Summary
Hier hebben we een methode om stabiele transfection van kip Eimeria parasieten te bereiken door nucleofecting sporozoites of tweede generatie merozoiten. Genetisch gemodificeerde eimerian parasieten die heterologe antigene genen uitdrukken, kunnen worden gebruikt als vaccinleveringsvoertuigen.
Abstract
Transfection is een technisch proces waarbij genetisch materiaal, zoals DNA en dubbelstrengs RNA, in cellen worden geleverd om het gen van belang te wijzigen. Momenteel wordt transgene technologie een onmisbaar instrument voor de studie van Eimeria, de veroorzakers van coccidiose bij pluimvee en vee. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van stabiele transfection bij eimerian parasieten: zuivering en nucleofection van sporozoiten of tweede generatie merozoiten, en in vivo voortplanting van transfected parasieten. Met behulp van dit protocol bereikten we transfection in verschillende soorten Eimeria. Samen is nucleofection een nuttig hulpmiddel om genetische manipulatie bij eimerian parasieten te vergemakkelijken.
Introduction
Eimeria spp. veroorzaakt coccidiose, wat leidt tot aanzienlijke economische verliezen in de vee- en pluimveesector. Hoewel anticoccidiale geneesmiddelen, en tot op zekere hoogte, verzwakte antikokkendievaccins, op grote schaal zijn gebruikt voor de bestrijding van coccidiose, zijn er nog steeds tekortkomingen met betrekking tot hun resistentie tegen geneesmiddelen, medicijnresiduen en de potentiële verspreiding van vaccinstammen die virulentie herwinnen1. Met de ontwikkeling van moleculaire biologie is transfection een essentieel instrument geworden voor het bestuderen van genfuncties, het ontwikkelen van nieuwe vaccins en het screenen van nieuwe medicijndoelen voor Eimeria.
In de afgelopen decennia is transfection met succes toegepast voor apicomplexan parasieten zoals Plasmodium en Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Een studie met β-gal als verslaggever voor de transfection in E. tenella loodste dergelijk werk in Eimeria7. De transfection van E. tenella8,9, E. mitis10, en E. acervulina (Zhang et al., ongepubliceerde gegevens) was succesvol bij kippen. Onlangs bereikten we transfection met behulp van merozoites van E. necatrix door nucleofection11.
Studies toonden aan dat Eimeria die een heterologantigeen uitdrukt, het potentieel heeft om te worden ontwikkeld als een recombinant vaccin, zoals die waarin Campylobacter jejuni-antigeen A (CjaA) of kippeninterleukine 2 (chIL-2)12,13uitdrukt . Daarom beschrijft dit protocol een nucleofection studie van Eimeria spp. bij kippen. De procedure beschrijft zuivering van sporozoiten of merozoïeten, nucleofection met plasmid DNA, cloacale inenting/intraveneuze injectie en in vivo voortplanting om onderzoekers te helpen bij het starten van studies over transgene Eimeria-parasieten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kippen voor alle dierproeven werden ondergebracht en onderhouden volgens de China Agricultural University Institutional Animal Care and Use Committee richtlijnen en volgde de International Guiding Principles for Biomedical Research Waarbij Animals. De experimenten werden goedgekeurd door het Beijing Administration Committee of Laboratory Animals.
1. Extractie en zuivering van sporozoiten van Eimeria spp. (bijv. E. tenella)
- Afgifte van sporocysten
- Centrifuge 1 x 107gesporuleerde oocysten in kaliumdichromaatoplossing (2,5%, m/v) bij 2.300 x g voor 5 min. Was ze drie keer met PBS (fosfaatbufferoplossing).
- Resuspend de pellets met 1 mL PBS en breng over naar een 15 mL buis. Voeg een gelijk volume van glazen kralen (1 mm x 1 mm diameter bereik) en oscilleren de oocyste suspensie met behulp van een vortex mixer om de sporocysten vrij te geven.
- Controleer de afgifte van sporocysten door microscopie elke minuut. Stop vortexen wanneer meer dan 90% van de oocysten zijn gebroken.
OPMERKING: De meeste oocysten (zoals E. tenella, E. necatrixen E. acervulina)werden na 1 min gebroken met behulp van de vortexmixer. - Breng de sporocystsusvering over op nieuwe 1,5 mL-buizen en centrifuge op 1.600 x g gedurende 5 min.
- Resuspend het neerslag met 1 mL van 50% dichtheid gradiënt oplossing, combineren in een 1,5 mL buis, en centrifuge op 10.000 x g voor 1 min.
