Biology

נוקלאופלוט ובהפצת Vivo של העופות האימריריה טפילים

Published: February 14, 2020 doi: 10.3791/60552

Chunhui Duan¹, Xinming Tang¹, Dandan Hu¹, Sixin Zhang¹, Jie Liu¹, Feifei Bi¹, Zhenkai Hao¹, Jingxia Suo¹, Ying Yu¹, Min Wang¹, Pei Sun¹, Liying Du², Xun Suo¹, Xianyong Liu¹

¹National Animal Protozoa Laboratory, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, ²School of Life Sciences, Peking University

Summary

כאן, סיפקנו שיטה כדי להשיג שינוי יציב של העוף Eimeria טפילים על-ידי נוקלאונופיטים sporozoites או הדור השני merozoites. טפילים מהונדסים גנטית שונה ביטוי הטרוולוגי הגנים ניתן להשתמש ככלי משלוח החיסון.

Abstract

החצייה היא תהליך טכני שדרכו חומר גנטי, כגון DNA ו-RNA כפול, מועברים לתאים כדי לשנות את גן העניין. כיום, הטכנולוגיה הטרנסגניים הופכת כלי הכרחי לחקר Eimeria, הסוכנים סיבתי של coccidiosis ב עופות ובעלי חיים. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של התפשטות יציבה בטפילים eimerian: טיהור והתגרצות של הנבגים או הדור השני, ובהפצה vivo של טפילים מזוהמים. באמצעות פרוטוקול זה, השגנו. העברה בכמה מינים של איאימריה . כדי להקל על מניפולציה גנטית בטפילים

Introduction

Eimeria spp. גורם coccidiosis, אשר מוביל הפסדים כלכליים ניכרים בתעשיית החי והעופות. למרות תרופות anticoccidial, ובמידה רבה, חיסונים anticoccidial הקלוש, השתמשו באופן נרחב עבור השליטה של coccidiosis, יש עדיין חסרונות לגבי התנגדות הסמים שלהם, שאריות סמים, ואת הדיפוזיה הפוטנציאלית של זנים החיסון כי להחזיר התקפה אלימה¹. עם התפתחות של ביולוגיה מולקולרית, ההתפתחות הפכה לכלי חיוני ללימוד פונקציות גן, פיתוח חיסונים חדשניים, והקרנת מטרות סמים חדשים עבור Eimeria.

בעשורים האחרונים, החלה העברה בהצלחה עבור טפילים apicomplexan כגון פלמודיום ו טוקסופלזמה gondii²^,³^,⁴^,⁵^,⁶. מחקר העושה שימוש בβ-גל כעיתונאי עבור התרגום ב -E. tenella ניווט עבודה כזאת ב eimeria⁷. הזיהום של e. tenella⁸^,⁹, e. mitis¹⁰, ו -E. אכוקלינה (זאנג ואח ', נתונים שלא פורסמו) הצליחה בעופות. לאחרונה, השגנו העברה באמצעות merozoites של אי-מטריקס דרך נוקלאוזיהום¹¹.

מחקרים הראו כי eimeria ביטוי אנטיגן הטרוולוגי יש את הפוטנציאל להיות מפותח כמו חיסון רקומביננטי, כגון אלה ביטוי campylobacter jejuni אנטיגן (cjaa) או עוף אינטרלויקין 2 (צ'יל-2)¹²^,¹³. לכן, פרוטוקול זה מתאר מחקר של התגרריה של Eimeria spp. בתרנגולות. ההליך מתאר טיהור של הספאוזוענים או merozoites, נוקלאוזיהום עם דנ א פלבמיד, הזרקה של הזרקת ורידית ובהפצה vivo כדי לעזור לחוקרים להתחיל ללמוד על טפילים Eimeria הטרנסגניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

תרנגולות עבור כל הניסויים בבעלי חיים היו שוכנו ושמרו על פי הנחיות בעלי חיים מוסדיים באוניברסיטה החקלאית והשתמש בהנחיות ובעקבות העקרונות המנחים הבינלאומיים למחקר ביו-רפואי המעורב בבעלי חיים. הניסויים אושרו על ידי ועדת המינהל של בייג של חיות מעבדה.

