Summary
ここでは、スポロゾアイトや第二世代メロゾサイトを核電化して、ニワトリエイメリア寄生虫の安定したトランスフェクションを実現する方法を提供しました。異種抗原遺伝子を発現する遺伝子組み換えアイメリアン寄生虫はワクチン送達剤として用いることができる。
Abstract
トランスフェクションは、DNAや二本鎖RNAなどの遺伝物質を細胞に送達して目的の遺伝子を改変する技術プロセスです。現在、トランスジェニック技術は、家禽および家畜における尾骨症の原因物質であるエイメリアの研究に不可欠なツールになりつつあります。このプロトコルは、アイメリアン寄生虫における安定したトランスフェクションの詳細な説明を提供します:スポロゾーサイトまたは第二世代メロゾサイトの精製と核形成、およびトランスフェクト寄生虫の生体内伝播。このプロトコルを使用して、我々はエイメリアのいくつかの種でトランスフェクションを達成した。一緒に、 核素子は、アイメリアン寄生虫の遺伝子操作を容易にするのに有用なツールです。
Introduction
エイメリア属は尾骨症を引き起こし、家畜や家禽産業で大きな経済的損失を引き起こします。抗コクシディアル薬、およびある程度、減価された抗コクシディアルワクチンは、尾骨症の制御のために広く使用されているが、それらの薬剤耐性、薬物残基、および毒性を取り戻すワクチン株の潜在的な拡散に関する欠点は依然として1である。分子生物学の発展に伴い、遺伝子機能の研究、新しいワクチンの開発、エイメリアの新薬標的のスクリーニングに重要なツールとなっています。
過去数十年で、トランスフェクションは、マラリア原虫やトキソプラズマ・ゴンディ2、3、4、5、6などのアピコンプレックス寄生虫に対して正常に適用されてきました。E.テネラでのトランスフェクションのレポーターとしてβ-galを用いた研究は、エイメリア7でそのような仕事を操縦した。E. テネラ8,9, E. ミツ10,及びE.アセルヴリナ(張ら,未発表データ)のトランスフェクションは、ニワトリで成功した。最近、核不同を介してE.ゼネクトリクスのメロゾアテスを用いてトランスフェクションを達成した。
研究は、異種抗原を発現するエイメリアが、カンピロバクター・ケジュニ抗原A(CjaA)またはチキンインターロイキン2(chIL-2)12、13を発現するもののような組換えワクチンとして開発される可能性を有することを示した。したがって、このプロトコルは、ニワトリにおけるエイメリア属菌の核外突起研究を記述する。この手順は、スポロゾアイトまたはメロゾアイトの精製、プラスミドDNAによる核オフェクション、クロアカル接種/静脈注射および生体内伝播を記述し、研究者がトランスジェニック・エイメリア寄生虫の研究を開始するのを助ける。
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Protocol
すべての動物実験のための鶏は、中国農業大学の施設動物ケアと使用委員会のガイドラインに従って収容され、維持され、動物を含む生物医学研究のための国際指導原則に従った。実験は実験動物の北京管理委員会によって承認された。
1.エイメリア属のスポロゾイン物の抽出と精製(例えば、E.テネラ)
- スポロシストの放出
- 遠心分離機 1 x 107二色酸カリウム溶液中の卵胞を胞体 (2.5%, m/v) で 2,300 x gで 5 分間.PBS (リン酸緩衝液) で 3 回洗浄します。
- 1 mLのPBSでペレットを再懸濁し、15mLチューブに移します。等量のガラスビーズ(1 mm x 1 mm の範囲)を加え、渦ミキサーを使用してオーシルスサスペンションを振動させ、スポロシストを放出します。
- 毎分顕微鏡でスポロシストの放出を監視する。オーシストの90%以上が壊れているときに渦を止めてください。
注:ほとんどのオーシルス(E.テネラ、E.ネカトリクス、E.アセヴルブリナなど)は、渦ミキサーを使用して1分後に壊れました。 - スポロシスト懸濁液を新しい1.5 mLチューブに移し、遠心分離機を1,600 x gで5分間転送します。
- 50%の密度勾配溶液の1 mLで沈殿物を再懸濁し、1.5 mLの管に結合し、10,000 x gで1分間遠心分離します。
注: 密度勾配コンポジションについては、表 1を参照してください。密度勾配は、ポリビニルピロリドン(PVP)を使用してコーティングされた直径15〜30nm(水で23%/w)のコロイダルシリカ粒子からなるシリカベースのコロイド状媒体である。
- スポロゾイントの放出
