Summary
Aquí, proporcionamos un método para lograr la transfección estable de parásitos de pollo Eimeria mediante la nucleofectación de esporozoitos o merozoites de segunda generación. Los parásitos eimerianos modificados genéticamente que expresen genes antigénicos hetrólogos podrían utilizarse como vehículos de administración de vacunas.
Abstract
La transfección es un proceso técnico a través del cual el material genético, como el ADN y el ARN de doble cadena, se entregan en las células para modificar el gen de interés. Actualmente, la tecnología transgénica se está convirtiendo en una herramienta indispensable para el estudio de Eimeria,los agentes causales de la coccidiosis en aves de corral y ganado. Este protocolo proporciona una descripción detallada de la transfección estable en parásitos eimerianos: purificación y nucleofección de esporozoítos o merozoitos de segunda generación, y propagación in vivo de parásitos transinfectados. Utilizando este protocolo, logramos la transfección en varias especies de Eimeria. En conjunto, la nucleofección es una herramienta útil para facilitar la manipulación genética en parásitos eimerianos.
Introduction
Eimeria spp. causa coccidiosis, lo que conduce a pérdidas económicas sustanciales en la industria ganadera y avícola. Aunque los medicamentos anticoccidiales, y en cierta medida, las vacunas anticoccidiales atenuadas, se han utilizado ampliamente para el control de la coccidiosis, todavía existen deficiencias con respecto a su resistencia a los medicamentos, residuos de drogas y la posible difusión de cepas vacunales que recuperan la virulencia1. Con el desarrollo de la biología molecular, la transfección se ha convertido en una herramienta vital para estudiar las funciones genéticas, desarrollar nuevas vacunas y detectar nuevas dianas farmacológicas para Eimeria.
En las últimas décadas, la transfección se ha aplicado con éxito para parásitos apicomplexianos como Plasmodium y Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Un estudio con la galone como reportero para la transfección en E. tenella pilotó tal trabajo en Eimeria7. La transfección de E. tenella8,9, E. mitis10,y E. acervulina (Zhang et al., datos inéditos) tuvo éxito en pollos. Recientemente, logramos la transfección utilizando merozoitas de E. necatrix a través de la nucleofección11.
Los estudios mostraron que Eimeria que expresa un antígeno hetrólogo tiene el potencial de desarrollarse como una vacuna recombinante, como las que expresan el antígeno A de Campylobacter jejuni (CjaA) o la interleucina de pollo 2 (chIL-2)12,13. Por lo tanto, este protocolo describe un estudio de nucleofección de Eimeria spp. en pollos. El procedimiento describe la purificación de esporozoítos o merozoitos, nucleofección con plasma, inoculación cloacal/inyección intravenosa y propagación in vivo para ayudar a los investigadores a iniciar estudios sobre parásitos transgénicos de Eimeria.
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Protocol
Los pollos para todos los experimentos con animales fueron alojados y mantenidos de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de China y siguieron los Principios Rectores Internacionales para la Investigación Biomédica que involucran a los animales. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Animales de Laboratorio de la Administración de Beijing.
1. Extracción y purificación de esporozoítos de Eimeria spp. (por ejemplo, E. tenella)
- Liberación de esporocistos
- Centrifugar 1 x 107ovocitos esporulados en solución de dicromato de potasio (2,5%, m/v) a 2.300 x g durante 5 min. Lávelos con PBS (solución tampón de fosfato) tres veces.
- Resuspenda los pellets con 1 ml de PBS y transfiera a un tubo de 15 ml. Agregue el mismo volumen de perlas de vidrio (rango de 1 mm x 1 mm de diámetro) y oscile la suspensión de ovocitos utilizando un mezclador de vórtice para liberar los esporocistos.
- Supervise la liberación de esporocistos mediante microscopía cada minuto. Deje de vórtice cuando más del 90% de los ovocitos estén rotos.
NOTA: La mayoría de los ovocitos (como E. tenella, E. necatrixy E. acervulina)se rompieron después de 1 min utilizando el mezclador de vórtice. - Transfiera la suspensión del esporocisto a nuevos tubos de 1,5 ml y centrífuga a 1.600 x g durante 5 min.
- Resuspender el precipitado con 1 ml de solución de gradiente de densidad del 50%, combinar en un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 10.000 x g durante 1 min.
NOTA: Para conocer la composición del gradiente de densidad, consulte la Tabla 1. El gradiente de densidad es un medio coloidal a base de sílice, que consiste en partículas de sílice coloidal de 15-30 nm de diámetro (23% p/p en agua), que han sido recubiertas con polivinilpirrolidona (PVP).
