 5 मिलील में जेलमा बूंदों को क्रॉसलिंक करने के लिए 405 एनएम तरंगदैर्ध्य प्रकाश को चालू करें।
  8. पेट्री डिश को डिकेंट करके सिलिकॉन ऑयल का ज्यादातर हिस्सा दूर डालें । एक चम्मच का उपयोग करके बने सिलिकॉन तेल और जेलमा माइक्रोस्फीयर को 15 मिलीआर सेंट्रलाइज्ड ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  9. डीपीबीएस के 5 mL जोड़ें और मिश्रण समान रूप से हिला। 5 मिन के लिए 100 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित करें और सुपरनेटेंट तरल पदार्थ को हटा दें।
  10. दोहराएं चरण 2.9 3x।
  11. एक चम्मच के साथ जेलमा माइक्रोस्फीयर लें और उन्हें डीएमईएम में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 में 3 दिनों के लिए पेट्री डिश में संस्कृति करें।
  12. माध्यम को त्यागें और माइक्रोस्फीयर को डीपीबीएस से धोलें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 न्यूनतम के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 2 mL के साथ फिक्स करें।
  13. पीएफए को त्यागें और माइक्रोस्फीयर को डीपीबीएस से धोलें। आरटी में 5 मिन के लिए 0.5% nonionic surfactant (यानी, ट्राइटन एक्स-100) के 2 mL के साथ Permeabilize।
  14. एनप्याजिक सर्फेक्टेंट को त्यागें और माइक्रोस्फीयर को डीपीबीएस से धोलें। उन्हें आरटी में अंधेरे में 30 मिन के लिए tetramethylrhodamine (TRITC) phalloidin के 2 mL के साथ दाग ।
  15. ट्राईटीसी को त्यागें और माइक्रोस्फीयर को डीपीबीएस से धोएं। उन्हें आरटी में अंधेरे में 10 मिन के लिए 4-,6-डिमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (DAPI) के 2 mL के साथ दाग।
  16. डीएपीआई को त्यागें और माइक्रोस्फीयर को डीपीबीएस से धोएं। एक कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ आकृति विज्ञान पर कब्जा।

3. जेल्मा फाइबर का निर्माण

  1. एक सहसिक नोजल तैयार करें जैसा कि चित्रा 2एमें दिखाया गया है। टांका के साथ एक आंतरिक नोजल (25 जी, ओडी = 510 माइक्रोन, आईडी = 250 माइक्रोन) और बाहरी नोजल (18 जी, ओडी = 1200 माइक्रोन, आईडी = 900 माइक्रोन) को ठीक करें। एक ग्लास ट्यूब (लंबाई = 50 मिमी, व्यास = 1.2 मिमी के अंदर) को कॉक्सिअल नोजल के अंत तक कनेक्ट करें।
  2. सोडियम एल्गिनेट (ना-एएलजी) पाउडर को भंग करें जो पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत 2% (w/v) पर deionized पानी में 30 min के लिए निष्फल है।
  3. चरण 2.3 के बाद एक बाँझ बायोइंक समाधान तैयार करें। 15 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में गेल्मा बायोइंक और ना-एएलजी समाधान को गर्म करें।
  4. 3 0.25% ट्रिप्सिन-0.02% ईटीए समाधान के 3 एमएल के साथ 3 07 डिग्री सेल्सियस पर अलग बीएमएससी कोशिकाओं। एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिन के लिए 100 x ग्राम पर 15 मिलीग्राम अपकेंद्रित्र ट्यूब में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
  5. अधिनेता तरल पदार्थ निकालें। बुलबुले के उत्पादन को रोकने के लिए धीरे-धीरे इसे पाइपकर तैयार जेल्मा बायोइंक के 2 मिलील के साथ सेल पैलेट मिलाएं।
  6. बायोइंक (बीएमएससी) के 2 मिलीएल को 10 मिलीएल सिरिंज में रखें। एनए-एएलजी समाधान के 2 मिलील को एक और सिरिंज (10 मिली) में रखें। उन्हें क्रमशः दो सिरिंज पंपों के साथ खिलाएं (यहां, बायोइंक ५० μm/min और Na-Alg समाधान पर ३५० μm/min पर) ।
    नोट: मुद्रण वातावरण को 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 50% की आर्द्रता पर सख्ती से नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  7. जेलमा फाइबर को क्रॉसलिंक करने के लिए पारदर्शी ट्यूब को विकिरणित करने के लिए 405 एनएम तरंगदैर्ध्य प्रकाश को चालू करें। फाइबर प्राप्त करने के लिए डीपीबीएस के साथ पेट्री डिश का उपयोग करें।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2में तैयार डीएमईएम/एफ-12 में 3 दिनों के लिए डीपीबीएस से एक चम्मच के साथ जेलमा फाइबर निकालें और उन्हें संस्कृति दें।
  9. एक कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ रूपात्मक अवलोकन के लिए जेलमा फाइबर तैयार करने के लिए चरण2.12−2.16 का पालन करें।