OPMERKING: Voor de compositie van het dichtheidsverloop verwijzen we naar tabel 1. De dichtheidsgradiënt is een op silica gebaseerd colloïdaal medium, bestaande uit colloïdale silicadeeltjes met een diameter van 15-30 nm (23% w/w in water), die zijn gecoat met behulp van polyvinylpyrrolidone (PVP).
- Vrijkomen van sporozoiten
- Resuspendeer het neerslag met de excystationbuffer (tabel 1) en incubeer in een waterbad van 42 °C gedurende 40-60 min om de sporozoiten vrij te laten. Stop met uitbroeden wanneer meer dan 90% van de sporozoiten worden vrijgegeven. Centrifugeer vervolgens op 600 x g gedurende 10 min.
LET OP: Schud de buizen eens in de 5 minuten tijdens de excystation. - Resuspend de neerslag met 1 mL van 55% dichtheid gradiënt oplossing en centrifuge op 10.000 x g voor 1 min.
- Resuspend de neerslag met 1 mL PBS en tel de sporozoites met behulp van een hemocytometer.
- Resuspendeer het neerslag met de excystationbuffer (tabel 1) en incubeer in een waterbad van 42 °C gedurende 40-60 min om de sporozoiten vrij te laten. Stop met uitbroeden wanneer meer dan 90% van de sporozoiten worden vrijgegeven. Centrifugeer vervolgens op 600 x g gedurende 10 min.
2. Verzameling en zuivering van merozonieten van E. necatrix
LET OP: Gebruik Arbor Acre (AA) vleeskuikens in de leeftijd van 7-14 d in het experiment. Coccidia-vrije kippen (n=3) werden ingeënt met 2 x 105 oocysten van E. necatrix. Bij 109 uur na de infectie werden de vogels opgeofferd door cervicale dislocatie. De darm werd verwijderd voor de verzameling van de2e generatie merozoiten. Voor verschillende Eimeria soorten, was er een andere tijd voor de collectie van de2e generatie merozoiten: E. necatrix op 109 uur, en E. tenella op 112 uur post-inenting. Voor de transfection van E. necatrix, merozoites zijn de optimale keuze als de tweede merozoites zijn gemakkelijk te zuiveren.
- Collectie van de tweede generatie merozoites van E. necatrix
- Snijd de kippendarm in de lengterichting, van de dooierstengel (het midden van de dunne darm) tot de ileocecale opening, en was het met PBS of HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) voorzichtig drie keer in een petrischaaltje.
- Snijd de darm in stukken van 0,5 cm x 0,5 cm en plaats deze in een conische kolf met een vergistingsbuffer(tabel 1). Plaats de kolf op een magnetische mixer op 37 °C met een roerstaaf gedurende 30-60 min om merozoiten vrij te laten. Na 30 min incubatie, controleer de afgifte van merozonieten door microscopisch onderzoek om de 5 min.
- Zuiver de merozoiten door filtratie en centrifugering.
- Filtreer de suspensie met verteerdmerozoiten met vier lagen gaas14en centrifugeer op 600 x g gedurende 10 min.
- Gooi na centrifugering het supernatant met darmvuil weg. Breng de neerslag met gezuiverde merozoites over op 1,5 mL buizen.
- Resuspend de neerslag met 1 mL PBS en tel de merozoites met behulp van een hemocytometer.
3. Nucleofection van merozoïeten of sporozoien
- Bereiding vóór nucleofection van parasieten
- Bereid ongeveer 107 merozoiten of sporozoiten in een buis. Als transfecting merozoites, bereid 3-4 buizen.
- Bereid een hoeveelheid plasmide DNA of gezuiverd PCR-fragment dat groter is dan of gelijk is aan 10 μg.
OPMERKING: De plasmid gebruikt in deze studie bevat 2 genen: verbeterde gele fluorescerende eiwitten (EYFP) en dihydrofolaat reductase thymidylate synthase afgeleid van Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15. - Bereid 25 U van beperking enzym. Als plasmiden worden gelineariseerd, kan het beperkingsenzym de transfection-efficiëntie verbeteren. Als de plasmiden cirkelvormig zijn, laat het beperkingsenzym weg.
- Bereid 85 μL nucleofection buffer: meng 20 μL nucleofection buffer I en 1 mL nucleofection buffer II, en gebruik een deel van de oplossing. Het volume van de totale buffer is 100 μL.
- Nucleofection
- Centrifugeer de sporozoite of merozoite vering op 600 x g gedurende 10 min. Gooi dan de supernatant weg.
- Voeg in de volgende volgorde 85 μL nucleaire transfectionbuffer, 10 μg plasmid (PCR-fragment) en 25 U restrictieenzym (meestal 5 μL) toe aan de 1,5 mL-buis met sporozoiten of merozoïden.
