يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

النوكليوفوكساتيون وفي فيفو نشر طفيليات الايميريا الدجاج

6.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60552

⸱

فبراير 14, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Animal Protozoa Laboratory, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, 2School of Life Sciences, Peking University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، قدمنا طريقة لتحقيق الترانفيس المستقر لطفيليات الأيفريا الدجاج من قبل النيوليوبوكتينغ سبوروزويبس أو الجيل الثاني merozoites. ويمكن استخدام الطفيليات الأيميرية المعدلة وراثياً التي تعبر عن الجينات المغايرة للجينات المغايرة كوسائل لإيصال اللقاح.

الملخص

Transfection هو عملية تقنية يتم من خلالها تسليم المواد الوراثية ، مثل الحمض النووي الحمض النووي والحمض النووي الريبي المزدوج ، إلى خلايا لتعديل الجين ذي الاهتمام. حاليا، والتكنولوجيا المعدلة وراثيا أصبحت أداة لا غنى عنها لدراسة Eimeria،العوامل المسببة للcoccidiosis في الدواجن والماشية. يقدم هذا البروتوكول وصفًا مفصلًا للترانسفيكتيون المستقر في الطفيليات الإميرية: تنقية ونواة من السبوروزوبيت أو الميروزويت من الجيل الثاني ، وفي انتشار الطفيليات العابرة للفيروس. باستخدام هذا البروتوكول، حققنا transfection في عدة أنواع من Eimeria. إذا ما أُخذت هذه النواة معاً، فهي أداة مفيدة لتسهيل التلاعب الجيني في الطفيليات الأيميرية.

المقدمة

تسبب Eimeria spp. الديوك، مما يؤدي إلى خسائر اقتصادية كبيرة في صناعة الماشية والدواجن. على الرغم من أن الأدوية المضادة للأكسيد ، وإلى حد ما ، اللقاحات المضادة للأكسيد ، قد استخدمت على نطاق واسع للسيطرة على الديوكديوسيس ، لا تزال هناك أوجه قصور فيما يتعلق بمقاومتها للأدوية ، ومخلفات الأدوية ، والانتشار المحتمل لسلالات اللقاحات التي تستعيد الفوعة1. مع تطور البيولوجيا الجزيئية ، أصبح الترانزفيشن أداة حيوية لدراسة وظائف الجينات ، وتطوير لقاحات جديدة ، وفحص أهداف الأدوية الجديدة لEimeria.

في العقود الأخيرة ، تم تطبيق الترانفيشن بنجاح لطفيليات apicomplexan مثل Plasmodium و Toxoplasma gondii2،3،4،5،6. دراسة باستخدام α-غال كمراسل للترانزفيشن في E. tenella تجريب مثل هذا العمل في Eimeria7. وكان transfection من E. tenella8،9، E. mitis10، وE. acervulina (تشانغ وآخرون ، والبيانات غير المنشورة) ناجحة في الدجاج. في الآونة الأخيرة ، حققنا transfection باستخدام merozoites من E. necatrix من خلال nucleofection11.

وأظهرت الدراسات أن Eimeria التعبير عن مستضد التغاير لديه القدرة على أن يتم تطويرها كلقاح المؤتلف، مثل تلك التي تعبر عن Campylobacter jejuni مستضد A (CjaA) أو إنترلوكين الدجاج 2 (chIL-2)12،13. لذلك ، يصف هذا البروتوكول دراسة النواة من Eimeria spp. في الدجاج. يصف الإجراء تنقية sporozoites أو merozoites ، النيوكليوفيكتيون مع الحمض النووي البلازميد ، التطعيم الكلوكال / الحقن الوريدي وفي الانتشار في الجسم الحي لمساعدة الباحثين على بدء دراسات على طفيليات إيميريا المعدلة وراثيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وتم إيواء الدجاج لجميع التجارب الحيوانية وصيانته وفقا ً للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية للجامعة الزراعية الصينية واستخدامها، واتبع المبادئ التوجيهية الدولية للبحوث الطبية الحيوية التي تشمل الحيوانات. وقد وافقت لجنة ادارة بكين لالحيوانات المختبرية على هذه التجارب .