- この沈殿物をエキシペックスバッファー(表1)で再懸濁し、42°Cの水浴中に40〜60分間インキュベートし、スポロゾライトを放出する。スポロゾイトの90%以上が放出されると、インキュベートを停止します。その後、600 x gで10分間遠心分離します。
注:エキシ分の間にチューブを5分ごとに振ってください。 - 55%の密度勾配溶液の1 mLと1分間の10,000 x gで遠心分離機で沈殿を再懸濁します。
- 1 mLのPBSで沈殿を再懸濁し、溶氷計を用いてスポロゾサイトを数える。
- この沈殿物をエキシペックスバッファー(表1)で再懸濁し、42°Cの水浴中に40〜60分間インキュベートし、スポロゾライトを放出する。スポロゾイトの90%以上が放出されると、インキュベートを停止します。その後、600 x gで10分間遠心分離します。
2. E.ゼネクトリックスのメロゾサイトの採取と精製
注:実験では7-14 dのアーバーエーカー(AA)ブロイラーを使用してください。尾菌を含まない鶏(n=3)にE.ネカトリクスの2 x 105オーシストを接種した。感染後109時間、鳥は頸部脱臼によって犠牲にされた。腸は第2世代メロゾートの採取のために除去された。異なるエイメリア種については、第2世代メロゾアイトの収集には異なる時間があった:E.ネカトリクスは109時間、E.テネラは112時間の接種後に。E.necatrixのトランスフェクションでは、第2のメロゾインは精製が容易なので、メロゾイントは最適な選択です。
- E.ゼネクトリックスの第二世代メロゾアイトのコレクション
- 鶏の腸を縦方向に切り、卵黄の茎(小腸の真ん中)からイレオセカルオリフィスまで、PBSまたはHBSS(ハンクのバランス塩溶液)でペトリ皿に3回軽く洗います。
- 腸を0.5cm x 0.5cmに切り、消化バッファーを備えた円錐形のフラスコに入れます(表1)。フラスコを37°Cの磁気ミキサーに置き、攪拌バーを30〜60分間置いてメロゾアイトを放出します。30分のインキュベーション後、5分毎に顕微鏡検査でメロゾサイトの放出を監視します。
- ろ過と遠心分離によってメロゾイントを浄化します。
- ガーゼ14の4層を用いて消化されたメロゾイントを含む懸濁液を濾過し、600 x gで10分間遠心分離します。
- 遠心分離後、腸の破片を含む上清を捨てる。精製されたメロゾインで沈殿を1.5 mLのチューブに移します。
- 1 mLのPBSで沈殿を再懸濁し、溶氷計を用いてメロゾサイトを数える。
メロゾインまたはスポロゾーアチの核分裂
- 寄生虫の核形成前の製剤
- 1つのチューブに約107メロゾインまたはスポロゾインを調製します。メロゾイドをトランスフェクションする場合は、3-4チューブを準備します。
- 10 μg 以上の量のプラスミド DNA または精製 PCR 断片を調製します。
注:本研究で使用されるプラスミドには、トキソプラズマゴンディ(TgDHFR-TS)15に由来する強化黄色蛍光タンパク質(EYFP)およびジヒドロ葉酸還元酵素チミジレートシンターゼの2つの遺伝子が含まれています。 - 制限酵素の25Uを調製する。プラスミドが線形化されれば、制限酵素はトランスフェクション効率を向上させることができる。プラスミドが円形の場合、制限酵素を省略する。
- 85 μLの核式バッファーを調製する:20 μLの核生成バッファーIと1mLの核小起バッファーIIを混合し、溶液の一部を使用する。総バッファの容積は100 μLである。
- ヌクレボネクション
- スポロゾアイトまたはメロゾアイト懸濁液を600 x gで10分間遠心分離する。その後、上清を破棄します。
- 次の順序で、85 μLの核トランスフェクションバッファー、10 μgのプラスミド(PCRフラグメント)、および25 Uの制限酵素(通常は5 μL)を、スポロゾーアテまたはメロゾアイトを含む1.5 mLチューブに添加します。
- サスペンションを核トランスフェクションカップに移します。カップを核移動溝に入れます。
- 電源ボタンを使用して核結膜装置をオンにし、トランスフェクション手順U-033を選択します。核外離装置がフリープログラム選択モードで起動する場合は、Xボタンを押してこのモードを終了します。
- プログラムが終了したら、核素子装置のXボタンを押すと、ヌクレオフィックが成功したことを示すOKが画面に表示されます。
- DulbeccoのModified Eagleのミディアム(DMEM)8を核オフィックカップに0.5-1 mL加えて、反応を止め、穏やかに混合した後にサスペンションを1.5mLチューブに移します。
4. クロアカル接種または静脈内注射
- ヌクレオ感染した寄生虫を7日齢の鶏に接種する。E.ネクサトリクスまたはE.テメラのスポロゾサイトのメロゾサイトをクロアカル経路を介して接種するが、静脈注射を介してE.アセウルフラーニウスポロゾイン石を接種する。各鶏に約2 x 107百万スポロゾアイトを接種し、各鳥にメロゾアイト107をインコル酸塩する。
5. 伝播と FACS の並べ替え
- トランスフェクションされたスポロゾーイトで接種後5〜9日の便胞を採取する。トランスフェクションされたメロゾインを接種した後、3日目に卵胞を採取する。
- 蛍光活性化細胞選別(FACS)と150mg/kgピリメタミン8を使用して、トランスジェニック母集団比率を連続的に増加させます。
注:ピリメタミンを使用して、フィードに直接添加します。より便利な使用のために、水溶性ピリメタアミンを調製してください。0.2 mL pf H2SO4および 9.8 mL の N-メチル ピロリドン (NMP) に 1 g のピリメタミンを溶解し、このストック溶液の 1.5 mL を鳥の飲料水 1 L に加えます。
6. 任意カラムの精製
注:より純粋なスポロゾアイトまたはメロゾアイトが必要な場合は、ジエチルアミノエチル-52セルロース(DE-52セルロース)カラムを通してそれらを精製するオプションの方法があります。
- DE-52セルロースカラムを少なくとも1日前に準備する。
- グリシン溶出緩衝液を調製する(表1)。グリシン溶出緩衝液のpHを7.6から8.0に調整し、41°Cに予め温めた。
- DE-52 セルロースの 2.5 g をカラムに追加します。水を加え、一晩浸します。上清を捨てます。
- 水を加え、1時間浸し、上清を捨てる。
- 0.1 M NaOH を追加し、少なくとも 2 時間浸します。この手順を繰り返します。
- 上清を水に交換してください。セルロースが完全に底部(約30分)に落ち着いたら、このステップを繰り返します。
- 上清を捨て、0.1 M HCl を加え、少なくとも 2 時間浸漬します。この手順を繰り返します。
- 上清を捨て、グリシン溶出緩衝液でセルロースを2回浸す。
- 測定し、0.1 M HCl または 0.1 M NaOH を追加して、7.6 から 8.0 までの pH を調整します。
注:この部分では、液体はDE-52セルロースのそれよりも少なくとも5倍の体積を有する。
- 流量を40~50r/分の間で調整します。
- セルロースの沈澱が完了したら、スポロゾアイトまたはメロゾアイト懸濁液をクロマトグラフカラムに添加する。流量を30~40r/分に調整します。
注:クロマトグラフカラムを追加する前に、グリシン溶出バッファーでスポロゾアイトまたはメロゾアイト沈殿を再懸濁します。 - グリシン溶出緩衝液を50 mLの管に集める。溶出プロセス中のスポロゾサイトまたはメロゾサイトの顕微鏡検査の結果に従って収集を停止します。
- グリシン溶出緩衝液を600xgで10分間遠心分離し、スポロゾアイトまたはメロゾアイト沈殿を新しい1.5mLチューブに移す。
- 煙球細胞計を使用してスポロゾサイトまたはメロゾサイトを数えます。
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Representative Results
このプロトコルは、エメリアン寄生虫をトランスフェクトするために使用されています。本研究では、E.ゼネクトロスの第2世代メロントおよびメロゾイントを図2Aおよび図2Bに示したが、図2Cおよび図2Dは、密度勾配溶液を使用した後のE.テネラのスポロシストおよびスポロゾインを示した。E.ネカトリクス(図3A)およびE.テネラ(図3B)をメロゾアイトまたはスポロゾーアツを核オフェクトした後のオーシルトも示した。スポロゾイントを脱核した後の第一世代のオーシストのトランスフェクション効率は、一般に3〜10%程度である。しかし、メロゾアイトを求核化した後、第二世代の卵胞のトランスフェクション効率はわずか数千分の1である(第1世代の卵胞のトランスフェクション効率は計算できなかった)。
図1:スポロゾーアの精製(A) 密度勾配の勾配解を用いた密度勾配遠心分離を通してスポロゾアテを浄化する。(B) DE-52セルロースカラムを通してスポロゾイントを精製する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:E.ネネラのスポロシストおよびスポロゾインと共にE.ゼネトリクスの第2世代メロントおよびメロゾイント。(A) E. necatrixの成熟した 2世代目のメロント .(B) E. necatrixの第 2世代メロゾアイトをリリースしました。(C)精製後のE.テネラのスポロシスト。(D) 精製後のスポロゾアイトE. テネラ。スケールバーは10 μmです。この図の大きいバージョンを見るには、ここをクリックしてください。
図3:ヌクレオ感染したメロゾイントまたはスポロゾイントに感染した後に得られた卵胞。(A) 核化されたメロゾインに感染した後のE.ケカトリクスの卵胞。(B) ヌクレオ感染性スポロゾーアイトに感染した後のE.テネラの卵胞。スケールバーは10 μmです。この図の大きいバージョンを見るには、ここをクリックしてください。
| バッファー | 組成 |
| 消化バッファー | 0.25 g トリプシン、0.5 g ナトリウム タウロデオキシコール酸水和物、100 ml PBS または HBSS |
| 0.1 M ナオー | 2 g NaOH, 500 ml 水 |
| 0.1 M HCl | 4.3 mlの濃縮塩酸、500 mlの水 |
| グリシン溶出緩衝液 | 0.75 g グリシン、7.9 g NaCl、500 ml 水 |
| エクサイステーションバッファー | 0.75% トリプシン, 10% チキン胆汁, PBS |
| 1×DG勾配ストックソリューション(パーコール) | 90% 1 × DG グラデーションストックソリューション (パーコール), 10% PBS (10 X) |
| 核外エプション緩衝液I | ATP-ジナトリウム 2 g, MgCl2-6H2O 1.2 g, 10 ml 水 |
| 核外エプションバッファー II | KH2PO4 6g,NaHCO3 0.6 g, グルコース 0.2 g, 500 ml 水 |
| *水:蒸留水 | |
表1:バッファの構成
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Discussion
1990年代には、アピコンプレックス寄生虫に対するトランスフェクションシステムが開発され、それが、それが、アイメリアン寄生虫の研究のために使用されました。最近、E.テネラ8、9およびE.ニエシュルジ15で安定したトランスフェクションが行われた。第二世代メロゾアイト11をトランスフェクションすることにより、E.necatrixの安定したトランスフェクションを達成した。翼静脈を介したE.アセアルヴリンナのトランスフェクトされたスポロゾイトの接種は、E.アセウルブリナのスポロゾイトが凝集経路を介して接種できないことを解決した(Zhang et al.、未発表データ)。ここでは、研究者がアイメリアン寄生虫を求核化するのを助ける詳細なトランスフェクション手順について説明した。
これまでの研究では、E.マグナ16およびE.腸管17のインビボ安定トランスフェクションのために、ウサギの腸管腔にトランスフェクトされたスポロゾアイトを腹腔内に注入することが可能であることが示された。私たちの経験によると、オーシストの代わりにFACSによってスポロシストを選別する際の効率が高かった。また、遺伝子ガン系を用いたE.マキシマの非胞子のトランスフェクション、またはeGFP-Ham-OTU RNA18,19による胞子卵胞のエレクトロポレーションに成功したという報告もあった。したがって、我々の将来の研究は、Eimeria寄生虫のトランスフェクション手順を簡素化するために、オーシストまたはスポロシストのトランスフェクションを探求する。
Eimerian寄生虫におけるトランスフェクションの成功は、C.jejuni13からCjaAのような異種抗原を運ぶためにワクチンの乗り物として使用される遺伝子組み換えEimeriaを可能にする可能性があります。エイメリアのトランスフェクション効率は大幅に向上しましたが、遺伝子編集技術は、アイメリアン寄生虫に制限を持ち続けています。エイメリアでのトランスフェクションの開発により、エイメリアのCRISPR /CAS9技術(Huら、未発表データ)は、エイメリアの遺伝子操作につながる可能性があります。
結論として、このプロトコルは、鶏エイメリアにおける核不同化のための詳細な手順を提供する。スポロゾイントまたはメロゾイントのトランスフェクションは、エイメリアの遺伝子機能の研究に役立ちます。
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Disclosures
なし。
Acknowledgments
この研究は、中国国家主要研究開発計画(2017YFD0501200)と中国自然科学財団(31572507、31772728、31873007)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
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