- Breng de schorsing over naar een nucleaire transfection cup. Zet de beker in een nucleaire overdracht groef.
- Schakel het nucleofection-apparaat in met de aan/uit-knop en selecteer de transfection procedure U-033. Als het nucleofection-apparaat wordt gestart in de modus Vrije programmakeuze, sluit u deze modus af door op de X-knop te drukken.
- Wanneer het programma is voltooid, drukt u op de X-knop van het nucleofection-apparaat en moet het scherm okweergeven, wat aangeeft dat de nucleofection succesvol is.
- Voeg 0,5-1 mL dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)8 toe aan de nucleofection cup om de reactie te stoppen en breng de vering over op 1,5 mL buis na het zachtjes mengen.
4. Cloacale inenting of intraveneuze injectie
- Inenting van de nucleofected parasieten in 7-dagen-oude kippen. Inenting van de merozoïeten van E. necatrix of de sporozoites van E. tenella via de cloacale route, maar inoculaat E. acervulina sporozoites via intraveneuze injectie. Inenten ongeveer 2 x 107 miljoen sporozoiten in elke kip, en incoluate merozoites 107 voor elke vogel.
5. Voortplanting en facs sorteren
- Verzamel oocysten uit uitwerpselen 5-9 dagen na inenting met getransfected sporozoiten. Verzamel de oocysten op de derde dag na het inenten met transfected merozoiten.
- Gebruik fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en 150 mg/kg pyrimethamine8 om achtereenvolgens de transgene populatieverhouding te verhogen.
OPMERKING: Gebruik pyrimethamine door het direct in het voer toe te voegen. Voor handiger gebruik, bereid in water oplosbare pyrimethamine. Los 1 g pyrimethamine op in 0,2 mL pf H2SO4 en 9,8 mL N-methyl pyrrolidone (NMP) en voeg vervolgens 1,5 mL van deze voorraadoplossing toe aan 1 L drinkwater voor vogels.
6. Facultatieve kolomzuivering
OPMERKING: Als er meer zuivere sporozoiten of merozoïden nodig zijn, is er een optionele methode die ze zuivert via een diethylethylethyl-52 cellulose (DE-52 cellulose) kolom.
- Bereid de DE-52 cellulosekolom ten minste één dag van tevoren voor.
- Bereid glycine eluent buffer (Tabel 1). Pas de pH van glycine eluentbuffer aan van 7,6 tot 8,0 en voorverwarmd tot 41 °C.
- Voeg 2,5 g DE-52 cellulose toe aan de kolom. Voeg water toe en geniet 's nachts. Gooi de supernatant weg.
- Voeg water toe en laat 1 uur weken. Gooi de supernatant weg.
- Voeg 0,1 M NaOH toe en geniet minstens 2 uur. Herhaal deze stap.
- Vervang de supernatant door water. Nadat de cellulose zich volledig tot op de bodem nestelt (ongeveer een half uur), herhaal t.m.v. deze stap.
- Gooi de supernatant weg, voeg 0,1 M HCl toe en laat minstens 2 uur weken. Herhaal deze stap.
- Gooi de supernatant weg en week de cellulose twee keer met glycine eluent buffer.
- Meet en pas de pH aan van 7,6 tot 8,0 door 0,1 M HCl of 0,1 M NaOH toe te voegen.
OPMERKING: In dit deel heeft de vloeistof minstens 5x meer volume dan dat van DE-52 cellulose.
- Pas de stroomsnelheid aan tussen 40-50 r/min.
- Wanneer de sedimentatie van cellulose is voltooid, voegt u de sporozoliet of merozolietsuspensie toe aan de chromatografische kolom. Pas de stroomsnelheid aan op 30-40 r/min.
OPMERKING: Resuspend de sporozoite of merozoite neerslag met glycine eluente buffer alvorens de chromatografische kolom toe te voegen. - Verzamel met glycine eluent buffer in 50 mL buizen. Stop de verzameling volgens de resultaten van het microscopisch onderzoek van sporozoiten of merozoïden tijdens het elutieproces.
- Centrifugeer de glycine eluent buffer verzameld bij 600 x g gedurende 10 min. Breng de sporozoite of merozoite neerslag over naar nieuwe 1,5 mL buizen.