1. استخراج وتنقية sporozoites من Eimeria spp. (على سبيل المثال ، E. tenella)

  1. إطلاق الكيسات السبورية
    1. الطرد المركزي 1 × 107الكيسات التوربورية في محلول ثنائي كرومات البوتاسيوم (2.5٪، م /v) في 2300 × ز لمدة 5 دقيقة. غسلها مع PBS (محلول فوسفات عازلة) ثلاث مرات.
    2. إعادة تعليق الكريات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب 15 مل. إضافة حجم متساو من الخرز الزجاجي (1 ملم × 1 مم نطاق القطر) وتذبذب تعليق oocyst باستخدام خلاط دوامة للافراج عن sporocysts.
    3. مراقبة الإفراج عن الكيسات السبورية عن طريق المجهر كل دقيقة. وقف دوامة عندما يتم كسر أكثر من 90٪ من الكيسات.
      ملاحظة: تم كسر معظم الكيسات (مثل E. tenella، E. necatrix، و E. acervulina)بعد 1 دقيقة باستخدام خلاط الدوامة.
    4. نقل تعليق sporocyst إلى أنابيب جديدة 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1600 × ز لمدة 5 دقيقة.
    5. إعادة تعليق الراسب مع 1 مل من محلول تدرج الكثافة 50٪، والجمع في أنبوب 1.5 مل، والطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: بالنسبة لتكوين تدرج الكثافة، راجع الجدول 1. تدرج الكثافة هو متوسط غرواني قائم على السيليكا ، يتكون من جزيئات السيليكا الغروية من قطر 15-30 نانومتر (23٪ ث / ث في الماء) ، والتي تم المغلفة باستخدام البولي فينيلبيرولودون (PVP).
  2. إطلاق سراح سبوروزويليس
    1. إعادة تعليق الراسب مع العازلة excystation(الجدول 1)واحتضان في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 40-60 دقيقة للافراج عن sporozoites. توقف عن الاحتضان عندما يتم إطلاق سراح أكثر من 90٪ من السبوروزوت. ثم الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: هز الأنابيب مرة واحدة كل 5 دقائق أثناء excystation.
    2. إعادة تعليق هطول الأمطار مع 1 مل من 55٪ حل التدرج الكثافة والطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 1 دقيقة.
    3. إعادة تعليق هطول الأمطار مع 1 مل من برنامج تلفزيوني والعد sporozoites باستخدام مقياس الهيموكيتومتر.

2. جمع وتنقية merozoites من E. necatrix

ملاحظة: استخدم شوايات Arbor Acre (AA) التي تتراوح أعمارهم بين 7-14 د في التجربة. تم تلقيح الدجاج الخالية من Coccidia (ن = 3) مع 2 × 105 أوكيسات من E. necatrix. في 109 ح بعد العدوى، تم التضحية الطيور عن طريق خلع عنق الرحم. تمت إزالة الأمعاء لجمع merozoites الجيل2. لأنواع الأيميريا المختلفة، كان هناك وقت مختلف لجمع merozoites الجيل2: E. necatrix في 109 ح، وE. تينيلا في 112 ح بعد التلقيح. لtransfection من E. necatrix، merozoites هي الخيار الأمثل كما merozoites الثانية من السهل تنقية.

  1. مجموعة من الجيل الثاني merozoites من E. necatrix
    1. قطع أمعاء الدجاج طوليا، من ساق صفار (منتصف الأمعاء الدقيقة) إلى الفوهة ileocecal، وغسلها مع برنامج تلفزيوني أو HBSS (هانك حل الملح المتوازن) بلطف ثلاث مرات في طبق بيتري.
    2. قطع الأمعاء إلى 0.5 سم × 0.5 سم قطعة ووضعها في قارورة مخروطية مع عازلة الهضم(الجدول 1). ضع القارورة على خلاط مغناطيسي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع شريط تحريك لمدة 30-60 دقيقة للإفراج عن الميروزوات. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، راقب إطلاق الميروزويت عن طريق الفحص المجهري كل 5 دقيقة.
  2. تنقية merozoites عن طريق الترشيح والطرد المركزي.
    1. تصفية التعليق الذي يحتوي على merozoites هضم باستخدام أربع طبقات من الشاش14، والطرد المركزي في 600 × ز لمدة 10 دقيقة.
    2. بعد الطرد المركزي ، تخلص من البقايا الخارقة التي تحتوي على بقايا الأمعاء. نقل هطول الأمطار مع merozoites المنقى إلى أنابيب 1.5 مل.
    3. إعادة تعليق هطول الأمطار مع 1 مل من برنامج تلفزيوني والعد merozoites باستخدام مقياس الهيموكيتومتر.

3. نوكلوجيكتيون من الميروزأو سبوروزويتيس

  1. التحضير قبل النواة من الطفيليات
    1. إعداد حوالي 107 merozoites أو sporozoites في أنبوب واحد. إذا transfecting merozoites، وإعداد 3-4 أنابيب.
    2. إعداد كمية من الحمض النووي البلازميد أو جزء PCR المنقى أكبر من أو يساوي 10 ميكروغرام.
      ملاحظة: يحتوي البلازميد المستخدم في هذه الدراسة على 2 جينات: بروتين الفلورسنت الأصفر المعزز (EYFP) وثنائي هيدروفولات ثنائي الاختزال thymidylate synthase المشتقة من توكسوبلازما جوندي (TgDHFR-TS)15.
    3. إعداد 25 U من الانزيم تقييد. إذا كانت البلازميدات خطية ، يمكن أن يحسن إنزيم التقييد كفاءة الإرسال. إذا كانت البلازميدات دائرية، فقم بحذف إنزيم التقييد.
    4. إعداد 85 ميكرولتر من العازلة nucleofection: مزيج 20 ميكرولتر من العازلة nucleofection الأول و 1 مل من nucleofection العازلة الثاني، واستخدام جزء من الحل. حجم المخزن المؤقت الإجمالي هو 100 ميكرولتر.
  2. نيوكليوبككتيون
    1. الطرد المركزي sporozoite أو تعليق merozoite في 600 × ز لمدة 10 دقيقة. ثم تجاهل supernatant.
    2. في الترتيب التالي، أضف 85 ميكرولتر من المخزن المؤقت للترانسفيك النووي، و10 ميكروغرام من البلازميد (جزء PCR)، و25 U من إنزيم التقييد (عادة 5 ميكرولتر) في أنبوب 1.5 مل يحتوي على سبوروزويت أو ميروزويت.
    3. نقل التعليق إلى كأس نقل نووي. ضع الكأس في أخدود نقل نووي.
    4. قم بتشغيل جهاز النواة باستخدام زر الطاقة وحدد إجراء الترانزفيشن U-033. إذا بدأ تشغيل جهاز النواة في وضع اختيار البرنامج المجاني، فاخرج من هذا الوضع عن طريق الضغط على زر X.
    5. عند انتهاء البرنامج، اضغط على زر X من جهاز النواة، ويجب أن تعرض الشاشة موافق،مشيرا إلى أن النواة ناجحة.
    6. إضافة 0.5-1 مل من متوسط النسر المعدلة Dulbecco (DMEM)8 إلى كأس النيوكليوفكسي لوقف رد الفعل ونقل التعليق إلى 1.5 مل أنبوب بعد خلط بلطف.

4. تلقيح الكوالية أو الحقن الوريدي

  1. تلقيح الطفيليات المصابة بالنيوكليوفيالدجاج بعمر 7 أيام. Inoculate merozoites من E. necatrix أو sporozoites E. tenella عبر الطريق الكوالية، ولكن inoculate E. acervulina sporozoites عن طريق الحقن الوريدي. Inoculate حوالي 2 × 107 مليون سبوروزويفي كل دجاجة، وincoluate merozoites 107 لكل طائر.

5- الانتشار وفرز القوات المسلحة الكونغولية

  1. جمع الكيسات من البراز 5-9 أيام بعد التلقيح مع sporozoites عبر العدوى. جمع oocysts في اليوم الثالث بعد تلقيح مع merozoites عبر العدوى.
  2. استخدام الفلورسينس المنشط فرز الخلايا (FACS) و 150 ملغ /كغ بيريميثامين8 لزيادة نسبة السكان المعدلة وراثيا على التوالي.
    ملاحظة: استخدام البيريميثامين بإضافته مباشرة في تغذية. لمزيد من الاستخدام المريح، قم بإعداد البيريميثامين القابل للذوبان في الماء. حل 1 غرام من البيريميثامين في 0.2 مل pf H2SO4 و 9.8 مل من N-ميثيل بيرولدون (NMP)، ثم إضافة 1.5 مل من هذا الحل المخزون في 1 لتر من مياه الشرب للطيور.

6. تنقية العمود الاختياري

ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من السبوروزويت النقي أو الميروزويت، هناك طريقة اختيارية أن تنقيلهم من خلال عمود ديثيل أمينويثيل-52 السليلوز (DE-52 السليلوز).