4. जटिल 3 डी जेल्मा संरचनाओं का निर्माण

नोट: चित्रा 3ए जटिल 3 डी जेल्मा संरचनाओं के निर्माण स्केच दिखाता है।

  1. 75% अल्कोहल के साथ डीएलपी बायोप्रिंटर(चित्रा 3ई)को मिटा दें और इसे बंध्याकरण के लिए 30 मिन के लिए यूवी विकिरण को बेनकाब करें।
  2. डीपीबीएस में फ्रीज-सूखे जेलमा (10% w/v) और LAP (०.५% w/v) को भंग करें । प्रिंटिंग सटीकता में सुधार करने के लिए समाधान (3% v/v) में मजेंटा खाद्य वर्णक जोड़ें।
  3. बंध्यता के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें और इसे 15 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000
  4. कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर के साथ 3डी मॉडल बनाएं। मॉडल दस्तावेजों को लागू डीएलपी बायोप्रिंटर के ऊपरी सॉफ्टवेयर (ईएफएल) में आयात करें।
  5. डीएलपी बायोप्रिंटर के गर्त में तैयार बायोइंक के 10 mL जोड़ें।
  6. ऊपरी सॉफ्टवेयर में मुद्रण मापदंडों को इस प्रकार सेट करें: प्रकाश तीव्रता = 12 mW/सेमी2,विकिरण अवधि = 30 एस, और स्लाइस ऊंचाई = 100 माइक्रोन। प्रिंटिंग शुरू करें।
  7. बायोप्रिंटर से मुद्रित संरचना को हटा दें और इसे पेट्री डिश में डीपीबीएस में विसर्जित करें।
  8. 3 मिन के लिए एमडीए-एमबी-231एस सेल को 3 मिलीएल 0.25% ट्राइप्सिन-0.02% ईटीए सॉल्यूशन के साथ 3 7 डिग्री सेल्सियस पर अलग करें। सेल पैलेट प्राप्त करने के लिए 15 मिलीग्राम ट्यूब में 5 मिन के लिए 100 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं।
  9. अलौकिक तरल पदार्थ निकालें और डीएमईएम के 2 मिलील के साथ सेल पैलेट मिलाएं।
  10. मुद्रित संरचनाओं पर सेल निलंबन के 100 माइक्रोन जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर तैयार डीएमईएम में 3 दिनों के लिए उन्हें संस्कृति ।
  11. कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ रूपात्मक अवलोकन के लिए जटिल 3 डी संरचनाओं को तैयार करने के लिए चरण2.12−2.16 का पालन करें।

5. जेलमा आधारित माइक्रोफ्लूइडिक चिप्स का निर्माण

नोट: चित्रा 4ए GelMA आधारित माइक्रोफ्लूइडिक चिप के निर्माण स्केच से पता चलता है ।

