Summary
Qui, abbiamo fornito un metodo per ottenere una trasfezione stabile dei parassiti dell'Eimeria di pollo nucleofecting sporozoiti o merozoiti di seconda generazione. I parassiti eimeri geneticamente modificati che esprimono geni antigenici eterologi potrebbero essere usati come veicoli per la somministrazione di vaccini.
Abstract
La trasfezione è un processo tecnico attraverso il quale il materiale genetico, come il DNA e l'RNA a doppio filamento, vengono consegnati nelle cellule per modificare il gene di interesse. Attualmente, la tecnologia transgenica sta diventando uno strumento indispensabile per lo studio di Eimeria, gli agenti causali della coccidiosi nel pollame e nel bestiame. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata della trasfezione stabile nei parassiti emerici: purificazione e nucleofezione di sporozoiti o merozoiti di seconda generazione, e propagazione in vivo di parassiti trasmutati. Utilizzando questo protocollo, abbiamo raggiunto la trasfezione in diverse specie di Eimeria. Nel loro insieme, la nucleofezione è uno strumento utile per facilitare la manipolazione genetica nei parassiti emerici.
Introduction
Eimeria spp. provoca coccidiosi, che porta a notevoli perdite economiche nell'industria zootecnica e avicola. Anche se i farmaci anticcidi, e in una certa misura, attenuati i vaccini anticcidi, sono stati ampiamente utilizzati per il controllo della coccidiosi, ci sono ancora carenze per quanto riguarda la loro resistenza ai farmaci, i residui di farmaci e la potenziale diffusione di ceppi di vaccino che riacquistano la virulenza1. Con lo sviluppo della biologia molecolare, la trasfezione è diventata uno strumento vitale per studiare le funzioni genetiche, sviluppare nuovi vaccini e vagliare nuovi bersagli farmacologici per Eimeria.
Negli ultimi decenni, la trasfezione è stata applicata con successo per parassiti apicomplessi come Plasmodium e Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Uno studio condotto su z-gal come reporter per la trasfezione in E. tenella ha sperimentato tale lavoro in Eimeria7. La trasfezione di E. tenella8,9, E. mitis10ed E. acervulina (et al., dati inediti) ebbe successo nei polli. Recentemente, abbiamo raggiunto la trasfezione usando merozoiti di E. necatrix attraverso la nucleofezione11.
Gli studi hanno dimostrato che Eimeria che esprime un antigene eteologo ha il potenziale per essere sviluppata come vaccino ricombinante, come quelli che esprimono L'antigene A (CjaA) o l'interleumina di pollo 2 (chIL-2)12,13. Pertanto, questo protocollo descrive uno studio di nucleofezione di Eimeria spp. in polli. La procedura descrive la purificazione di sporozoiti o merozoiti, la nucleofezione con DNA plasmide, l'inoculazione cloasnica/iniezione endovenosa e la propagazione in vivo per aiutare i ricercatori ad avviare studi sui parassiti eimeria transgenici.
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Protocol
I polli per tutti gli esperimenti sugli animali sono stati ospitati e mantenuti secondo le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali delle Università Agricola della Cina e hanno seguito i principi guida internazionali per la ricerca biomedica che coinvolgono gli animali. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato di Animali da Laboratorio dell'Amministrazione di Pechino.
1. Estrazione e purificazione degli sporozoiti di Eimeria spp. (ad esempio, E. tenella)
- Rilascio di sporocisti
- Centrifuga 1 x 107oocisti spororati in soluzione di cromata di potassio (2,5%, m/v) a 2.300 x g per 5 min. Lavarli con PBS (soluzione buffer fosfato) tre volte.
- Risospendere i pellet con 1 mL di PBS e trasferirli in un tubo da 15 mL. Aggiungere un volume uguale di perline di vetro (1 mm x 1 mm di diametro gamma) e oscillare la sospensione dell'oocisti utilizzando un mixer vortice per rilasciare le sporocisti.
- Monitorare il rilascio di sporocisti in microscopia ogni minuto. Smettere di vortice quando più del 90% delle oocisti sono rotti.
NOTA: La maggior parte delle ovocisti (come E. tenella, E. necatrixed E. acervulina) sono stati interrotti dopo 1 min utilizzando il mixer vortice. - Trasferire la sospensione sporocisti in nuovi tubi da 1,5 mL e centrifugare a 1.600 x g per 5 min.
- Risospendere il precipitato con una soluzione di gradiente di densità del 50%, combinare in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 10.000 x g per 1 min.
NOTA: per la composizione del gradiente di densità, fare riferimento alla Tabella 1. Il gradiente di densità è un mezzo colloidale a base di silice, costituito da particelle di silice colloidali di 15-30 nm di diametro (23% w/w in acqua), che sono stati rivestiti con polivinylpyrrolidone (PVP).
