Summary
Her ga vi en metode for å oppnå stabil transfection av kylling Eimeria parasitter ved kjernesporofecting sporozoitter eller andre generasjon merozoitter. Genmodifiserte eimeriske parasitter som uttrykker heterologøse antigene gener, kan brukes som vaksineleveringskjøretøy.
Abstract
Transfection er en teknisk prosess der genetisk materiale, som DNA og dobbelt-strandet RNA, leveres i celler for å modifisere genet av interesse. For tiden blir transgen teknologi et uunnværlig verktøy for studiet av Eimeria, de forårsakende midlene til coccidiose i fjærfe og husdyr. Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av stabil transfeksjon hos eimeriske parasitter: rensing og kjerneavdannelse av sporozotitter eller andregenerasjons merozotitter, og in vivo forplantning av transinfiserte parasitter. Ved hjelp av denne protokollen oppnådde vi transfeksjon i flere arter av Eimeria. Tatt sammen er kjerneaveksjon et nyttig verktøy for å lette genetisk manipulasjon hos eimeriske parasitter.
Introduction
Eimeria spp. forårsaker coccidiosis, noe som fører til betydelige økonomiske tap i husdyr- og fjærfeindustrien. Selv om antikoccidiale legemidler, og i en viss grad, dempede antikoccidiale vaksiner, har blitt brukt mye for kontroll av coccidiose, er det fortsatt mangler angående deres legemiddelresistens, legemiddelrester og potensiell diffusjon av vaksinestammer som gjenvinner virulens1. Med utviklingen av molekylærbiologi har transfection blitt et viktig verktøy for å studere genfunksjoner, utvikle nye vaksiner og screening nye legemiddelmål for Eimeria.
I de siste tiårene har transfection blitt brukt med hell for apicomplexan parasitter som Plasmodium og Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. En studie som brukte β-gal som reporter for transfection i E. tenella piloterte slikt arbeid i Eimeria7. Transfection av E. tenella8,9, E. mitis10, og E. acervulina (Zhang et al., upubliserte data) var vellykket i kyllinger. Nylig oppnådde vi transfection ved hjelp av merozoitter av E. necatrix gjennom kjerneaveksjon11.
Studier viste at Eimeria som uttrykker et heterologøs antigen har potensial til å bli utviklet som en rekombinant vaksine, for eksempel de som uttrykker Campylobacter jejuni antigen A (CjaA) eller kylling interleukin 2 (chIL-2)12,13. Derfor beskriver denne protokollen en nukleofeksjonsstudie av Eimeria spp. i kyllinger. Prosedyren beskriver rensing av sporozoitter eller merozoitter, kjerne av dannelse av DNA, kloacal inokulasjon / intravenøs injeksjon og in vivo forplantning for å hjelpe forskere med å starte studier på transgene Eimeria parasitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kyllinger for alle dyreforsøk ble plassert og vedlikeholdt i henhold til China Agricultural University Institutional Animal Care and Use Committee retningslinjer og fulgte International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals. Eksperimentene ble godkjent av Beijing Administration Committee of Laboratory Animals.
1. Ekstraksjon og rensing av sporozoitter av Eimeria spp. (f.eks. tenella)
- Frigjøring av sporocyster
- Sentrifuge 1 x 107sporulated oocysts i kaliumdichromate løsning (2,5%, m / v) på 2300 x g for 5 min. Vask dem med PBS (fosfat buffer løsning) tre ganger.
- Resuspender pellets med 1 ml PBS og overføre til en 15 ml rør. Tilsett et likt volum av glassperler (1 mm x 1 mm diameterområde) og oscillate oocystsuspensjonen ved hjelp av en vortexmikser for å frigjøre sporocystene.
- Overvåk frigjøringen av sporocyster med mikroskopi hvert minutt. Slutt å virvle når mer enn 90% av oocystene er ødelagt.
MERK: De fleste oocystene (som E. tenella, E. necatrixog E. acervulina) ble brutt etter 1 min ved hjelp av vortexmikseren. - Overfør sporocystsuspensjonen til nye 1,5 ml rør og sentrifuge ved 1600 x g i 5 min.
- Resuspender utfellingen med 1 ml 50 % tetthetsgradientløsning, kombiner i et 1,5 ml rør og sentrifuge på 10 000 x g i 1 min.
MERK: For tetthetsgraderingssammensetningen, se Tabell 1. Tetthetgradienten er et silikabasert kolloidalt medium, bestående av kolloidale silikapartikler på 15-30 nm diameter (23% w / w i vann), som har blitt belagt med polyvinylpyrrolidon (PVP).
- Frigjøring av sporozoitter
- Resuspender utfellingen med eksemittbufferen (tabell 1) og inkuber i et 42 °C vannbad i 40-60 min for å frigjøre sporozoittene. Slutt å inkubere når mer enn 90% av sporozoitter frigjøres. Deretter sentrifuge på 600 x g i 10 min.
MERK: Rist rørene én gang hvert femte minutt under eksestasjon. - Resuspender nedbøren med 1 ml 55 % tetthetsgradientløsning og sentrifuge på 10 000 x g i 1 min.
- Resuspender nedbøren med 1 ml PBS og tell sporozoittene ved hjelp av et hemocytometer.
- Resuspender utfellingen med eksemittbufferen (tabell 1) og inkuber i et 42 °C vannbad i 40-60 min for å frigjøre sporozoittene. Slutt å inkubere når mer enn 90% av sporozoitter frigjøres. Deretter sentrifuge på 600 x g i 10 min.
2. Innsamling og rensing av merozoitter av E. necatrix
MERK: Bruk Arbor Acre (AA) broilers i alderen 7-14 d i forsøket. Coccidia-frie kyllinger (n= 3) ble vaksinert med 2 x 105 oocyster av E. necatrix. Ved 109 timer etter infeksjon ble fuglene ofret ved cervical dislokasjon. Tarmen ble fjernet for innsamling av2. For forskjellige Eimeria arter, var det en annen tid for samling av 2nd generasjon merozoites: E. necatrix på 109 h, og E. tenella på 112 h post-inokulasjon. For transfection av E. necatrixer merozoitter det optimale valget, da de andre merozoittene er enkle å rense.
- Samling av andre generasjons merozoitter av E. necatrix
- Skjær kyllingtarmen langsgående, fra eggeplommestilken (midten av tynntarmen) til ileocecal åpningen, og vask den med PBS eller HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) forsiktig tre ganger i en Petri-tallerken.
- Skjær tarmen i 0,5 cm x 0,5 cm stykker og legg den i en konisk kolbe med fordøyelsesbuffer (Tabell 1). Plasser kolben på en magnetisk mikser ved 37 °C med en rørebar i 30-60 min for å frigjøre merozoitter. Etter 30 min inkubasjon, overvåke utgivelsen av merozoitter ved mikroskopisk undersøkelse hver 5 min.
- Rens merozoittene ved filtrering og sentrifugering.
- Filtrer suspensjonen som inneholder fordøyd merozoitter ved hjelp av fire lag med gasbind14,og sentrifuge ved 600 x g i 10 min.
- Etter sentrifugering, kast supernatanten som inneholder tarmrester. Overfør nedbøren med renset merozoitter til 1,5 ml rør.
- Resuspender nedbøren med 1 ml PBS og tell merozoittene ved hjelp av et hemocytometer.
3. Kjerneav ofeksjon av merozoitter eller sporozoitter
- Forberedelse før kjerne av parasitter
- Forbered ca 107 merozoites eller sporozoites i ett rør. Hvis transfecting merozoites, forberede 3-4 rør.
- Forbered en mengde plasmid DNA eller renset PCR fragment som er større enn eller lik 10 μg.
MERK: Plasmiden som brukes i denne studien inneholder 2 gener: forbedret gult fluorescerende protein (EYFP) og dihydrofolat reduktase thymidylate synthase avledet fra Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15. - Forbered 25 U av begrensning enzym. Hvis plasmider er linearisert, kan begrensningsenzymet forbedre transfection effektiviteten. Hvis plasmidene er sirkulære, utelater begrensningsenzymet.
- Forbered 85 μL kjernebuffer: bland 20 μL kjernebuffer I og 1 ml kjernebuffer II, og bruk en del av oppløsningen. Volumet på den totale bufferen er 100 μL.
- Nukleoksjon
- Sentrifuge sporozoitt eller merozoitt suspensjon på 600 x g i 10 min. Kast deretter supernatanten.
- I følgende rekkefølge legger du til 85 μL kjernefysisk transfeksjonsbuffer, 10 μg plasmid (PCR-fragment) og 25 U av restriksjonsenzymet (vanligvis 5 μL) i 1,5 ml-røret som inneholder sporozoitter eller merozotitter.
- Overfør suspensjonen til en kjernefysisk transfeksjonskopp. Sett koppen inn i et kjernefysisk overføringsspor.
- Slå på kjernen av enheten ved hjelp av av/på-knappen og velg transfection-prosedyren U-033. Hvis kjernen i kjernen av enheten starter i frivalgmodusmodus, må du avslutte denne modusen ved å trykke på X-knappen.
- Når programmet er ferdig, trykker du på X-knappen på nucleofection-enheten, og skjermen skal vise OK, noe som indikerer at kjernen i utførelsen er vellykket.
- Legg til 0,5-1 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)8 til kjernekoppen for å stoppe reaksjonen og overføre suspensjonen til 1,5 ml rør etter blanding forsiktig.
4. Cloacal inokulasjon eller intravenøs injeksjon
- Inokuler kjernenavektede parasitter i 7-dagers gamle kyllinger. Inokuler merozoittene til E. necatrix eller sporozoittene til E. tenella via den klaviske ruten, men inokulere E. acervulina sporozoites via intravenøs injeksjon. Inokulere ca 2 x 107 millioner sporozoitter i hver kylling, og incoluate merozoites 107 for hver fugl.
5. Sortering av forplantning og FACS
- Samle oocyster fra avføring 5-9 dager etter inokulasjon med transinfiserte sporozoitter. Samle oocyster på den tredje dagen etter inokulering med transfected merozoites.
- Bruk fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og 150 mg/kg pyrimethamin8 for å øke det transgene populasjonsforholdet.
MERK: Bruk pyrimethamin ved å legge den direkte i fôret. For mer praktisk bruk, forberede vannløselig pyrimethamine. Oppløs 1 g pyrimethamin i 0,2 ml pf H2SO4 og 9,8 ml N-metylpyrrolidon (NMP), og tilsett deretter 1,5 ml av denne lagerløsningen i 1 L drikkevann for fugler.
6. Valgfri kolonnerensing
MERK: Hvis det er behov for mer rene sporozoitter eller merozoitter, er det en valgfri metode som renser dem gjennom en diethylaminoehyl-52 cellulose (DE-52 cellulose) kolonne.
- Klargjør KOLONNEN DE-52-cellulose minst én dag i forveien.
- Klargjør glycineluent buffer (tabell 1). Juster pH av glycineluentbuffer fra 7,6 til 8,0 og forvarmet til 41 °C.
- Legg til 2,5 g DE-52 cellulose i kolonnen. Tilsett vann og bløtlegg over natten. Kast supernatanten.
- Tilsett vann og bløtlegg i 1 t. Kast supernatanten.
- Legg til 0,1 M NaOH og suge i minst 2 timer. Gjenta dette trinnet.
- Skift ut supernatanten med vann. Etter cellulosehelt bosetter seg til bunnen (omtrent en halv time), gjenta dette trinnet.
- Kast supernatanten, legg til 0,1 M HCl, og bløtlegg i minst 2 timer. Gjenta dette trinnet.
- Kast supernatanten, og bløtlegg celluloseto ganger med glycineluent buffer.
- Mål og juster pH fra 7,6 til 8,0 ved å legge til 0,1 M HCl eller 0,1 M NaOH.
MERK: I denne delen har væsken minst 5 ganger mer volum enn de-52 cellulose.
- Juster strømningshastigheten mellom 40-50 r/min.
- Når sedimentering av cellulose er fullført, legg sporozoitt eller merozoitt suspensjon til den kromatografiske kolonnen. Juster strømningshastigheten til 30-40 r/min.
MERK: Resuspender sporozoitt en eller merozoite nedbør med glycineluent buffer før du legger til den kromatografiske kolonnen. - Samle med glycineluent buffer i 50 ml rør. Stopp samlingen i henhold til resultatene av mikroskopisk undersøkelse av sporozoitter eller merozotitter under elutionprosessen.
- Sentrifuge glycineluent buffer samlet på 600 x g i 10 min. Overfør sporozoitt eller merozoite nedbør til nye 1,5 ml rør.
- Tell sporozoittene eller merozoittene ved hjelp av et hemocytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen har blitt brukt til å transfect eimerian parasitter. I denne studien ble 2. Oocystene til E. necatrix (figur 3A) og E. tenella (figur 3B) etter kjerneavecting merozoittene eller sporozoittene ble også vist. Transfection effektiviteten av første generasjons oocyster etter kjerner av ecofecting sporozoitter er ca 3-10%, generelt. Men etter kjerner av merozoitter, transfection effektivitet av andre generasjon oocyster er bare noen få tusendeler (Transfection effektivitet av første generasjon oocyster kunne ikke beregnes).
Figur 1: Rensing av sporozoitter. (A) Rense sporozotitter gjennom dentetthetsgraderingssensen med tetthetsgradientløsninger. (B) Rense sporozotitter gjennom DE-52-cellulosekolonnen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2:2. generasjons meronter og merozoitter av E. necatrix sammen med sporocyster og sporozoitter av E. tenella. (A) Modne2. (B) De utgitte 2nd generasjon merozoites av E. necatrix. (C) Sporocyster av E. tenella etter rensing. (D) Sporozoites E. tenella etter rensing. Skalerbar er 10 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Oocystene oppnås etter infeksjon med kjernene i merozoitter eller sporozoitter. (A) Oocystene til E. necatrix etter å ha smittet med kjernene i merozoitter. (B) Oocystene til E. tenella etter å ha smittet med kjerner av ekte sporozotitter. Skalerbar er 10 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Buffer | Sammensetning |
| Fordøyelsesbuffer | 0,25 g trypsin, 0,5 g natriumtaurodeoksykolaterhydrat, 100 ml PBS eller HBSS |
| 0.1 M NaOH | 2 g NaOH, 500 ml vann |
| 0.1 M HCl | 4,3 ml konsentrert saltsyre, 500 ml vann |
| Glycin eluent buffer | 0,75 g glysin, 7,9 g NaCl, 500 ml vann |
| Buffer for excystation | 0,75% trypsin, 10% kylling galle, PBS |
| 1 × DG gradient lager løsning (Percoll) | 90 % 1 × DG gradient lager løsning (Percoll), 10% PBS (10 X) |
| Kjernebuffer I | ATP-disodium 2 g, MgCl2-6H2O 1,2 g, 10 ml vann |
| Kjernebuffer II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glukose 0,2 g, 500 ml vann |
| * vann: destillert vann | |
Tabell 1: Sammensetning av buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På 1990-tallet ble et transfection-system utviklet for apicomplexan parasitter, og det ble brukt til studier på eimeriske parasitter. Nylig ble stabil transfection utført i E. tenella8,9 og E. nieschulzi15. Vi oppnådde stabil transfection av E. necatrix ved å transfecting andre generasjon merozoitter11. Inokulasjon av transinfiserte sporozoitter av E. acervulina gjennom vingevenen løste manglende evne til sporozoitter av E. acervulina å bli vaksinert via cloacal rute (Zhang et al., upubliserte data). Her beskrev vi en detaljert transfeksjonsprosedyre for å hjelpe forskere med å kjerne eimeriske parasitter.
Tidligere studier viste at det var mulig å injisere transinfiserte sporozotitter i tarmlumen av kaniner i laparotomi for in vivo stabil transfection av E. magna16 og E. intestinalis17. Ifølge vår erfaring var det høyere effektivitet når vi sorterer sporocyster av FACS i stedet for oocyster. Det var også rapporter om transfection av usporulated oocysts av E. maxima ved hjelp av et genpistolsystem eller vellykket elektroporering av sporulated oocyster med eGFP-Ham-OTU RNA18,19. Dermed utforsker våre fremtidige studier transfection av oocyster eller sporocyster for å forenkle transfection prosedyrene i Eimeria parasitter.
Transfection suksess i eimerian parasitter kan muliggjøre genmodifisert Eimeria som skal brukes som vaksinekjøretøy for å bære heterologøse antigener, som CjaA fra C. jejuni13. Selv om transfeksjonseffektivitet i Eimeria har blitt betydelig forbedret, fortsetter genredigeringsteknologi å ha begrensninger i eimeriske parasitter. Med utviklingen av transfection i Eimeria,CRISPR/ CAS9 teknologi i Eimeria (Hu et al., upubliserte data) kan føre til genetisk manipulering av Eimeria.
Til slutt gir denne protokollen en detaljert prosedyre for kjerneimerksjon i kylling Eimeria. Transfeksjon av sporozotitter eller merozoitter er verdifull for studiet av genfunksjon i Eimeria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Key Research and Development Program of China (2017YFD0501200) og National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 og 31873007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, Office for official publications of the European communities. Luxembourg. 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
