Summary
Ici, nous avons fourni une méthode pour atteindre la transfection stable des parasites de poulet Eimeria par nucléozoites nucléozoites ou merozoites de deuxième génération. Les parasites eimeriens génétiquement modifiés exprimant des gènes antigéniques hétérologues pourraient être utilisés comme vecteurs de vaccination.
Abstract
La transfection est un processus technique par lequel le matériel génétique, comme l’ADN et l’ARN à double brin, est livré dans les cellules pour modifier le gène d’intérêt. Actuellement, la technologie transgénique devient un outil indispensable pour l’étude de l’Eimeria, les agents causatifs de la coccidiose chez la volaille et le bétail. Ce protocole fournit une description détaillée de la transfection stable chez les parasites eimeriens : purification et nucléofection des sporozoites ou mériozoites de deuxième génération, et propagation in vivo des parasites transfectés. En utilisant ce protocole, nous avons réalisé la transfection dans plusieurs espèces d’Eimeria. Pris ensemble, la nucléoféction est un outil utile pour faciliter la manipulation génétique chez les parasites eimeriens.
Introduction
Eimeria spp. provoque la coccidiose, ce qui entraîne des pertes économiques importantes dans l’industrie de l’élevage et de la volaille. Bien que les médicaments anticoccidiales, et dans une certaine mesure, les vaccins anticoccidiales atténués, ont été largement utilisés pour le contrôle de la coccidiose, il ya encore des lacunes concernant leur résistance aux médicaments, les résidus de médicaments, et la diffusion potentielle des souches vaccinales qui retrouvent la virulence1. Avec le développement de la biologie moléculaire, la transfection est devenue un outil essentiel pour étudier les fonctions génétiques, développer de nouveaux vaccins et sélectionner de nouvelles cibles médicamenteuses pour Eimeria.
Au cours des dernières décennies, la transfection a été appliquée avec succès pour les parasites apicomplexans tels que Plasmodium et Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Une étude utilisant le journaliste de la transfection dans E. tenella a piloté ce travail dans Eimeria7. La transfection de E. tenella8,9, E. mitis10, et E. acervulina (Zhang et al., données non publiées) a été un succès chez les poulets. Récemment, nous avons réalisé la transfection en utilisant des merozoites de E. necatrix par nucléofection11.
Des études ont montré que l’expression d’Un antigène hétérologue par Eimeria a le potentiel d’être développé comme vaccin recombinant, comme ceux qui expriment l’antigène A (CjaA) de Campylobacter jejuni ou l’interleukine de poulet 2 (chIL-2)12,13. Par conséquent, ce protocole décrit une étude de nucléofection d’Eimeria spp. chez les poulets. La procédure décrit la purification des sporozoites ou des mériozoites, la nucléoféction avec l’ADN plasmide, l’inoculation cloaque/injection intraveineuse et la propagation in vivo pour aider les chercheurs à commencer des études sur les parasites transgéniques d’Eimeria.
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Protocol
Les poulets pour toutes les expériences animales ont été logés et maintenus selon les lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université agricole de Chine et ont suivi les Principes directeurs internationaux pour la recherche biomédicale impliquant des animaux. Les expériences ont été approuvées par le Comité de l’administration de Beijing des animaux de laboratoire.
1. Extraction et purification des sporozoites d’Eimeria spp. (p. ex. E. tenella)
- Libération des sporocystes
- Centrifugeuse 1 x 107oocystes sporulés dans la solution de dichromate de potassium (2,5%, m/v) à 2 300 x g pendant 5 min. Lavez-les trois fois avec PBS (solution tampon de phosphate).
- Resuspendre les granulés avec 1 ml de PBS et transférer dans un tube de 15 ml. Ajoutez un volume égal de perles de verre (1 mm x 1 mm de diamètre) et oscillez la suspension de l’oocyst à l’aide d’un mélangeur à vortex pour libérer les sporocystes.
- Surveillez la libération de sporocystes par microscopie chaque minute. Arrêtez de vortexer lorsque plus de 90 % des oocystes sont brisés.
REMARQUE: La plupart des oocysts (tels que E. tenella, E. necatrix, et E. acervulina) ont été brisés après 1 min à l’aide du mélangeur vortex. - Transférer la suspension sporocyste dans de nouveaux tubes de 1,5 ml et une centrifugeuse à 1 600 x g pendant 5 min.
- Resuspendre le précipité avec 1 ml de solution de gradient de densité de 50%, combiner dans un tube de 1,5 ml, et centrifugeuse à 10 000 x g pendant 1 min.
REMARQUE : Pour la composition du gradient de densité, reportez-vousau tableau 1 . Le gradient de densité est un milieu colloïdal à base de silice, composé de particules colloïdales de silice de 15-30 nm de diamètre (23% w/w dans l’eau), qui ont été enduites à l’aide de polyvinylpyrrolidone (PVP).
- Libération des sporozoites
- Resuspendre le précipité avec le tampon d’excystation (tableau 1) et couver dans un bain d’eau de 42 oC pendant 40-60 min pour libérer les sporozoites. Arrêtez d’incuber lorsque plus de 90 % des sporozoites sont libérés. Puis centrifugeuse à 600 x g pendant 10 min.
REMARQUE : Secouez les tubes une fois toutes les 5 minutes pendant l’excystation. - Resuspendre les précipitations avec 1 ml de solution de gradient de densité de 55 % et centrifugeuse à 10 000 x g pendant 1 min.
- Resuspendre les précipitations avec 1 ml de PBS et compter les sporozoites à l’aide d’un hémocytomètre.
- Resuspendre le précipité avec le tampon d’excystation (tableau 1) et couver dans un bain d’eau de 42 oC pendant 40-60 min pour libérer les sporozoites. Arrêtez d’incuber lorsque plus de 90 % des sporozoites sont libérés. Puis centrifugeuse à 600 x g pendant 10 min.
2. Collecte et purification des mériozoites de E. necatrix
REMARQUE : Utilisez des poulets de chair Arbor Acre (AA) âgés de 7 à 14 d dans l’expérience. Les poulets sans coccidia (n-3) ont été inoculés avec 2 x 105 oocystes de E. necatrix. À 109 h après l’infection, les oiseaux ont été sacrifiés par la dislocation cervicale. L’intestin a été enlevé pour la collecte des merozoites de 2nd génération. Pour différentes espèces d’Eimeria, il y avait un temps différent pour la collecte des 2nd génération merozoites : E. necatrix à 109 h, et E. tenella à 112 h post-inoculation. Pour la transfection de E. necatrix, les merozoites sont le choix optimal car les deuxièmes mériozoites sont faciles à purifier.
- Collection des mériozoites de deuxième génération de E. necatrix
- Couper l’intestin de poulet longitudinalement, de la tige jaune (au milieu de l’intestin grêle) à l’orifice iléocecal, et le laver avec PBS ou HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution) doucement trois fois dans un plat Petri.
- Couper l’intestin en morceaux de 0,5 cm x 0,5 cm et le placer dans un flacon conique avec un tampon de digestion (tableau 1). Placer le flacon sur un batteur magnétique à 37 oC avec une barre de brassage de 30 à 60 min pour libérer les mériozoites. Après 30 min d’incubation, surveillez la libération de merozoites par examen microscopique toutes les 5 min.
- Purifiez les merozoites par filtration et centrifugation.
- Filtrer la suspension contenant des mériozoites digérés à l’aide de quatre couches de gaze14et de centrifugeuse à 600 x g pendant 10 min.
- Après centrifugation, jetez le supernatant contenant des débris intestinaux. Transférer les précipitations avec des merozoites purifiés dans des tubes de 1,5 ml.
- Resuspendre les précipitations avec 1 ml de PBS et compter les mériozoites à l’aide d’un hémocytomètre.
3. Nucléofection de merozoites ou sporozoites
- Préparation avant la nucléofection des parasites
- Préparer environ 107 mériozoites ou sporozoites dans un tube. Si transfétter les merozoites, préparer 3-4 tubes.
- Préparer une quantité d’ADN plasmide ou un fragment purifié de PCR qui est supérieur ou égal à 10 g.
REMARQUE : Le plasmide utilisé dans cette étude contient 2 gènes : protéine fluorescente jaune améliorée (EYFP) et réductase de dihydrofolate de la synthase thymidylate dérivée de Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15. - Préparer 25 U d’enzyme de restriction. Si les plasmides sont linéimiés, l’enzyme de restriction peut améliorer l’efficacité de la transfection. Si les plasmides sont circulaires, omettez l’enzyme de restriction.
- Préparer 85 ll de tampon de nucléofection : mélanger 20 l de tampon de nucléofection I et 1 ml de tampon de nucléofection II, et utiliser une partie de la solution. Le volume de la mémoire tampon totale est de 100 l.
- Nucléofection
- Centrifugelas la suspension de sporozoite ou de merozoite à 600 x g pendant 10 min. Ensuite, jetez le supernatant.
- Dans l’ordre suivant, ajouter 85 l l de tampon de transfection nucléaire, 10 g de plasmide (fragment de PCR) et 25 U d’enzyme de restriction (habituellement 5 l) dans le tube de 1,5 mL contenant des sporozoites ou des mériozoites.
- Transférer la suspension dans une coupe de transfection nucléaire. Mettre la tasse dans une rainure de transfert nucléaire.
- Allumez le dispositif de nucléofection en utilisant le bouton d’alimentation et sélectionnez la procédure de transfection U-033. Si le dispositif de nucléofection démarre en mode Free Program Choice, quittez ce mode en appuyant sur le bouton X.
- Lorsque le programme se termine, appuyez sur le bouton X de l’appareil de nucléofection, et l’écran doit afficher OK, indiquant que la nucléofection est réussie.
- Ajouter 0,5-1 ml du moyen de l’aigle modifié (DMEM)8 de Dulbecco à la tasse de nucléofection pour arrêter la réaction et transférer la suspension à 1,5 ml tube après mélange doux.
4. Inoculation cloacale ou injection intraveineuse
- Inoculer les parasites nucléifiés en poulets de 7 jours. Inoculer les merozoites de E. necatrix ou les sporozoites de E. tenella par la voie cloacal, mais inoculer E. acervulina sporozoites par injection intraveineuse. Inoculer environ 2 x 107 millions de sporozoites dans chaque poulet, et incoluate merozoites 107 pour chaque oiseau.
5. Propagation et tri FACS
- Recueillir des ovocytes des excréments 5-9 jours après l’inoculation avec des sporozoites transfectés. Recueillir les oocysts le troisième jour après avoir inoculé avec des mériozoites transfectés.
- Utilisez le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et la pyriméthamine8 de 150 mg/kg pour augmenter successivement le rapport de population transgénique.
REMARQUE : Utilisez de la pyriméthamine en l’ajoutant directement dans l’alimentation. Pour une utilisation plus pratique, préparez de la pyriméthamine soluble dans l’eau. Dissoudre 1 g de pyriméthamine dans 0,2 mL pf H2SO4 et 9,8 mL de pyrrolidone N-méthyle (NMP), puis ajouter 1,5 ml de cette solution de stock dans 1 L d’eau potable pour les oiseaux.
6. Purification facultative de colonne
REMARQUE : Si des sporozoites ou des mériozoites plus purs sont nécessaires, il existe une méthode facultative qui les purifie à l’intermédiaire d’une colonne de cellulose diéthylaminoéthyle-52 (DE-52 cellulose).
- Préparer la colonne de cellulose DE-52 au moins un jour à l’avance.
- Préparer le tampon d’élude de glycine (tableau 1). Ajuster le pH du tampon d’élude de glycine de 7,6 à 8,0 et préréchauffer à 41 oC.
- Ajouter 2,5 g de cellulose DE-52 à la colonne. Ajouter l’eau et faire tremper toute la nuit. Jetez le supernatant.
- Ajouter l’eau et faire tremper pendant 1 h. Jeter le supernatant.
- Ajouter 0,1 M NaOH et faire tremper pendant au moins 2 heures. Répétez cette étape.
- Remplacer le supernatant par de l’eau. Après que la cellulose se dépose complètement au fond (environ une demi-heure), répétez cette étape.
- Jeter le supernatant, ajouter 0,1 M HCl et faire tremper pendant au moins 2 heures. Répétez cette étape.
- Jeter le supernatant, et tremper la cellulose deux fois avec la glycine eluent tampon.
- Mesurer et ajuster le pH de 7,6 à 8,0 en ajoutant 0,1 M HCl ou 0,1 M NaOH.
REMARQUE: Dans cette partie, le liquide a au moins 5 fois plus de volume que celui de la cellulose DE-52.
- Ajuster le débit entre 40-50 r/min.
- Lorsque la sédimentation de la cellulose est terminée, ajouter la suspension de sporozoite ou de merozoite à la colonne chromatographique. Ajuster le débit à 30-40 r/min.
REMARQUE : Suspendez les précipitations de sporozoite ou de merozoite avec le tampon d’élude de glycine avant d’ajouter la colonne chromatographique. - Recueillir avec un tampon d’élude de glycine dans des tubes de 50 ml. Arrêter la collection selon les résultats de l’examen microscopique des sporozoites ou des mériozoites pendant le processus d’élution.
- Centrifuger le tampon d’élude de glycine recueilli à 600 x g pendant 10 min. Transférer les précipitations de sporozoite ou de merozoite à de nouveaux tubes de 1,5 ml.
- Comptez les sporozoites ou les mériozoites à l’aide d’un hémocytomètre.
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Representative Results
Ce protocole a été utilisé pour transfect parasites eimerian. Dans cette étude, les2 meront et merozoites de la deuxième génération d’E. necatrix ont été montrés dans la figure 2A et la figure 2B, tandis que la figure 2C et la figure 2D ont montré les sporocystes et les sporozoites de E. tenella après avoir utilisé les solutions de gradient de densité. Les oocystes de E. necatrix (Figure 3A) et E. tenella (Figure 3B) après nucléofecting les merozoites ou sporozoites ont également été montrés. L’efficacité de transfection des oocysts de première génération après nucléofecting les sporozoites est environ 3-10%, en général. Cependant, après la nucléofecting les merozoites, l’efficacité de transfection des oocysts de deuxième génération est seulement quelques millièmes (l’efficacité de transfection des oocysts de première génération n’a pas pu être calculée).
Figure 1 : Purification des sporozoites. (A) Purifiez les sporozoites à travers la centrifugation densité-gradient avec des solutions de gradient de densité. (B) Purifiez les sporozoites à travers la colonne DE-52-cellulose. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les meronts et merozoites de la2e génération de E. necatrix ainsi que les sporocystes et les sporozoites de E. tenella. (A) Mature 2nd génération meronts de E. necatrix. (B) Les merozoites de 2nd de génération libérées de E. necatrix. (C) Sporocystes de E. tenella après purification. (D) Sporozoites E. tenella après purification. La barre d’échelle est de 10 m. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Les oocystes obtenus après avoir été infectés par les mériozoites ou sporozoites nucléifiés. (A) Les oocysts de E. necatrix après avoir infecté avec les mériozoites nucléofected. (B) Les oocysts de E. tenella après avoir infecté avec des sporozoites nucléifiées. La barre d’échelle est de 10 m. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Tampon | Composition |
| Tampon de digestion | 0,25 g de trypsine, 0,5 g d’hydrate de taurodéoxycholate de sodium, 100 ml de PBS ou de HBSS |
| 0,1 M NaOH | 2 g NaOH, 500 ml d’eau |
| 0,1 M HCl | 4,3 ml d’acide chlorhydrique concentré, 500 ml d’eau |
| Tampon d’élude de Glycine | 0,75 g de glycine, 7,9 g de NaCl, 500 ml d’eau |
| Tampon Excystation | 0,75% trypsine, 10% bile de poulet, PBS |
| 1 solution de stock de gradient DG (Percoll) | 90% 1 - Solution de stock gradient DG(Percoll), 10% PBS (10 X) |
| Tampon de nucléofection I | ATP-disodium 2 g, MgCl2-6H2O 1,2 g, 10 ml d’eau |
| Tampon de nucléofection II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glucose 0,2 g, 500 ml d’eau |
| Eau : eau distillée | |
Tableau 1 : Composition des tampons.
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Discussion
Dans les années 1990, un système de transfection a été développé pour les parasites apicomplexans, et il a été utilisé pour des études sur les parasites eimerian. Récemment, la transfection stable a été menée dans E. tenella8,9 et E. nieschulzi15. Nous avons atteint la transfection stable de E. necatrix en transfectant les merozoites de deuxième génération11. L’inoculation des sporozoites transfectés de E. acervulina par la veine d’aile a résolu l’incapacité des sporozoites de E. acervulina d’être inoculées par la route cloacal (Zhang et autres, données non publiées). Ici, nous avons décrit une procédure détaillée de transfection pour aider des chercheurs nucléofect parasites eimerian.
Des études antérieures ont montré qu’il était possible d’injecter des sporozoites transfectés dans le lumen intestinal des lapins dans une laparotomie pour la transfection stable in vivo de E. magna16 et E. intestinalis17. Selon notre expérience, il y avait une plus grande efficacité lors du tri des sporocystes par FACS au lieu d’oocystes. Il y avait également des rapports au sujet de la transfection des oocysts non sporulated de E. maxima utilisant un système de pistolet de gène ou l’électroporation réussie des oocysts sporulated avec l’ARN eGFP-Ham-OTU18,19. Ainsi, nos études futures explorent la transfection des olécystes ou des sporocystes pour simplifier les procédures de transfection chez les parasites d’Eimeria.
Le succès de la transfection chez les parasites eimeriens pourrait permettre d’utiliser eimeria génétiquement modifié comme véhicule vaccinal pour transporter des antigènes hétérologues, tels que CjaA de C. jejuni13. Bien que l’efficacité de la transfection à Eimeria ait été considérablement améliorée, la technologie d’édition génétique continue d’avoir des limites chez les parasites eimeriens. Avec le développement de la transfection à Eimeria, la technologie CRISPR/CAS9 à Eimeria (Hu et al., données non publiées) pourrait conduire à la manipulation génétique d’Eimeria .
En conclusion, ce protocole fournit une procédure détaillée pour la nucléoféction dans le poulet Eimeria. La transfection des sporozoites ou des mériozoites est précieuse pour l’étude de la fonction génique en Eimeria.
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Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le National Key Research and Development Program of China (2017YFD0501200) et la National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 et 31873007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
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