  1. डीपीबीएस में फ्रीज-सूखे जेलमा 10% (w/v) और LAP (०.५% w/v) को भंग करें । नसबंदी के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से जेल्मा समाधान फ़िल्टर करें।
  2. 30 मिन के लिए यूवी लाइट के तहत जिलेटिन पाउडर को स्टरलाइज करें और इसे चरण 5.1 में तैयार गेल्मा-लैप समाधान में 5% (w/v) के जिलेटिन की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। इस मिश्रण को 15 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म करें।
  3. सीएडी सॉफ्टवेयर के साथ मोल्ड(चित्रा 4बी, सी)के एक समूह को डिजाइन करें और उन्हें डीएलपी प्रिंटर पर फोटोपॉलिमर रेसिन के साथ निर्माण करें।
  4. तैयार बायोइंक के साथ पूरी तरह से मोल्डभरें।
  5. 30 मिन के लिए जिलेटिन को क्रॉसलिंक करने के लिए मोल्ड्स को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रखें।
  6. मोल्डों से आंशिक रूप से (शारीरिक रूप से) क्रॉसलिंक हाइड्रोजेल शीट के साथ मोल्ड और डिमोल्ड निकालें।
  7. दो डिमोल्डेड हाइड्रोजेल शीट को मिलाएं और उन्हें 1 मिन के लिए 405 एनएम पर विकिरणित करके जेलमा की मदद से बांधें।
  8. 3 0.25% ट्राइप्सिन के 3 मिलीएल के साथ HUVECs कोशिकाओं को अलग करें- 0.02% ईटीए समाधान 3 मिन के लिए 3 7 डिग्री सेल्सियस पर। 5 मिन के लिए 100 x ग्राम पर एक सेल पैलेट प्राप्त करने के लिए 15 मिलीग्राम अपकेंद्रित्र ट्यूब में अपकेंद्रित्र कोशिकाएं।
  9. अलौकिक तरल पदार्थ निकालें और डीएमईएम के 2 मिलील के साथ सेल पैलेट मिलाएं।
  10. नोजल और सिरिंज के साथ सेल सस्पेंशन इंजेक्शन लगाकर माइक्रोचैनल को पूरी तरह भरें।
  11. वर्दी और पूर्ण सेल सीडिंग प्राप्त करने के लिए अगले 3 घंटे के दौरान हर 15 मिन को उल्टा चिप को उल्टा करें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर तैयार डीएमईएम में 3 दिनों के लिए पेट्री डिश में चिप्स संस्कृति ।
  12. कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ मॉर्फोलॉजिकल ऑब्जर्वेशन के लिए माइक्रोफ्लूइडिक चिप्स तैयार करने के लिए 2.12−2.16 चरणों का पालन करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

जेलमा माइक्रोस्फीयर के निर्माण के दौरान, जेल्मा बूंदों को बाहरी इलेक्ट्रिक फील्ड फोर्स द्वारा अलग किया गया था। जब बूंदों प्राप्त सिलिकॉन तेल में गिर गया, वे पूंछ के बिना मानक गोलाकार आकार बने रहे । इसका कारण यह है कि GelMA बूंदों एक जलीय चरण में थे, जबकि सिलिकॉन तेल एक तेल चरण में था । दो चरणों के बीच बनने वाले सतह तनाव के कारण गेल्मा बूंदों ने एक मानक स्फेरॉइड आकार बनाए रखा। सेल से लदे माइक्रोस्फीयर के संदर्भ में, कोशिकाओं ने इस प्रक्रिया में उच्च वोल्टेज इलेक्ट्रिक फील्ड फोर्स का अनुभव किया। दाग एमडीए-एमबी-231s(चित्रा 1बी-ई)की आकृति विज्ञान से यह पाया गया कि समझाया एमडीए-एमबी-231s अपनी प्रसार क्षमता बनाए रखा, इस इलेक्ट्रोअसिस्टेड फैब्रिकेशन विधि की जैव अनुकूलता की पुष्टि ।