- Rilascio di sporozoiti
- Risospendere il precipitato con il tampone di escissione (Tabella 1) e incubare in un bagno d'acqua a 42 gradi per 40-60 min per rilasciare le sporozoiti. Smettere di incubare quando più del 90% delle sporozoites vengono rilasciate. Quindi centrifugare a 600 x g per 10 min.
NOTA: Agitare i tubi una volta ogni 5 minuti durante l'escissione. - Risospendere la precipitazione con una soluzione di gradiente di densità del 55% del 55% e centrifugare a 10.000 x g per 1 min.
- Risospendere la precipitazione con 1 mL di PBS e contare gli sporozoiti utilizzando un emocitometro.
- Risospendere il precipitato con il tampone di escissione (Tabella 1) e incubare in un bagno d'acqua a 42 gradi per 40-60 min per rilasciare le sporozoiti. Smettere di incubare quando più del 90% delle sporozoites vengono rilasciate. Quindi centrifugare a 600 x g per 10 min.
2. Raccolta e purificazione dei merozoiti di E. necatrix
NOTA: utilizzare i polli da carne Arbor Acre di età compresa tra 7 e 14 d nell'esperimento. I polli senza coccidia (n. 3) sono stati inoculati con 2 x 105 ovociti di E. necatrix. A 109 h dopo l'infezione, gli uccelli sono stati sacrificati dalla lussazione cervicale. L'intestino è stato rimosso per la raccolta dei merozoiti di 2di maestra. Per diverse specie di Eimeria, c'era un tempo diverso per la raccolta dei merozoiti di secondagenerazione: E. necatrix a 109 h, ed E. tenella a 112 h post-inoculazione. Per la trafezione di E. necatrix,i merozoiti sono la scelta ottimale in quanto i secondi merozoiti sono facili da purificare.
- Collezione dei merozoiti di seconda generazione di E. necatrix
- Tagliare il pollo alla longitudine, dal gambo del tuorlo (al centro dell'intestino tenue) all'orifizio ileocecal, e lavarlo con PBS o HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) delicatamente tre volte in un piatto Petri.
- Tagliare l'intestino a pezzi di 0,5 cm x 0,5 cm e metterlo in un pallone conico con un buffer di digestione (Tabella 1). Collocare il flacone su un miscelatore magnetico a 37 gradi centigradi con una barra di agitazione per 30-60 min per rilasciare i merozoiti. Dopo 30 min di incubazione, monitorare il rilascio di merozoiti con esame microscopico ogni 5 min.
- Purificare i merozoiti filtrazione e centrifugazione.
- Filtrare le sospensioni contenenti merozoiti digeriti utilizzando quattro strati di garza14e centrifugare a 600 x g per 10 min.
- Dopo la centrifuga, scartare il supernatante contenente i detriti intestinali. Trasferire la precipitazione con merozoiti purificati a tubi da 1,5 mL.
- Risospendere la precipitazione con 1 mL di PBS e contare i merozoiti utilizzando un emocitometro.
3. Nucleofezione di merozoiti o sporozoiti
- Preparazione prima della nucleofezione dei parassiti
- Preparare circa 107 merozoiti o sporozoiti in un tubo. Se trasfecare i merozoiti, preparare 3-4 tubi.
- Preparare una quantità di DNA plasmide o frammento di PCR purificato maggiore o uguale a 10 g.
NOTA: Il plasmide utilizzato in questo studio contiene 2 geni: proteina fluorescente gialla avanzata (EYFP) e sintesi diidrofolata reducitto tiromidillatico derivata da Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15. - Preparare 25 U di enzima di restrizione. Se i plasmidi sono linearizzati, l'enzima di restrizione può migliorare l'efficienza della trasfezione. Se i plasmidi sono circolari, omettere l'enzima di restrizione.
- Preparare 85 l di buffer di nucleofezione: mescolare 20 l di buffer di nucleofezione I e 1 mL di buffer di nucleofezione II, e utilizzare una parte della soluzione. Il volume del buffer totale è 100.
- Nucleofezione
- Centrifugare la sporozoite o la sospensione di merozoite a 600 x g per 10 min. Poi scartare il super-natante.
- Nell'ordine seguente, aggiungere 85 l di buffer di trasfezione nucleare, 10 g di plasmide (frammento PCR) e 25 U di enzima di restrizione (di solito 5) nel tubo da 1,5 mL contenente sporozoiti o merozoiti.
- Trasferire la sospensione in una coppa di trasfezione nucleare. Metti la tazza in una scanalatura di trasferimento nucleare.