1. הפקת וטיהור של הספוראוזודות של Eimeria spp. (למשל, e. tenella)

שחרור מספורציטוסטים
1. צנטריפוגה 1 x 10⁷בתוך הפתרון dichromate אשלגן (2.5%, m/v) ב 2,300 x g עבור 5 דקות. לשטוף אותם עם PBS (תמיסת פוספט מאגר) שלוש פעמים.
2. השהה מחדש את הפלטות באמצעות 1 מ ל של PBS והעבר לשפופרת של 15 מ ל. הוסף כמות שווה של חרוזי זכוכית (1 מ"מ x 1 מ ' טווח קוטר) ו נדנוד ההשעיה oocyst באמצעות מערבל מערבולת כדי לשחרר את הספורלוציסטים.
3. עקוב אחר שחרורו של הספורציטוסטים על ידי מיקרוסקופ כל דקה. להפסיק vortexing כאשר יותר מ 90% מהציסטות שבורות.
  הערה: רוב האוציסטות (כגון e. tenella, e. necatrix, ו -e. אכוקלינה) נשברו לאחר 1 דקות באמצעות מערבל המערבולת.
4. העבר את השעיית הספורלוציסט לצינורות חדשים 1.5 mL ו צנטריפוגה ב 1,600 x g עבור 5 דקות.
5. השהה מחדש את הזרז עם 1 מ ל של 50% מעבר הצבע של הפתרון צפיפות, לשלב ב שפופרת 1.5 mL, וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 1 דקות.
  הערה: ליצירת מעבר הצבע בצפיפות, עיין בטבלה 1. מעבר הצפיפות הוא מדיום המבוסס על סיליקה, המורכב חלקיקי סיליקה בקוטר 15-30 ננומטר (23% w/w במים), אשר היתה מצופה באמצעות פוליוינילפירולידון (PVP).
שחרור מספורזוניטים
1. השהה מחדש את הזרז עם מאגר התחנה (שולחן 1) והדגירה באמבט מים 42 ° c עבור 40-60 דקות כדי לשחרר את הספוראוזוטים. להפסיק את הדגירה כאשר יותר מ 90% של sporozoites משתחררים. לאחר מכן צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות.
  הערה: לנער את הצינורות פעם בחמש דקות במהלך תחנת המשטרה.
2. השהה מחדש את המשקעים עם 1 מ ל של 55% מעבר לפתרון צפיפות וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 1 דקות.
3. להשעות את המשקעים עם 1 מ ל של PBS ולספור את הספוראוזוטים באמצעות הומוציטוטומטר.

2. איסוף וטיהור הmerozoites של א. נקטריקס

הערה: שימוש בברויילרים (AA) ב7-14 d בניסוי. Coccidia-תרנגולות חינם (n = 3) חוסנו עם 2 x 10⁵ אוציסטות של E. מטריקס. ב 109 h לאחר ההדבקה, הציפורים הוקרב על ידי פריקה צוואר הרחם. המעי הוסר לאוסף של^{הדור 2} merozoites. עבור מינים Eimeria שונים, היה זמן שונה עבור אוסף של^{הדור 2} merozoites: E. necatrix ב 109 h, ו -E. tenella ב 112 h פוסט-חיסון. הmerozoites הן הבחירה האופטימלית שלהmerozoites השנייה בקלות לטיהור.

אוסף הmerozoites הדור השני של E. נקיטריקס
1. חותכים את longitudinally המעי עוף, מקנה החלמון (באמצע המעי הדק) אל הפתח ileocecal, ולשטוף אותו עם PBS או HBSS (פתרון מלח מאוזן של האנק) בעדינות שלוש פעמים בצלחת פטרי.
2. חותכים את המעי לתוך 0.5 ס מ x החלקים 0.5 ס מ ומניחים אותו בבקבוקון חרוט עם מאגר עיכול (שולחן 1). מניחים את הבקבוקון על מערבל מגנטי ב 37 ° c עם בר ערבוב עבור 30-60 דקות לשחרר merozoites. לאחר 30 דקות של דגירה, לפקח על שחרורו של merozoites על ידי בדיקה מיקרוסקופית כל 5 דקות.
טהר את הmerozoites באמצעות סינון וצנטריפוגה.
1. לסנן את ההשעיה המכילה merozoites מתעכל באמצעות ארבע שכבות של גזה¹⁴, ו צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות.
2. לאחר צנטריפוגה, למחוק את הסופרנטנט המכיל פסולת המעי. מעבירים את המשקעים בmerozoites מטוהרים לצינורות 1.5 mL.
3. השהה מחדש את המשקעים עם 1 מ ל של PBS וספור את הmerozoites באמצעות הומוציטוטומטר.

3. נוקלאוזיהום של merozoites או מספורזוטים

הכנה לפני התגרהזיהום של טפילים
1. היכונו כ-10⁷ merozoites או ספוראוזוטים בשפופרת אחת. , אם הmerozoites. הכן 3-4 צינורות
2. הכינו כמות של דנ א פלמיד או חלק PCR מטוהרים כי הוא גדול או שווה ל 10 μg.
  הערה: הפלסמיד המשמש במחקר זה מכיל 2 גנים: חלבון פלורסנט צהוב משופר (EYFP) ו דיהידרוטסטוסטרון רדוקטאז thymidydiase מאוחר נגזר טוקסופלזמה גונדוi (כמוסות)¹⁵.
3. הכן 25 יו של אנזים הגבלה. האנזים ההגבלה יכול לשפר. את יעילות הזיהום אם הפלמידים מעוגלים, השמט את אנזים ההגבלה.
4. הכינו 85 μL של מאגר הזיהום: לערבב 20 μL של מאגר הזיהום אני ו 1 מ ל של מאגר הזיהום השני, ולהשתמש בחלק מהפתרון. אמצעי האחסון של המאגר הכולל הוא 100 μL.
נוקלאוזיהום
1. צנטריפוגה את sporozoite או merozoite ההשעיה ב 600 x g עבור 10 דקות. . אז תמחק את הסופרנטאנט
2. בסדר הבא, להוסיף 85 μL של מאגר החצייה הגרעינית, 10 μg של פלפמיד (ה-PCR קטע), ו -25 U של אנזים הגבלה (בדרך כלל 5 μL) לתוך צינור 1.5 mL המכיל sporozoites או merozoites.
3. . להעביר את ההשעיה לגביע גרעיני הכניסו את הספל. לקצב העברה גרעינית
4. הפעל את מכשיר הנוקלאוזיהום באמצעות לחצן ההפעלה ובחר את הליך ההעברה U-033. אם מכשיר הזיהום מתחיל במצב בחירה חופשית תוכנית , צא מצב זה על ידי לחיצה על כפתור X .
5. כאשר התוכנית מסתיימת, לחץ על כפתור ה- X של מכשיר ה, והמסך אמור להציג אישור, המציין כי התגרשהזיהום מצליח.
6. הוסף 0.5-1 מ ל של מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)⁸ כדי לעצור את התגובה ולהעביר את ההשעיה ל 1.5 mL לאחר ערבוב בעדינות.

4. הזרקה בתוך ורידית

. לעופות בני 7 ימים האיחסן את הmerozoites של ה-e. necatrix או את הספורזוטים של e. tenella דרך הדרך החוצה, אבל האיאוחסן e. אכוקלינה ספוראוזוטים באמצעות הזרקה ורידית. מחסן על 2 x 10⁷ מיליון sporozoites לתוך כל עוף, ו incoluate merozoites 10⁷ עבור כל ציפור.

5. מיון והפצה של FACS

לאסוף את האוציסטות מצואה 5-9 ימים לאחר החיסון עם הספורטים מזוהמים. לאסוף את האוציסטות ביום השלישי לאחר הmerozoites עם transfected זוהמים.
השתמש במיון תא מופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית (facs) ו-150 mg/ק"ג פירימתמין⁸ כדי להגדיל ברציפות את יחס האוכלוסייה הטרנסגניים.
הערה: השתמש בפירומתמין על-ידי הוספתו ישירות להזנה. לשימוש נוח יותר, הכינו פירותימין מסיסים במים. התמוססות 1 גרם של פירימתמין ב 0.2 mL pf H₂SO₄ ו 9.8 ml של N-מתיל פירימתמין (nmp), ולאחר מכן להוסיף 1.5 ml של פתרון מניות זה לתוך 1 L של שתיית מים לציפורים.

6. טיהור טור אופציונלי

הערה: אם יש צורך בעוד מספורטים טהורים או merozoites, קיימת שיטה אופציונלית המטהרת אותם דרך העמודה diethylaminoethyl-52 תאית (DE-52 תאית).