जेल्मा फाइबर के संदर्भ में, जेलमा और सोडियम एल्गिनेट समाधान क्रमशः कोक्सियल नोजल के आंतरिक और बाहरी नोजल में प्रवाहित होता है। चूंकि सोडियम एल्गिनेट में गेलमा की तुलना में अधिक चिपचिपाहट थी, इसलिए गेलमा को सोडियम एल्गिनेट समाधान में प्रतिबंधित किया गया था और एक लाइन आकार बनाए रखा गया था। प्रकाश (405 एनएम तरंगदैर्ध्य) द्वारा विकिरण के कारण आंतरिक जेलमा क्रॉसलिंक हो गया, जो गेलमा फाइबर(चित्रा 2बी)बनाता है। इसके अलावा, बीएमसीसी को गेल्मा फाइबर(चित्रा 2सी, डी)में समझाया गया था। जैसा कि दिखाया गया है, समझाया बीएमएससी ने निर्माण प्रक्रिया(चित्रा 2ई)के बाद जेलमा हाइड्रोजेल नेटवर्क में फैलने की क्षमता बनाए रखी।

अधिक जटिल आकार के साथ GelMA संरचनाओं को बनाने के लिए एक डीएलपी बायोप्रिंटर चुना गया था। जैसा कि चित्रा 3बी-डीमें दिखाया गया है, "नाक", "कान", और "मल्टीचैंबर" की संरचनाएं स्थापित की गई थीं। क्रॉसलिंक्ड जेल्मा संरचनाओं की सतह पर, जेल्मा सामग्री और प्रसार(चित्रा 3एफ)से जुड़ी वरीयता प्राप्त एचयूवीईसी। इसने इस संभावना का प्रदर्शन किया कि डीएलपी बायोप्रिंटर की मदद से जेल्मा कॉम्प्लेक्स 3डी संरचनाओं की स्थापना ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में अनुप्रयोगों में काफी संभावना रखती है।

पारंपरिक माइक्रोफ्लूइडिक चिप के विपरीत जो बायोडिग्रेडेशन गुणों के बिना सामग्रियों पर आधारित है16,17,18,20 (यानी, राल, ग्लास, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन [पीडीएम], और पॉलीमेथिल मेथक्रिलेट [पीएमएमए]), एक जेलमा आधारित माइक्रोफ्लूइड चिप को दो बार क्रॉस-लिंकिंग रणनीति का उपयोग करके यहां गढ़ा गया था। बायोइंक में दो घटकों को क्रमिक रूप से पार किया गया । विभिन्न माइक्रोचैनलों के साथ चिप्स मांग पर विभिन्न मोल्डडिजाइन द्वारा बनाया गया था(चित्रा 4बी, सी)। इसके अलावा, यह सत्यापित किया गया था कि HUVECs चैनलों में वरीयता प्राप्त थे और चैनल की दीवार से जुड़े थे, स्थूल पोत आकार(चित्रा 4डी, ई)बनाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: जेलमा माइक्रोस्फीयर। (A)गेल्मा माइक्रोस्फीयर का फैब्रिकेशन स्केच। (ख)गेल्मा माइक्रोस्फीयर की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि। (ग)जेलमा में एमडीए-एमबी-231s की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि । (D)समझाया एमडीए-एमबी-231s के एफ-ऐक्टिन और नाभिक का 2D व्यू । (ई)समझाया एमडीए-एमबी-231s के एफ-ऐक्टिन और नाभिक का 3डी व्यू । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जेलमा फाइबर। (ए)जेल्मा फाइबर का फैब्रिकेशन स्केच। (ख)जेल्मा फाइबर (नीली स्याही के साथ) की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि। (ग)जेल्मा फाइबर (हरे फ्लोरेसेंस कणों के साथ) की कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप छवि। (D)गेल्मा फाइबर में बीएमएससी की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि। }एनकैप्ड बीएमएससी के एफ-ऐक्टिन और नाभिक । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: जेल्मा कॉम्प्लेक्स 3डी संरचनाएं। (A)जटिल जेल्मा 3 डी संरचनाओं का निर्माण स्केच। (ख)गेल्मा "नाक" की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि। (ग)गेल्मा "कान" की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि। (D)जेलमा "मल्टीचैंबर" की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि। (ई)लागू डीएलपी बायोप्रिंटर। }वरीयता प्राप्त एमडीए-एमबी-231s के एफ-ऐक्टिन और नाभिक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: GelMA आधारित माइक्रोफ्लूइडिक चिप । (A)जेलमा आधारित माइक्रोफ्लूइडिक चिप का फैब्रिकेशन स्केच । (B,C) जेलमा आधारित माइक्रोफ्लूइडिक चिप की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवियां। (घ)चैनल की दीवार पर वरीयता प्राप्त HUVECs की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि । (ई)चैनल की दीवार पर वरीयता प्राप्त एचयूवीईसी का एफ-ऐक्टिन और नाभिक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह लेख GelMA 3D संरचनाओं, नामत GelMA माइक्रोस्फीयर, GelMA फाइबर, GelMA जटिल संरचनाओं, और GelMA आधारित माइक्रोफ्लूइडिक चिप्स बनाने के लिए कई रणनीतियों का वर्णन करता है । GelMA में जैव अनुकूलता और गठन क्षमता का वादा किया गया है और जैव निर्माण के क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। सूक्ष्ममंडल संरचनाएं नियंत्रित दवा रिलीज, ऊतक की संरचना और जीवोंमें इंजेक्शन के लिए उपयुक्त हैं । क्योंकि जेल्मा समाधान की चिपचिपाहट कम है, इसका गठन चुनौतीपूर्ण है। इस प्रकार, गेल्मा माइक्रोस्फीयर के निर्माण के दौरान, इस समस्या को हल करने के लिए इलेक्ट्रोहाइड्रोडायनामिक (ईएचडी) सिद्धांत चुना गया था। लागू वोल्टेज अपेक्षाकृत कम था, और माइक्रोड्रॉपलेट एक-एक कर उत्पन्न हुए थे। एक छोटे आकार के माइक्रोस्फीयर बनाने के लिए, लागू वोल्टेज को बढ़ाया जा सकता है, और तरल पदार्थ टेलर शंकु26के साथ दूसरे राज्य में होगा।