- Accendere il dispositivo di nucleofezione utilizzando il pulsante di accensione e selezionare la procedura di trasfezione U-033. Se il dispositivo di nucleofezione si avvia nella modalità Scelta programma libero, uscire da questa modalità premendo il pulsante X.
- Al termine del programma, premere il pulsante X del dispositivo di nucleofezione e sullo schermo dovrebbe essere visualizzato OK, a indicare che la nucleoflessione ha esito positivo.
- Aggiungere 0,5-1 mL di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)8 alla coppa di nucleofezione per fermare la reazione e trasferire la sospensione a tubo da 1,5 mL dopo aver miscelato delicatamente.
4. Inoculazione cloaca o iniezione endovenosa
- Inoculare i parassiti nucleofettati in polli vecchi di 7 giorni. Inoculare le merozoites di E. necatrix o le sporozoites di E. tenella attraverso il percorso cloacale, ma inoculare E. acervulina sporozoites tramite iniezione endovenosa. Inoculare circa 2 x 107 milioni di sporozoiti in ogni pollo, e incoluate merozoites 107 per ogni uccello.
5. Propagazione e smistamento FACS
- Raccogliere le oocisti dalle feci 5-9 giorni dopo l'inoculazione con sporozoiti trasmutati. Raccogliere le oocisti il terzo giorno dopo l'inoculazione con merozoiti trasmissi.
- Utilizzare lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) e 150 mg/kg di pirilatamina8 per aumentare successivamente il rapporto tra popolazione transgenica.
NOTA: Utilizzare la pirimethamina aggiungendola direttamente nel feed. Per un uso più conveniente, preparare pirrimethamina solubile in acqua. Sciogliere 1 g di pirithamina in 0,2 mL pf H2SO4 e 9,8 mL di pirrododone n-metilico (NMP), quindi aggiungere 1,5 mL di questa soluzione di stock in 1 L di acqua potabile per gli uccelli.
6. Purificazione facoltativa colonna
NOTA: Se sono necessari più sporozoiti o merozoiti puri, c'è un metodo opzionale che li purifica attraverso una colonna di cellulosa dietilaminoethyl-52 (DE-52 cellulosa).
- Preparare la colonna di cellulosa DE-52 con almeno un giorno di anticipo.
- Preparare il buffer eluente della glicina (tabella 1). Regolare il pH del buffer eluente di glicina da 7,6 a 8,0 e preriscaldato a 41 gradi centigradi.
- Aggiungere 2,5 g di cellulosa DE-52 alla colonna. Aggiungere acqua e ammollo durante la notte. Scartare il super-attardato.
- Aggiungere acqua e ammollo per 1 h. Scartare il supernatante.
- Aggiungere 0,1 M di NaOH e immergere per almeno 2 ore. Ripetere questo passaggio.
- Sostituire il supernatante con acqua. Dopo che la cellulosa si deposita completamente verso il basso (circa mezz'ora), ripetere questo passaggio.
- Scartare il supernatante, aggiungere 0,1 M HCl e immergere per almeno 2 ore. Ripetere questo passaggio.
- Scartare il supernatante e immergere la cellulosa due volte con tampone eluente di glicina.
- Misurare e regolare il pH da 7,6 a 8,0 aggiungendo 0,1 M HCl o 0,1 M NaOH.
NOTA: In questa parte, il liquido ha almeno 5 volte più volume di quello della cellulosa DE-52.
- Regolare la portata tra 40-50 r/min.
- Quando la sedimentazione della cellulosa è completata, aggiungere la sporozoite o la sospensione della merozoite alla colonna cromatografica. Regolare la portata a 30-40 r/min.
NOTA: Risospendere la sporozoite o la precipitazione di merozoite con tampone eluente di glicina prima di aggiungere la colonna cromatografica. - Raccogliere con tampone eluente di glicina in tubi da 50 mL. Interrompere la raccolta in base ai risultati dell'esame microscopico di sporozoiti o merozoiti durante il processo di eluizione.
- Centrifugare il buffer eluente di glicina raccolto a 600 x g per 10 min. Trasferire la precipitazione sporozoite o merozoite a nuovi tubi da 1,5 mL.
- Contare gli sporozoiti o i merozoiti usando un emocitometro.
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Representative Results
Questo protocollo è stato utilizzato per trasfect parassiti eimeri. In questo studio, le merontes di 2nd generazione e merozoites di E. necatrix sono stati mostrati in Figura 2A e Figura 2B, mentre Figura 2C e Figura 2D ha mostrato le sporocisti e sporozoites di E. tenella dopo aver utilizzato le soluzioni di gradiente di densità. Sono state mostrate anche le oocisti di E. necatrix (Figura 3A) ed E. tenella (Figura 3B) dopo il nucleofecting dei merozoiti o degli sporozoiti. L'efficienza di trasfezione delle oocisti di prima generazione dopo il nucleofecting delle sporozoiti è di circa il 3-10%, in generale. Tuttavia, dopo il nucleofecting dei merozoiti, l'efficienza della trasfezione delle oocisti di seconda generazione è solo di pochi millesimi (impossibilità non essere calcolata l'efficienza della trasfezione delle oocisti di prima generazione).
Figura 1: Purificazione delle sporozoiti. (A) Purificare le sporozoites attraverso la centrifugazione densità-gradiente con soluzioni di gradiente di densità. (B) Purificare gli sporozoiti attraverso la colonna DE-52-cellulosa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Le meronte s.p.a. diseconda generazione e merozoites di E. necatrix insieme alle sporocisti e sporozoiti di E. tenella. (A) Maturo 2nd generazione meronts di E. necatrix. (B) I merozoiti di 2di a. generazione rilasciati di E. necatrix. (C) Sporocisti di E. tenella dopo la purificazione. (D) Sporozoites E. tenella dopo la purificazione. La barra della scala è di 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le oocisti ottenute dopo aver infettato con i merozoiti nucleofettati o sporozoiti. (A) Le oocisti di E. necatrix dopo aver infettato con i merozoiti nucleofettati. (B) Le ovocisti di E. tenella dopo aver infettato con sporozoiti nucleofettati. La barra della scala è di 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer | Composizione |
| Buffer di digestione | 0,25 g di triassina, 0,5 g di idrato di sodio taurodeoxycholate, 100 ml PBS o HBSS |
| 0,1 M NaOH | 2 g Di NaOH, 500 ml di acqua |
| 0,1 M HCl | 4,3 ml di acido cloridrico concentrato, 500 ml di acqua |
| Buffer eluente di glicina | 0,75 g di glicina, 7,9 g di NaCl, 500 ml di acqua |
| Buffer di esquistazione | 0,75% trypsin, 10% di bile di pollo, PBS |
| 1 - Soluzione di sfumato DG (Percoll) | 90% 1 soluzione di sfumato DG (Percoll), 10% PBS (10 X) |
| Buffer di nucleofezione I | ATP-disodio 2 g, MgCl2-6H2O 1,2 g, 10 ml di acqua |
| Buffer di nucleofezione II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glucosio 0,2 g, 500 ml di acqua |
| Acqua: acqua distillata | |
Tabella 1: Composizione dei buffer.
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Discussion
Negli anni '90, è stato sviluppato un sistema di trasfezione per i parassiti apicomplessi, ed è stato utilizzato per studi sui parassiti eimeri. Recentemente, la trasfezione stabile è stata condotta in E. tenella8,9 e E. nieschulzi15. Abbiamo raggiunto la trasfezione stabile di E. necatrix traducendo merozoiti di seconda generazione11. L'inoculazione delle sporozoiti trasfette di E. acervulina attraverso la vena alare risolse l'incapacità delle sporozoite di E. acervulina di essere inoculata attraverso la via cloacale (dati inediti). Qui, abbiamo descritto una procedura di trasfezione dettagliata per aiutare i ricercatori parassiti eimeri nucleofect.
Studi precedenti hanno dimostrato che era possibile iniettare sporozoiti trafetti nel lume intestinale dei conigli in una laparotomia per la trasfezione stabile in vivo di E. magna16 ed E. intestinalis17. Secondo la nostra esperienza, c'era una maggiore efficienza durante lo smistamento sporocisti da FACS invece di oocisti. Ci sono stati anche rapporti sulla trasfezione di oocisti unsporulati di E. maxima utilizzando un sistema di pistola genica o l'elettroporazione di successo di oocisti sporulati con eGFP-Ham-OTU RNA18,19. Così, i nostri studi futuri esplorano la trasfezione di oocisti o sporocisti per semplificare le procedure di trasfezione nei parassiti dell'Eimeria.
Il successo della trasfezione nei parassiti emerici potrebbe consentire all'Eimeria geneticamente modificata di essere utilizzata come veicoli vaccinali per trasportare antigeni eterologi, come CjaA da C. jejuni13. Anche se l'efficienza della trasfezione in Eimeria è stata notevolmente migliorata, la tecnologia di editing genico continua ad avere limitazioni nei parassiti emerici. Con lo sviluppo della trasfezione in Eimeria, la tecnologia CRISPR/CAS9 in Eimeria (Hu et al., dati inediti) potrebbe portare alla manipolazione genetica di Eimeria.
In conclusione, questo protocollo fornisce una procedura dettagliata per la nucleofezione nel pollo Eimeria. La trasfezione di sporozoiti o merozoiti è preziosa per lo studio della funzione genica in Eimeria.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2017YFD0501200) e dalla National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 e 31873007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, Office for official publications of the European communities. Luxembourg. 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