- Tel de sporozoiten of merozoiten met behulp van een hemocytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol is gebruikt om eimerian parasieten te transfect. In deze studie werden de2e generatie meronts en merozoites van E. necatrix getoond in figuur 2A en figuur 2B, terwijl figuur 2C en figuur 2D de sporocysten en sporozoiten van E. tenella vertoonden na gebruik van de dichtheidsgradiëntoplossingen. De oocysten van E. necatrix (Figuur 3A) en E. tenella (figuur 3B) na nucleofecting de merozoites of sporozoites werden ook getoond. De transfection efficiëntie van de eerste generatie oocysten na nucleofecting de sporozoiten is ongeveer 3-10%, in het algemeen. Echter, na nucleofecting de merozoites, de transfection efficiëntie van de tweede generatie oocysten is slechts een paar duizendsten (Transfection efficiëntie van de eerste generatie oocysten kon niet worden berekend).
Figuur 1: Zuivering van sporozoien. (A) Sporozoites zuiveren door de dichtheid-gradiënt centrifugatie met dichtheid gradiënt oplossingen. (B) Sporozoiten zuiveren via de kolom DE-52 cellulose. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: De2e generatie meronts en merozoites van E. necatrix samen met de sporocysten en sporozoites van E. tenella. (A) Volwassen2e generatie meronts van E. necatrix. (B) De vrijgegeven2e generatie merozoites van E. necatrix. (C) Sporocysten van E. tenella na zuivering. (D) Sporozoiten E. tenella na zuivering. De schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: De oocysten verkregen na besmetting met de nucleofected merozoiten of sporozoiten. (A) De oocysten van E. necatrix na het infecteren met de nucleofected merozoites. (B) De oocysten van E. tenella na besmetting met nucleofected sporozoites. De schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Buffer | Samenstelling |
| Vergistingsbuffer | 0,25 g trypsine, 0,5 g natriumtaurodeoxycholaathydraat, 100 ml PBS of HBSS |
| 0.1 M NaOH | 2 g NaOH, 500 ml water |
| 0,1 m HCl | 4,3 ml geconcentreerd zoutzuur, 500 ml water |
| Glycine eluent buffer | 0,75 g glycine, 7,9 g NaCl, 500 ml water |
| Excystationbuffer | 0,75% trypsine, 10% kippengal, PBS |
| 1 × DG gradiëntstockoplossing(Percoll) | 90% 1 × DG gradiëntstockoplossing(Percoll), 10% PBS (10 X) |
| Nucleofection buffer I | ATP-dnatrium 2 g, MgCl2-6H2O 1,2 g, 10 ml water |
| Nucleofection buffer II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glucose 0,2 g, 500 ml water |
| *water: gedestilleerd water | |
Tabel 1: Samenstelling van buffers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de jaren 1990 werd een transfection systeem ontwikkeld voor apicomplexan parasieten, en het werd gebruikt voor studies over eimerian parasieten. Onlangs werd staltransfection uitgevoerd in E. tenella8,9 en E. nieschulzi15. We bereikten de stabiele transfection van E. necatrix door transfecting tweede generatie merozoites11. Inenting van transfected sporozoites van E. acervulina door de vleugelader loste het onvermogen van sporozoites van E. acervulina om via de cloacale route (Zhang et al., ongepubliceerde gegevens) worden ingeënt. Hier beschreven we een gedetailleerde transfection procedure om onderzoekers te helpen nucleofect eimerian parasieten.
Eerdere studies toonden aan dat het mogelijk was om transfected sporozoites te injecteren in het darmlumen van konijnen in een laparotomie voor in vivo stabiele transfection van E. magna16 en E. intestinalis17. Volgens onze ervaring was er een hogere efficiëntie bij het sorteren van sporocysten door FACS in plaats van oocysten. Er waren ook berichten over transfection van niet-gesporuleerde oocysten van E. maxima met behulp van een gen gun systeem of succesvolle elektroporatie van gesporuleerde oocysten met eGFP-Ham-OTU RNA18,19. Zo onderzoeken onze toekomstige studies transfection van oocysten of sporocysten om de transfection procedures in Eimeria parasieten te vereenvoudigen.
Het transfection succes in eimerian parasieten zou genetisch gemodificeerde Eimeria in staat kunnen stellen om als vaccinvoertuigen te worden gebruikt om heterologe antigenen, zoals CjaA uit C. jejuni13te dragen. Hoewel de transfection-efficiëntie in Eimeria aanzienlijk is verbeterd, blijft genbewerkingstechnologie beperkingen hebben bij eimerian parasieten. Met de ontwikkeling van transfection in Eimeria, CRISPR / CAS9 technologie in Eimeria (Hu et al., ongepubliceerde gegevens) zou kunnen leiden tot genetische manipulatie van Eimeria.
Tot slot voorziet dit protocol in een gedetailleerde procedure voor nucleofection in kip Eimeria. De transfection van sporozoiten of merozoïden is waardevol voor de studie van genfunctie in Eimeria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (2017YFD0501200) en de National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 en 31873007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, Office for official publications of the European communities. Luxembourg. 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