कूलोम्ब विस्फोट घटना के कारण, छोड़ने वाली बूंदों को उनके अत्यधिक विद्युत घनत्व से और अलग किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप छोटे जेलमा माइक्रोस्फीयर थे। इसके अलावा, मोनोकंपोनेंट जेल्मा फाइबर को एक कोक्सियल नोजल और सोडियम एल्गिनेट समाधान की मदद से गढ़ा गया था। यहां एक कॉस्ल नोजल लगाया गया था। जैसा कि ऊपर बताया गया है, गेलमा की कम चिपचिपाहट के कारण, सोडियम एल्गिनेट ने फाइबर के आकार को बनाए रखने में मदद करने के लिए प्रतिरोध प्रदान किया। हाइड्रोगेल फाइबर संरचनाएं वीवो (यानी मांसपेशियों, जहाजों, आदि) में फाइबर के आकार के ऊतकों की नकल करने के लिए उपयुक्त हैं।27,28,29,30,31,32)। अधिक जटिल घटकों के साथ GelMA फाइबर के लिए, लागू बायोप्रिंटिंग नोजल को और संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मल्टीलेयर जेल्मा फाइबर उत्पन्न करने के लिए तीन-लेयर सहाक्षक नोजल इकट्ठा किया जा सकता है।