הכינו את עמודת דה-52 תאית לפחות יום אחד מראש.
1. הכנת מאגר מאוזן גליצין (שולחן 1). להתאים את ה-pH של מאגר משחרל גליצין מ 7.6 אל 8.0 וקדם מראש ל 41 ° c.
2. הוסף 2.5 גרם של DE-52 תאית לעמודה. הוסיפו מים והשתזפו בלילה. . מחק את הסופרנטאנט
3. הוסיפו מים והשתזפו במשך 1 שעות.. תבטל את הסופרנטאנט
4. הוסף 0.1 M NaOH ולטבול לפחות 2 שעות. חזור על שלב זה.
5. . החליפו את הסופרנטאנט במים לאחר התאית מתיישב לחלוטין לתחתית (כחצי שעה), חזור על שלב זה.
6. להיפטר supernatant, להוסיף 0.1 M HCl, ולהשרות לפחות 2 שעות. חזור על שלב זה.
7. להיפטר הסופרנטאנט, ולהשרות את הצלולוזה פעמיים עם מאגר משחרל גליצין.
8. למדוד ולהתאים את ה-pH מ 7.6 כדי 8.0 על ידי הוספת 0.1 מז הHCl או 0.1 M NaOH.
  הערה: בחלק זה, הנוזל יש לפחות 5x נפח יותר מזה של DE-52 תאית.
כוונן את קצב הזרימה בין 40-50 r/min.
כאשר משקעי התאית הושלמה, להוסיף את sporozoite או merozoite ההשעיה לטור כרומטוגרפי. כוונן את קצב הזרימה ל-30-40 r/min.
הערה: השהה מחדש את ה-sporozoite או merozoite משקעים עם מאגר משחרלי גליצין לפני הוספת עמודת ה-כרומטוגרפי.
לאסוף עם מאגר להתחמק גליצין לצינורות 50 mL. הפסיקו את הקולקציה בהתאם לתוצאות הבדיקה המיקרוסקופית של הספוראוזוטים או merozoites במהלך תהליך הליקציה.
צנטריפוגה את המאגר להתחמק גליצין שנאסף ב 600 x g עבור 10 דקות. להעביר את sporozoite או merozoite משקעים לצינורות חדשים 1.5 mL.
הרוזן את הספאוזוטים או merozoites באמצעות הומוציטומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול הזה השתמש. כדי לעבור טפילים במחקר זה,^{הדור 2} meronts ו Merozoites של E. necatrix הוצגו באיור 2A ו- איור 2B, בעוד איור 2C ו- איור 2הראו את הספורלוציסטים והספוראוזוטים של E. tenella לאחר שימוש פתרונות מעבר צבע צפיפות. הציסטות של e. necatrix (איור 3A) ו -e. tenella (איור 3ב) לאחר הmerozoites הללו הוצגו גם הנבגים או הספוראוזוטים. היעילות של הייצור הראשוני של הדור הראשון לאחר הפקת הספוראוזוטים היא כ-3-10% באופן כללי. עם זאת, לאחר לאחר הmerozoites, היעילות של הדור השני של אאוציסטות הוא רק כמה אלפיות (היעילות של הדור הראשון אאוציסטות לא ניתן לחשב).

איור 1: טיהור המנזוענים. (א) לטהר את הספורזוטים דרך מצנטריפוגה מעבר הצפיפות עם פתרונות צפיפות מעבר צבע. (ב) לטהר את הספורטים דרך טור דה-52-תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הדור השני של meronts ו-Merozoites של e. necatrix יחד עם הספורציטוסטים ו הספורזוטים של e. tenella. (A) בוגרת^{הדור 2} מרקורי של א. נטריקס. (ב)^{הדור ה} -2 הmerozoites של E. necatrix. (ג) ספורציטוסטים של E. tenella לאחר טיהור. (ד) ספוראוזוטים E. tenella לאחר טיהור. סרגל קנה המידה הוא 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: האוציסטות שהתקבלו לאחר הדבקה עם הנוקלאוmerozoites מזוהמים או sporozoites. (א) הציסטות של אי הנקטריקס לאחר הדבקה של הנוקלאוmerozoites. (ב) ה-אאוציסטות של E. tenella לאחר הדבקה של נוקלאואוזוענים מזוהמים. סרגל קנה המידה הוא 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אגר	רכב
מאגר העיכול	0.25 g טריפסין, 0.5 g נתרן טאורודיאו מימה, 100 מ ל PBS או HBSS
0.1 מטר	2 גר' NaOH, 500 מ ל מים
0.1 M הHCl	4.3 מ"ל חומצה הידרוכלורית מרוכזת, 500 מ ל מים
מבריק גליצין	0.75 g גליצין, 7.9 g הנאל, 500 מ"ל מים
מאגר תחנת חפירה	0.75% טריפסין, 10% עוף מרה, PBS
1 × DG פתרון מניות מעבר הצבע (חלחול)	90% 1 × DG פתרון מניות מעבר הצבע (חלחול), 10% PBS (10 X)
מאגר הנוקלאוזיהום העצמי	ATP-disodium 2 גרם, MgCl₂-6h₂O 1.2 g, 10 מ ל מים
מאגר נוקלאוזיהום 2	KH₂פו₄ 6 g, נחקו₃ 0.6 g, גלוקוז 0.2 g, 500 ml מים
* מים: מים מזוקקים