- Liberación de esporozoítos
- Resuspenda el precipitado con el tampón de exciestación(Tabla 1) e incubar en un baño de agua de 42oC durante 40-60 min para liberar los esporozoitos. Deje de incubar cuando se libere más del 90% de los esporozoitas. A continuación, centrífuga a 600 x g durante 10 min.
NOTA: Agitar los tubos una vez cada 5 minutos durante la excestación. - Resuspenda la precipitación con 1 ml de solución de gradiente de densidad del 55% y centrífuga a 10.000 x g durante 1 min.
- Resuspende la precipitación con 1 ml de PBS y cuenta los esporozoítos usando un hemocitómetro.
- Resuspenda el precipitado con el tampón de exciestación(Tabla 1) e incubar en un baño de agua de 42oC durante 40-60 min para liberar los esporozoitos. Deje de incubar cuando se libere más del 90% de los esporozoitas. A continuación, centrífuga a 600 x g durante 10 min.
2. Recogida y purificación de merozoitas de E. necatrix
NOTA: Utilice engorros Arbor Acre (AA) de 7 a 14 d años en el experimento. Los pollos libres de coccidia (n-3) fueron inoculados con 2 x 105 ovocitos de E. necatrix. A las 109 h después de la infección, las aves fueron sacrificadas por dislocación cervical. El intestino fue extirpado para la recolección de los merozoítos de2a generación. Para diferentes especies de Eimeria, hubo un tiempo diferente para la recolección de los memerozoitos de2a generación: E. necatrix a las 109 h, y E. tenella a 112 h post-inoculación. Para la transfección de E. necatrix,los merozoites son la opción óptima ya que los segundos merozoites son fáciles de purificar.
- Colección de los merozoites de segunda generación de E. necatrix
- Cortar el intestino de pollo longitudinalmente, desde el tallo de la yema (el medio del intestino delgado) hasta el orificio ileocecal, y lávelo con PBS o HBSS (Solución de sal equilibrada de Hank) suavemente tres veces en un plato de Petri.
- Cortar el intestino en trozos de 0,5 cm x 0,5 cm y colocarlo en un matraz cónico con un tampón de digestión (Tabla 1). Colocar el matraz sobre un mezclador magnético a 37oC con una barra de agitación durante 30-60 min para liberar merozoites. Después de 30 minutos de incubación, controlar la liberación de merozoites mediante un examen microscópico cada 5 min.
- Purificar los merozoitas por filtración y centrifugación.
- Filtrar la suspensión que contiene merozoitas digeridos utilizando cuatro capas de gasa14,y centrifugar a 600 x g durante 10 min.
- Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante que contiene residuos intestinales. Transfiera la precipitación con merozoites purificados a tubos de 1,5 ml.
- Resuspende la precipitación con 1 mL de PBS y cuenta los merozoites usando un hemocitómetro.
3. Nucleofección de merozoites o esporozoítos
- Preparación antes de la nucleofección de parásitos
- Preparar unos 107 merozoites o esporozoítos en un tubo. Si transfecta los merozoitos, prepare 3-4 tubos.
- Preparar una cantidad de ADN plásmido o fragmento de PCR purificado que sea mayor o igual a 10 g.
NOTA: El plásmido utilizado en este estudio contiene 2 genes: proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) y dihidrofolato reductasa tirosa sintasa derivada de Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15. - Preparar 25 U de enzima de restricción. Si los plásmidos se linealizan, la enzima de restricción puede mejorar la eficiencia de la transfección. Si los plásmidos son circulares, omita la enzima de restricción.
- Preparar 85 ml de tampón de nucleofección: mezclar 20 ml de tampón de nucleofección I y 1 ml de tampón de nucleofección II, y utilizar una parte de la solución. El volumen del búfer total es de 100 l.
- Nucleofección
- Centrifugar la suspensión de esporozoita o merozoita a 600 x g durante 10 min. A continuación, deseche el sobrenadante.
- En el siguiente orden, añadir 85 ml de tampón de transfección nuclear, 10 g de plásmido (fragmento de PCR) y 25 U de enzima de restricción (generalmente 5 l) en el tubo de 1,5 ml que contenga esporozoitos o merozoitos.
- Transfiera la suspensión a una taza de transfección nuclear. Pon la copa en una ranura de transferencia nuclear.