जटिल जेलमा 3 डी संरचनाओं की स्थापना में, यह पाया गया कि डीएलपी बायोप्रिंटर जेलमा की कम चिपचिपाहट के कारण प्रिंटिंग बाधा के माध्यम से टूटता है। सीएडी सॉफ्टवेयर की मदद से, मांग पर जेल्मा 3 डी संरचनाएं गढ़ी गईथीं। अंत में, एक नई जेलमा निर्माण विधि, दो बार क्रॉस-लिंकिंग रणनीति, का प्रदर्शन किया गया था और गेलमा और एक पारंपरिक माइक्रोफ्लूइडिक चिप के संयोजन पर लागू किया गया था। हाइड्रोगेल में उच्च जैव अनुकूलता होती है, और शोधकर्ता चिप शरीर के अंदर कोशिकाओं को समझा सकते हैं। प्रस्तावित जेलमा आधारित माइक्रोफ्लूइडिक चिप को चिप्स में कोशिकाओं को एन्कैप्सेशन करके और बेहतर किया जा सकता है ताकि दवा स्क्रीनिंग, सेलुलर इंटरैक्शन स्टडीज आदि के लिए उपयुक्त मॉडल इन विट्रो के रूप में काम किया जा सके । हमारा मानना है कि यहां वर्णित जेल्मा के निर्माण के तरीकों से इस क्षेत्र में विकास की दर में वृद्धि होगी और इसे आगे जैव चिकित्सा अनुसंधान में लागू किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

This work was sponsored by the National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703000), the National Nature Science Foundation of China (No.U1609207, 81827804), the Science Fund for Creative Research Groups of the National Natural Science फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर 51821093) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter membrane Millipore
2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
3D bioprinter SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
405nm wavelength light SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
co-axial nozzle SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
confocal fluorescence microscope OLYMPUS FV3000
digital light processing (DLP) bioprinter SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
DLP printer SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium with L-glutamine (DMEM/F-12) Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
EFL Software SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
fetal bovine serum (FBS) Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
gelatin Sigma-Aldrich, Shanghai, China
gelatin methacryloyl (GelMA) SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
high voltage power SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
paraformaldehyde Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
penicillin/streptomycin Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
sodium alginate (Na-Alg) Sigma-Aldrich, Shanghai, China
TRITC phalloidin Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
Triton X-100 Solarbio Co., Ltd., Shanghai, China