טבלה 1: הרכב מאגרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשנות ה-90, פותחה מערכת העברה עבור טפילים apicomplexan והיא שימש למחקרים על טפילים איציריאנית. לאחרונה, נערך הזיהום היציב ב -tenella⁸^,⁹ ו -e. nies,¹⁵. השגנו את ההעברה היציבה של E. necatrix על ידי העברה של הדור השני merozoites¹¹. החיסונים של הנבגים של e. אכוקלינה דרך הווריד הכנף פתרו את חוסר היכולת של הספאוזוות של e. אכוקלינה להיות מחוסן דרך תוואי הכביש (ג'אנג ואח ', נתונים שלא פורסמו). כאן, תיארנו תהליך העברה מפורט כדי לעזור לחוקרים התגרעיםטפילים האיציריציריצילריטים.

מחקרים קודמים הראו כי ניתן היה להזריק לתוך לומן המעיים של ארנבים באונה הלפרוטית של הvivo היציבה של ה^-16 והאינטאסטאליס¹⁷. על פי הניסיון שלנו, היה יעילות גבוהה יותר כאשר מיון הנבגים של FACS במקום האוציסטות. כמו כן, היו דיווחים על העברה של הסרת ציסטות unsporulated של E. מקסימה באמצעות מערכת הנשק הגנטי או אלקטרופורציה מוצלחת של הציסטות עם egfp-Ham-otu RNA¹⁸^,¹⁹. לפיכך, מחקרים עתידיים שלנו לחקור הפיכת הפיכת ציסטות או מספורציטוסטים כדי לפשט את נוהלי החצייה בטפילים Eimeria .

הצלחת הגלגול בטפילים האטרוריאנית יכול לאפשר Eimerian גנטית שונה כדי לשמש ככלי רכב חיסון לשאת אנטיגנים הטרוולוגיים, כמו CjaA מ -C. jejuni¹³. למרות יעילות הגידול ב Eimeria השתפר באופן משמעותי, הטכנולוגיה לעריכת גנים ממשיך יש מגבלות על טפילים eimeria. עם התפתחות ההתפתחות של eimeria, crispr/CAS9 הטכנולוגיה eimeria (Hu ואח ', נתונים שלא פורסמו) יכול להוביל מניפולציה גנטית של eimeria.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק הליך מפורט של נוקלאוציריה בעוף Eimeria. הזיהום של הספוראוזוניטים או merozoites הוא בעל ערך לחקר הפונקציה של גנים ב Eimeria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (2017YFD0501200) והקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31572507, 31772728 ו 31873007).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP-disodium	Sigma	A26209
Cellulose DE-52	Solarbio	C8350
Constant Flow Pump	SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.	HL-2B
DMEM	MACGENE	CM15019
Glass beads	Sigma	Z250473-1PAK
Glucose	Sigma	No. V900116
Glycine	Biotopped	G6200
HBSS	MACGENE	CC016
KH2PO4	Sigma	No. V900041
Low Speed Centrifuge	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.	DT5-2
Magnetic Mixer	SCILOGEX	MS-H280-Pro
MgCl2	Sigma	449164
MoFlo cell sorter	BeckMan Coulter, US	201309995
NaHCO3	Sigma	144-55-8
Nucleofection device	LONZA/amaxa	90900012 (Nucleofector II)
PBS	Solarbio	P1010
Percoll (DG gradient stock solution)	GE Healthcare	17-0891-09
Sodium taurodeoxycholate hydrate	Sigma	T0875
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002430
The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES.
Trypsin	Solarbio	T8150
Vortex Mixer	Beijing North TZ-Biotech Develop.co.	HQ-60-II
Water Bath Thermostat	Grant Instruments (Cambridge), Ltd.	GD120,GM0815010