- Encienda el dispositivo de nucleofección utilizando el botón de encendido y seleccione el procedimiento de transfección U-033. Si el dispositivo de nucleofección se inicia en el modo Decisión de programa libre, salga de este modo pulsando el botón X.
- Cuando finalice el programa, pulse el botón X del dispositivo de nucleofección y la pantalla debe mostrar OK, lo que indica que la nucleofección se ha realizado correctamente.
- Añadir 0,5-1 ml del medio de águila modificada (DMEM)8 de Dulbecco a la copa de nucleofección para detener la reacción y transferir la suspensión al tubo de 1,5 ml después de mezclar suavemente.
4. Inoculación cloacal o inyección intravenosa
- Inocular los parásitos nucleos en pollos de 7 días de edad. Inocular los merozoitas de E. necatrix o las esporozoias de E. tenella por vía cloacal, pero inocular E. acervulina esporozoitas mediante inyección intravenosa. Inocular alrededor de 2 x 107 millones de esporozoítos en cada pollo, e incoluate merozoites 107 para cada ave.
5. Clasificación de propagación y FACS
- Recoger los ovocitos de las heces 5-9 días después de la inoculación con esporozoitos transinfectados. Recoger los ovocitos al tercer día después de inocular con merozoites transinfectados.
- Utilice la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y 150 mg/kg de pirimetamina8 para aumentar sucesivamente la proporción de población transgénica.
NOTA: Utilice pirimetamina agregándola directamente en el pienso. Para un uso más conveniente, preparar pirimetamina soluble en agua. Disolver 1 g de pirimetamina en 0,2 ml pf H2SO4 y 9,8 ml de N-metilpirrolidona (NMP), y luego añadir 1,5 ml de esta solución en 1 L de agua potable para las aves.
6. Purificación opcional de columnas
NOTA: Si se necesitan más esporozoítos o merozoitos puros, hay un método opcional que los purifica a través de una columna de celulosa dietilaminoethyl-52 (DE-52 celulosa).
- Prepare la columna de celulosa DE-52 con al menos un día de antelación.
- Preparar el tampón eluyente de glicina (Tabla 1). Ajustar el pH del tampón eluyente de glicina de 7,6 a 8,0 y precalentado a 41 oC.
- Agregue 2,5 g de celulosa DE-52 a la columna. Agregue agua y remoje durante la noche. Descarta el sobrenadante.
- Añadir agua y remojar durante 1 h. Deseche el sobrenadante.
- Añadir 0.1 M NaOH y remojar durante al menos 2 horas. Repita este paso.
- Sustituya el sobrenadante por agua. Después de que la celulosa se asiente completamente hasta el fondo (alrededor de media hora), repita este paso.
- Deseche el sobrenadante, agregue 0.1 M HCl, y remoje durante al menos 2 horas. Repita este paso.
- Deseche el sobrenadante y remoje la celulosa dos veces con tampón eluyente de glicina.
- Mida y ajuste el pH de 7.6 a 8.0 agregando 0.1 M HCl o 0.1 M NaOH.
NOTA: En esta parte, el líquido tiene al menos 5 veces más volumen que el de la celulosa DE-52.
- Ajuste el caudal entre 40-50 r/min.
- Cuando se complete la sedimentación de la celulosa, agregue la suspensión de esporozoita o merozoita a la columna cromatográfica. Ajuste el caudal a 30-40 r/min.
NOTA: Resuspenda la precipitación de esporozoita o merozoita con el tampón eluyente de glicina antes de añadir la columna cromatográfica. - Recoger con tampón eluyente de glicina en tubos de 50 ml. Detener la recolección de acuerdo con los resultados del examen microscópico de esporozoítos o merozoites durante el proceso de elución.
- Centrifugar el tampón eluyente de glicina recogido a 600 x g durante 10 min. Transfiera la precipitación de esporozoita o merozoita a nuevos tubos de 1,5 ml.
- Cuenta los esporozoítos o merozoitos usando un hemocitómetro.
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Representative Results
Este protocolo se ha utilizado para transfectar parásitos eimeicos. En este estudio, los merontes y merozoites de2a generación de E. necatrix se mostraron en la Figura 2A y la Figura 2B,mientras que la Figura 2C y la Figura 2D mostraron los esporoquistes y esporozoitos de E. tenella después de utilizar las soluciones de gradiente de densidad. También se mostraron los ovocitos de E. necatrix (Figura 3A)y E. tenella (Figura 3B)después de nucleofectar los merozoites o esporozoitos. La eficiencia de transfección de los ovocitos de primera generación después de nucleofectar los esporozoitos es de aproximadamente 3-10%, en general. Sin embargo, después de nucleofectar los merozoitos, la eficiencia de transfección de los ovocitos de segunda generación es de sólo unas milésimas (no se pudo calcular la eficiencia de transfección de los ovocitos de primera generación).
Figura 1: Purificación de esporozoítos. (A) Purificar los esporozoitos a través de la centrifugación de densidad-gradiente con soluciones de gradiente de densidad. (B) Purificar los esporozoitos a través de la columna DE-52-celulosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los meronts y merozoites de2a generación de E. necatrix junto con los esporocistos y esporozoítos de E. tenella. (A) Meronts maduros de2a generación de E. necatrix. (B) Los merozoites liberados de2a generación de E. necatrix. (C) Esporocistos de E. tenella después de la purificación. (D) Esporozoitas E. tenella después de la purificación. La barra de escala es de 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los ovocitos obtenidos después de infectar con los menozoitas o esporozoitas nucleofected. (A) Los ovocitos de E. necatrix después de infectar con los merozoites nucleofected. (B) Los ovocitos de E. tenella después de infectar con esporozoitos nucleofected. La barra de escala es de 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Búfer | Composición |
| Tampón de digestión | 0,25 g de trippsina, 0,5 g de taurodesoxicolato de sodio hidrato, 100 ml de PBS o HBSS |
| 0.1 M NaOH | 2 g de NaOH, 500 ml de agua |
| 0.1 M HCl | 4,3 ml de ácido clorhídrico concentrado, 500 ml de agua |
| Tampón eluyente de glicina | 0,75 g de glicina, 7,9 g de NaCl, 500 ml de agua |
| Búfer de excystation | 0.75% trippsina, 10% bilis de pollo, PBS |
| 1 solución de stock de gradiente DG (Percoll) | 90% 1 - Solución de stock de gradiente DG (Percoll), 10% PBS (10 X) |
| Búfer de nucleofección I | ATP-disódico 2 g, MgCl2-6H2O 1,2 g, 10 ml de agua |
| Zona de amortiguación II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glucosa 0,2 g, 500 ml de agua |
| *agua: agua destilada | |
Tabla 1: Composición de los búferes.
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Discussion
En la década de 1990, se desarrolló un sistema de transfección para parásitos apicomplexanos, y se utilizó para estudios sobre parásitos eimerianos. Recientemente, se llevó a cabo un transfectado estable en E. tenella8,9 y E. nieschulzi15. Logramos la transfección estable de E. necatrix transfectando merozoites de segunda generación11. La inoculación de esporozoitas transtrofadas de E. acervulina a través de la vena del ala resolvió la incapacidad de los esporozoitos de E. acervulina para ser inoculados a través de la ruta cloacal (Zhang et al., datos inéditos). Aquí, describimos un procedimiento de transfección detallado para ayudar a los investigadores a nucleofect eimerian parasites.
Estudios anteriores mostraron que era factible inyectar esporozoitas transfectóte según el lumen intestinal de los conejos en una laparotomía para la transfección estable in vivo de E. magna16 y E. intestinalis17. Según nuestra experiencia, hubo una mayor eficiencia al clasificar esporocistos por FACS en lugar de ovocitos. También hubo informes sobre la transfección de ovocitos no esporulados de E. maxima utilizando un sistema de pistola de genes o electroporación exitosa de ovocitos esporulados con EGFP-Ham-OTU ARN18,19. Por lo tanto, nuestros estudios futuros exploran la transfección de ovocitos o esporocistos para simplificar los procedimientos de transfección en los parásitos de Eimeria.
El éxito de la transfección en los parásitos eimerianos podría permitir que Eimeria modificada genéticamente se utilice como vehículos vacunales para transportar antígenos hetrólomos, como CjaA de C. jejuni13. Aunque la eficiencia de la transfección en Eimeria se ha mejorado significativamente, la tecnología de edición de genes sigue teniendo limitaciones en los parásitos eimerianos. Con el desarrollo de la transfección en Eimeria,la tecnología CRISPR/CAS9 en Eimeria (Hu et al., datos no publicados) podría conducir a la manipulación genética de Eimeria.
En conclusión, este protocolo proporciona un procedimiento detallado para la nucleofección en pollo Eimeria. La transfección de esporozoítos o merozoitos es valiosa para el estudio de la función génica en Eimeria.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFD0501200) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31572507, 31772728 y 31873007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
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