  1. إعداد العمود DE-52 السليلوز يوم واحد على الأقل مقدما.
    1. إعداد العازلة الجليسين eluent(الجدول 1). ضبط درجة الحموضة من العازلة eluent الجليسين من 7.6 إلى 8.0 ودافئة إلى 41 درجة مئوية.
    2. إضافة 2.5 غرام من DE-52 السليلوز إلى العمود. يُضاف الماء ويُنقع بين عشية وضحاها. تجاهل السوبرناستانت.
    3. إضافة الماء ونقع لمدة 1 ساعة. تخلص من supernatant.
    4. إضافة 0.1 M NaOH ونقع لمدة 2 ساعة على الأقل. كرر هذه الخطوة.
    5. استبدال supernatant بالماء. بعد السليلوز يستقر تماما إلى أسفل (حوالي نصف ساعة)، كرر هذه الخطوة.
    6. تجاهل supernatant، إضافة 0.1 M HCl، ونقع لمدة 2 ساعة على الأقل. كرر هذه الخطوة.
    7. تجاهل supernatant، ونقع السليلوز مرتين مع المخزن المؤقت eluent الجليسين.
    8. قياس وضبط درجة الحموضة من 7.6 إلى 8.0 عن طريق إضافة 0.1 M HCl أو 0.1 M NaOH.
      ملاحظة: في هذا الجزء، السائل لديه حجم 5x على الأقل أكثر من ذلك من السليلوز DE-52.
  2. ضبط معدل التدفق بين 40-50 ص / دقيقة.
  3. عند الانتهاء من ترسيب السليلوز، أضف تعليق سبوروزوت أو ميروزويت إلى العمود اللوني. ضبط معدل التدفق إلى 30-40 ص / دقيقة.
    ملاحظة: إعادة تعليق هطول الأمطار sporozoite أو merozoite مع العازلة الجليسين eluent قبل إضافة العمود الكروماتوغرافي.
  4. جمع مع العازلة eluent الجليسين في أنابيب 50 مل. وقف جمع وفقا لنتائج الفحص المجهري للسبوروزويتيأو merozoites خلال عملية elution.
  5. الطرد المركزي العازلة الجليسين eluent التي تم جمعها في 600 × ز لمدة 10 دقيقة نقل sporozoite أو merozoite هطول الأمطار إلى أنابيب جديدة 1.5 مل.
  6. عد sporozoites أو merozoites باستخدام مقياس الهيموكيتومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد استخدم هذا البروتوكول لنقل الطفيليات eimerian. في هذه الدراسة، تم عرض الجيلالثاني من الميرونتس وmerozoites من E. necatrix في الشكل 2A والشكل 2B، في حين أن الشكل 2C والشكل 2D أظهر sporocysts وsporozoites E. tenella بعد استخدام حلول تدرج الكثافة. كما تم عرض الكيسات من E...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في التسعينيات ، تم تطوير نظام نقل للطفيليات المعقدة ، وتم استخدامه لإجراء دراسات على الطفيليات الإميرية. في الآونة الأخيرة ، تم إجراء transfection مستقرة في E. tenella8،9 و E. nieschulzi15. حققنا الترانزفيشن مستقرة من E. necatrix عن طريق transfecting الجيل الثاني merozoites11. تلقيح السبوروزويت اتّباعاً للإصابة بـ E. acervulina من خلال الجناح، حلّ تعجز sporozoites من E. acervu...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2017YFD0501200) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31572507 و 31772728 و 31873007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ATP-ثنائي الصوديومSigmaA26209
السليلوز DE-52SolarbioC8350
مضخة التدفق المستمرSHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO.، LTD.HL-2B
DMEMMACGENE
الخرز الزجاجيSigmaZ250473-1PAK
الجلوكوزسيجمارقم V900116
GlycineBiotopG6200
HBSSMACGENECC016
KH2PO4SigmaNo. V900041
جهاز طرد مركزي منخفض السرعةبكين عصر بيلي الطرد المركزي المحدودةDT5-2
خلاط مغناطيسيSCILOGEXMS-H280-Pro
MgCl2Sigma449164
فارز خلايا MoFloBeckMan Coulter ، الولايات المتحدة201309995
NaHCO3Sigma144-55-8
جهاز NucleofectionLONZA / amaxa90900012 (Nucleofector II)
PBSSolarbioP1010
Percoll (حل مخزون التدرج DG)GE Healthcare17-0891-09
هيدرات توروديوكسيكولات الصوديومSigmaT0875
Sorvall Legend Micro 17 Micro CentrifugeThermoFisher Scientific75002430
تكوين DMEM: 4.5 جم / لتر جلوكوز مع بيروفات الصوديوم ، L-glutamine ، و 25 ملي مولار HEPES.
التربسينسولاربيوT8150
دوامةبكين الشمالية TZ-Biotech Develop.co.HQ-60-II
أدوات منح ترموستات حمام الماء(كامبريدج) ، المحدودة.120,GM0815010
CM15019 خلاط جيغاميا

المراجع

  1. Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
  2. Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
  3. Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
  4. Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
  5. Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
  6. Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
  7. Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
  8. Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
  9. Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
  10. Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188(2014).
  11. Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
  12. Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533(2015).
  13. Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
  14. Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, Office for official publications of the European communities. Luxembourg. 1-24 (1995).
  15. Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
  16. Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2(2017).
  17. Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807(2016).
  18. Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
  19. Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تنقية الأبواغ الزygoticعزل الميروزويتاتالطرد المركزي بتدرج الكثافةبروتوكول التعداءفرز الخلايا المنشط بالفلورسينتقنية CRISPR-Cas9التلاعب الجيني
النوكليوفوكساتيون وفي فيفو نشر طفيليات الايميريا الدجاج
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.