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahmed, E. M. Hydrogel: Preparation, characterization, and applications: A review. Journal of Advanced Research. 6 (2), 105-121 (2015).
  2. Ashton, R. S., Banerjee, A., Punyani, S., Schaffer, D. V., Kane, R. S. Scaffolds based on degradable alginate hydrogels and poly(lactide-co-glycolide) microspheres for stem cell culture. Biomaterials. 28 (36), 5518-5525 (2007).
  3. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  4. Saroia, J., et al. A review on biocompatibility nature of hydrogels with 3D printing techniques, tissue engineering application and its future prospective. Bio-Design and Manufacturing. 1 (4), 265-279 (2018).
  5. Van Den Bulcke, A. I., et al. Structural and Rheological Properties of Methacrylamide Modified Gelatin Hydrogels. Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).
  6. Sun, M., et al. Synthesis and Properties of Gelatin Methacryloyl (GelMA) Hydrogels and Their Recent Applications in Load-Bearing Tissue. Polymers. 10 (11), 1290 (2018).
  7. Gao, Q., et al. 3D printing of complex GelMA-based scaffolds with nanoclay. Biofabrication. 11 (3), 035006 (2019).
  8. Hassanzadeh, P., et al. Ultrastrong and flexible hybrid hydrogels based on solution self-assembly of chitin nanofibers in gelatin methacryloyl (GelMA). Journal of Materials Chemistry B. 4 (15), 2539-2543 (2016).
  9. McBeth, C., et al. 3D bioprinting of GelMA scaffolds triggers mineral deposition by primary human osteoblasts. Biofabrication. 9 (1), 015009 (2017).
  10. Nie, J., et al. Vessel-on-a-chip with Hydrogel-based Microfluidics. Small. 14 (45), 1802368 (2018).
  11. Shao, L., et al. Bioprinting of Cell-Laden Microfiber: Can It Become a Standard Product. Advanced Healthcare Materials. 8 (9), 1900014 (2019).
  12. Shao, L., et al. Fiber-Based Mini Tissue with Morphology-Controllable GelMA Microfibers. Small. 14 (44), 1802187 (2018).
  13. Xie, M., et al. Electro-Assisted Bioprinting of Low-Concentration GelMA Microdroplets. Small. 15 (4), 1804216 (2019).
  14. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  15. Schuurman, W., et al. Gelatin-Methacrylamide Hydrogels as Potential Biomaterials for Fabrication of Tissue-Engineered Cartilage Constructs. Macromolecular Bioscience. 13 (5), 551-561 (2013).
  16. Barbot, A., Decanini, D., Hwang, G. On-chip Microfluidic Multimodal Swimmer toward 3D Navigation. Scientific Reports. 6, 19041 (2016).
  17. Esmaeilsabzali, H., et al. An integrated microfluidic chip for immunomagnetic detection and isolation of rare prostate cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 18 (1), 22 (2016).
  18. Lee, J. M., Zhang, M., Yeong, W. Y. Characterization and evaluation of 3D printed microfluidic chip for cell processing. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), 5 (2016).
  19. Picot, J., et al. A biomimetic microfluidic chip to study the circulation and mechanical retention of red blood cells in the spleen. American Journal of Hematology. 90 (4), 339-345 (2015).
  20. Ren, K., Zhou, J., Wu, H. Materials for Microfluidic Chip Fabrication. Accounts of Chemical Research. 46 (11), 2396-2406 (2013).
  21. Chen, H., et al. Covalently antibacterial alginate-chitosan hydrogel dressing integrated gelatin microspheres containing tetracycline hydrochloride for wound healing. Materials Science and Engineering: C. 70, 287-295 (2017).
  22. Fan, M., et al. Covalent and injectable chitosan-chondroitin sulfate hydrogels embedded with chitosan microspheres for drug delivery and tissue engineering. Materials Science and Engineering: C. 71, 67-74 (2017).
  23. Feng, J., et al. Preparation of black-pearl reduced graphene oxide-sodium alginate hydrogel microspheres for adsorbing organic pollutants. Journal of Colloid and Interface Science. 508, 387-395 (2017).
  24. Park, K. S., Kim, C., Nam, J. O., Kang, S. M., Lee, C. S. Synthesis and characterization of thermosensitive gelatin hydrogel microspheres in a microfluidic system. Macromolecular Research. 24 (6), 529-536 (2016).
  25. Zheng, Y., et al. Injectable Hydrogel-Microsphere Construct with Sequential Degradation for Locally Synergistic Chemotherapy. ACS Applied Materials, Interfaces. 9 (4), 3487-3496 (2017).
  26. Fernández de la Mora, J. The Fluid Dynamics of Taylor Cones. Annual Review of Fluid Mechanics. 39 (1), 217-243 (2006).
  27. Hsiao, A. Y., et al. Smooth muscle-like tissue constructs with circumferentially oriented cells formed by the cell fiber technology. PLoS ONE. 10, 0119010 (2015).
  28. Meng, Z. J., et al. Microfluidic generation of hollow Ca-alginate microfibers. Lab on a Chip. 16 (14), 2673-2681 (2016).
  29. Peng, L., Liu, Y., Gong, J., Zhang, K., Ma, J. Continuous fabrication of multi-stimuli responsive graphene oxide composite hydrogel fibres by microfluidics. RSC Advances. 7 (31), 19243-19249 (2017).
  30. Sugimoto, M., et al. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
  31. Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking. Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).
  32. Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).

Tags

बायोइंजीनियरिंग इश्यू 154 3डी बायोप्रिंटिंग जिलेटिन मेथक्रिलोइल जेलमा माइक्रोस्फीयर माइक्रोफाइबर डिजिटल लाइट प्रोसेसिंग डीएलपी माइक्रोफ्लूइडिक चिप
जिलेटिन मेथक्रिलोइल हाइड्रोजेल आधारित बायोइंक्स के 3डी बायोप्रिंटिंग के प्रोटोकॉल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, M., Yu, K., Sun, Y., Shao, L.,… More

Xie, M., Yu, K., Sun, Y., Shao, L., Nie, J., Gao, Q., Qiu, J., Fu, J., Chen, Z., He, Y. Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks. J. Vis. Exp. (154), e60545, doi:10.3791/60545 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter