Summary
Démontré ici est une méthode efficace et rentable pour purifier, la culture, et différencier les cellules souches de matière blanche du cervelet de souris postnatale.
Abstract
La plupart des neurones cérébellaires proviennent de deux niches souches embryonnaires : une niche rhombique pour les lèvres, qui génère tous les neurones glutamatergiques excitatoires cérélotés, et une niche de zone ventriculaire, qui génère les cellules inhibitrices de Purkinje GABAergic, qui sont des neurones qui constituent les noyaux cérébellaires profonds et les gliax de Bergman. Récemment, une troisième niche de cellules souches a été décrite qui se présente comme une zone germinale secondaire de la niche de zone ventriculaire. Les cellules de cette niche sont définies par le marqueur de surface cellulaire prominin-1 et sont localisées à la matière blanche en développement du cervelet postnatal. Ce créneau explique la couche moléculaire défunte GABAergic interneurons avec les astrocytes cérébellaires générés par la postnaline. En plus de leur rôle de développement, ce créneau gagne en importance translationnelle en ce qui concerne son implication dans la neurodégénérescence et la tumorigenesis. La biologie de ces cellules a été difficile à déchiffrer en raison d’un manque de techniques efficaces pour leur purification. Les méthodes efficaces pour purifier, culture et différencier ces cellules souches cérébellaires postnatales sont démontrées ici.
Introduction
Le cervelet a longtemps été reconnu comme un circuit neuronal majeur coordonnant le mouvement volontaire1. Il reçoit l’apport des larges pans des neuroaxis, qui comprend des informations proprioceptives de la périphérie, afin de régler finement la sortie du moteur et coordonner le mouvement. Plus récemment, il a également été impliqué dans la régulation de la cognition et des émotions en utilisant potentiellement des réseaux similaires de traitement de l’information2,3,4.
Le cervelet adulte est composé d’un cortex cérébellaire externe et de matière blanche intérieure. Entrecoupés dans ces structures sont des noyaux intracerebellaires profonds. Semblable au reste du système nerveux, le développement du cervelet est entraîné par la prolifération des cellules progénitrices multipotentes (cellules souches) qui migrent et se différencient pour donner cette structure bien organisée. Dans le développement précoce (E10.5-E13.5), une niche de tige ventriculaire autour du quatrième ventricule en développement génère des neurones GABAergic (c.-à-d. cellules Purkinje, cellules Lugaro, cellules Golgi) avec Bergmann glia5,6,7,8.
Plus tard dans le développement (semaine postnatale un), une deuxième niche de cellules souches dans la lèvre rhombique génère MATH1- et Nestin-exprimant les ancêtres qui donnent lieu à des neurones granule excitatoires9,10,11,12. Récemment, une troisième niche de cellules souches a été décrite13. Ces cellules expriment la prominine-1 (également connu sous le nom de CD133), une glycoprotéine couvrant la membrane qui définit un sous-ensemble de cellules souches dans l’intestin et les systèmes hématopoïétiques14,15,16. La cartographie du destin in vivo montre que ces cellules souches génèrent des interneurons de couches moléculaires clés (c.-à-d. les cellules de panier et les cellules de stellate), ainsi que les astrocytes, pendant les trois premières semaines postnatales. Dans le passé, il a été difficile d’étudier ces cellules in vitro parce que les méthodes antérieures ont exigé des techniques coûteuses et chronophages (c.-à-d., le tri cellulaire activé par la fluorescence [FACS]) qui dépendent de la coloration de prominine-112,13,17. Ce protocole décrit une méthode immunomagnétique-basée pour l’isolement de ces cellules souches qui peuvent alors être facilement cultivées et différenciées.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (2011) et ont été approuvées par l’IACUC de l’Université northwestern (Protocole IS00011368).
1. Préparation des solutions
- Préparer la solution de dissociation tissulaire faite à partir de phénol stérile contenant du dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) avec papain (100 U/ml), cystéine (0.2 mg/ml) et DNase (250 U/ml).
- Pour préparer la solution DNase, diluez 100 mg de la poudre lyophilisée de DNase I (une bouteille) dans 50 ml de H2O. Bien mélanger et filtrer la solution de stock. Préparer les aliquots de 10 mL. Diviser un tube de stock en aliquots à usage unique de 0,5 mL. Entreposez ces aliquots à usage unique à -80 oC.
- Préparer les réactifs de séparation magnétique en préparant la colonne magnétique tampon X: 0,5% albumin de sérum bovin (BSA) et 2 mM EDTA solution.
- Pour préparer les milieux de la neurosphère, utilisez un milieu neurobasal contenant de la pénicilline/streptomycine avec de la L-glutamine et complétez avec 2 % de B27, 20 ng/mL facteur de croissance épidermique récombinante humaine (EGF) et 20 ng/mL humain recombinant facteur de croissance fibre de base (bFGF).
- Pour préparer un support de différenciation, utilisez le milieu neurobasal et complétez avec 10 ng/mL facteur de croissance différencié de facteur plaqué(CCIF-AA) ou 10 ng/mL facteur inhibiteur de leucémie (LIF) et 2% B27.
- Utilisez une fixation ultra-faible 12 puits (3,5 cm2)et 6 plaques de culture de puits (9,6 cm2).
2. Dissection de Cérebellum
- Anesthésiez les chiots de souris (P3-P7) avec l’isoflurane et décapiter à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- Vaporiser la tête séparée des chiots avec 70% d’éthanol.
- Transférer chaque tête dans un plat de culture stérile vide de 10 cm. Séparer la peau à l’aide des ciseaux de microdissection, puis enlever le crâne en exécutant les ciseaux sagittal le long de la ligne médiane.
- À l’aide de #7 forceps, décollez les os du crâne à partir de caudally du tronc cérébral. Soulevez soigneusement le cerveau à l’aide d’une spatule, en gardant le cervelet intact, et transférez le cerveau dans un plat de 10,0 cm stérile frais contenant 15 ml de solution de sel équilibré (HBSS) glacée.
- Placer le plat contenant le cerveau sous un microscope à dissection. À l’aide de forceps #5 fins, retirez les méninges et les grands vaisseaux sanguins du cervelet et séparez le cervelet du tronc cérébral à l’aide de la spatule.
- Transférer le cervelet dans un tube de centrifugeuse de 15 ml contenant 5,0 ml de solution HBSS glacée. Laver le cervelet en rinçant et en décantantantantantantantant 3x avec 5,0 ml de HBSS.
REMARQUE: Chaque cervelet doit être placé dans son propre tube pour un traitement ultérieur.
3. Préparation de suspension cellulaire
- Après le dernier rinçage, ajouter 5 ml de solution de dissociation tissulaire à base de papain (basée sur les travaux précédents13,18) qui a été pré-réchauffé à 37 oC. Incuber le tissu pendant 15 min à 37 oC dans un bain d’eau. Mélanger lentement le contenu en inversant le tube de haut en bas de 3x à 5x toutes les 3 minutes soit à l’aide d’un mélangeur à noix ou à la main.
- Préparer un large diamètre (pipette en verre ordinaire) et une pipette Pasteur de diamètre étroit (polie par le feu par chauffage sur un brûleur Bunsen) comme décrit précédemment19.
- Laver le tissu 3x avec 5 ml de solution HBSS, en évitant la perte du tissu tout en décantantantant à la main.
- Retirez le dernier lavage HBSS et ajoutez 5 ml de solution DPBS contenant 250 L de solution DNase au tissu. Dissociez le tissu en triturant 10x-15x à l’aide de la pipette Pasteur de grand diamètre. Effectuez cette étape doucement pour éviter la formation de bulles.
- Puis incuber la boue pendant 10 minutes supplémentaires à 37 oC dans le bain d’eau, en mélangeant en inversant et en redressant le tube.
- Utilisez la pipette Pasteur de diamètre réduit pour triturer davantage la boue tissulaire 10x. S’il reste de gros morceaux de tissu, appuyez doucement sur les morceaux de tissu contre le fond du tube avec la pointe de la pipette et continuez à canalisation jusqu’à ce que les cellules atteignent une suspension fine.
- Incuber le tissu à 37 oC pendant 10 minutes supplémentaires, répétant les étapes de mélange précédentes.
4. Immunolabeling des cellules souches
- Placez les tubes de centrifugeuse sur la glace et utilisez des solutions glacées pour les prochaines étapes. Filtrer les cellules dissociées à l’intermédiaire d’une passoire cellulaire de 40 m dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Garnir le filtre de 10,0 ml de solution HBSS pour s’assurer que les cellules passent à travers le maillage dans cette solution supplémentaire.
- Transférer les cellules filtrées dans un tube de centrifugeuse frais de 15 ml et centrifugeuse la suspension cellulaire à 300 x g pendant 10 min à 4 oC. Aspirez et jetez complètement le supernatant à l’aide d’un aspirateur à vide.
- Réutilisez la pastille dans 160 L de tampon de colonne magnétique. Pour obtenir la suspension à cellule unique avant l’étiquetage magnétique, passez les cellules à travers un maille en nylon de 30 m pour enlever les amas cellulaires, qui peuvent autrement obstruer la colonne.
- Ajouter 40 l de microbilles anti-prominin-1 à chaque tube de 15 ml, mélanger et incuber dans un réfrigérateur pendant 15 minutes afin que l’anticorps se lie à des cellules prominin-1-exprimant.
- Laver les cellules en ajoutant 1,0 à 2,0 ml de colonne tampon X et centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min. Aspirer complètement le supernatant.
- Réutilisez la granule dans 1,0 ml de tampon de colonne X.
REMARQUE: Si de petits amas sont vus après la résuspension de granules avec 1,0 ml de tampon de colonne X, ils doivent être enlevés soigneusement à l’aide d’une pointe de la pipette Pasteur, sinon ces amas peuvent bloquer la colonne magnétique pendant le tri cellulaire.
5. Préparation de colonne magnétique, tri cellulaire et plating
REMARQUE: La séparation magnétique des différentes conditions de génotype (maladie vs contrôle) doit être effectuée en même temps, puisque tout retard peut affecter la morphologie de la néurosphère.
- Préparer les colonnes magnétiques en les plaçant sur le support magnétique exposé au champ magnétique. Rincer la colonne une fois avec 500 L de tampon X en appliquant tampon qui goutte à goutte dans un tube de centrifugeuse à jeter.
REMARQUE: Préparer le tampon de colonne magnétique nouvelle X pour chaque expérience ; sinon, le rendement des cellules souches sera faible. - Appliquer la suspension de cellule étiquetée sur la colonne. Recueillir le flowthrough contenant des cellules non étiquetées qui se composent principalement de cellules mixtes neuronales/glial cérélotées dans des tubes frais de 15 ml(figure 1A).
- Laver la colonne 3x avec 500 L de tampon X (chaque lavage prend environ 2-4 min).
REMARQUE: La culture neuronale/glial mixte cérébellaire enrichie de neurones granulaires cérébellaires peut servir de sous-produit utile de cette étape de purification. - Retirez la colonne du champ magnétique et placez-la dans un tube de 1,5 mL. Ajoutez 1,0 ml de milieu de culture (milieu de neurosphère) à la colonne et poussez le piston dans la colonne pour éliminer les cellules étiquetées avec des perles de prominine-1 dans un nouveau tube de faucon de 1,5 mL.
- Pour améliorer la pureté des cellules étiquetées prominine-1, passez les cellules elfées sur une deuxième colonne suivant les étapes 5.1-5.4.
- Comptez les cellules avec un hémocytomètre. Le rendement typique est de 107 cellules par cervelet. Plaquez les cellules sur des plaques d’attachement ultra-faibles (6 ou 12 puits, en fonction de la densité requise pour les expériences en aval).
6. Passaging des Neurosphères et de la différenciation
- Plaquez les cellules souches à étiquette prominine-1 sur un attachement ultra-faible 12 plaques de puits dans un milieu de neurosphère (5 000 cellules/puits).
- Après 7 à 10 jours, les cellules se divisent pour donner des neurosphères flottantes en forme de boule (neurosphères primaires).
REMARQUE: Dans cette expérience, les neurosphères secondaires qui se développent en nombre sont générées pour une utilisation ultérieure. Les populations primaires de neurosphère ne sont pas utilisées pour ces expériences, car elles peuvent contenir des cellules contaminantes qui n’ont pas de propriétés de cellules souches et peuvent s’agglutiner avec les néurosphères. - Pour passer, transférer les neurosphères primaires avec les supports de culture à l’aide de pointes de pipette de 1,0 ml à un tube de centrifugeuse stérile de 15 mL. Pellet les neurosphères par centrifugation à 300 x g pendant 5 min et jeter le supernatant.
- Résuspendez la pastille dans 5 ml de support de dissociation tissulaire qui contient de la papaine ou une solution de trypsine de 0,05%. Incuber à 37 oC pendant 10 min.
- Centrifuge la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min. Resuspendez les cellules dans 5 ml de milieu de néurosphère et dissociez mécaniquement les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et en descendant lentement 10x.
- Plaquez les cellules (encore) dans les médias de neurosphère comme décrit plus tôt. Après 7 à 10 jours en culture, la plaque doit être enrichie de neurosphères secondaires.
REMARQUE: Ces cultures peuvent être adoptées jusqu’à 8x avec une bonne efficacité, après quoi la taille de la néurosphère tend à être plus petite et suggestive d’une diminution de la prolifération. - Comptez les cellules sur l’hémocytomètre et plaquez le nombre optimal pour de futures expériences sur des plaques enduites de poly-D-lysine (6 ou 12 puits).
- Pour différencier les cellules souches, recueillir des neurosphères du deuxième au huitième passage par centrifugation comme décrit précédemment, sauf ajouter le milieu de différenciation à la pastille.
REMARQUE: Après 7 jours in vitro, les cellules souches se différencient en neurones, astrocytes, et oligodendrocytes, comme démontré par la coloration avec le marqueur neuronal '-III tubulin, marqueur astrocytique GFAP, et fabricant d’oligodendrocyte O4.
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Representative Results
Les cellules souches cérébellaires postnatbellaires prominin-1-positives ont formé des neurosphères dans le milieu de la neurosphère riche en facteurs de croissance (EGF et bFGF). Ces neurosphères étaient positives pour la prominine-1-coloring, le marqueur utilisé pour l’isolement, et aussi comme une tache pour d’autres marqueurs de cellules souches tels que Nestin et GFAP13 (figure 1). L’expression du marqueur de cellules souches a été maintenue dans toute la culture et jusqu’à au moins huit passages20. Lors du retrait des facteurs de croissance et de la présence de LIF et DE PDGF-AA (qui sont des facteurs qui soutiennent la différenciation neuronale et gliatale21,22), les neurosphères différenciées en lignées neuronales et gliales(figure 2).
Figure 1 : Isolement des cellules souches prominin-1 du cervelet postnatal. (A) Les cellules souches cérébellaires ont été isolées à l’aide de perles immunomagnétiques de prominine-1. Panneau supérieur : Les cellules souches purifiées (liées à la colonne) ont formé des néurosphères avec une prolifération étendue et des propriétés d’auto-renouvellement. Les cellules non reliées à la colonne (flowthrough) n’ont pas pu former de neurosphères; au lieu de cela, ils sont devenus des cellules neuronales/glial mixtes cérébellaires (tubulin/GFAP). Panneau inférieur : les neurosphères formées à partir de cellules prominin-1- exprimant des marqueurs spécifiques aux cellules souches : Nestin, prominin-1 et GFAP. (B) Cellules dans le négatif taché de coulée pour les marqueurs de cellules souches prominin-1 et nestin et positives pour le marqueur neuronal '-III tubulin. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Différenciation des néurosphères positives prominin-1. En présence de facteurs de différenciation (PDGF-AA ou LIF), les néurosphères prominin-1 positives se sont différenciées en neurones (tubuline III), astrocytes (GFAP) et oligodendrocytes (O4). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les cellules souches cérébellaires prominin-1-exprimant résident dans la matière blanche prospective pendant les 3 premières semaines de la vie postnatale. Leur prolifération est étroitement contrôlée par la voie sonore hérisson soutenu par les cellules Purkinje17. Ces cellules souches/progéniteurs contribuent à des interneurons GABAergic nés plus tard appelés cellules de panier et cellules de stellate. Ces interneurons résident dans la couche moléculaire, où ils synapse sur les cellules Purkinje et sculptent la topographie pc et la fonction via l’inhibition GABAergique13,17,23. En plus de former des interneurons, cette population de cellules souches génère également tous les astrocytes cérébellaires dérivés postnatalementdérivés 17,24.
Ce protocole décrit une méthode facile et rentable pour purifier les cellules souches prominin-1/CD133 du cervelet de souris postnatale. Les cellules souches doivent être cultivées dans des plaques d’attachement ultra-faibles. La culture de ces cellules souches dans les plaques normales peut causer l’attachement des néurosphères à la surface et conduire à une faible prolifération et une différenciation des cellules souches. Ici, le rendement de 200 à 300 neurosphères pour 5 000 cellules correspond à un rendement des cellules souches d’environ 1 x 107 cellules d’un seul cervelet. Cela est comparable à ce qui a été décrit pour une stratégie basée sur le FACS qui est 10x plus cher. De plus, l’équipement FACS nécessite un équipement coûteux et hautement qualifié, et n’est pas facilement disponible.
Ces cellules souches gagnent également une importance translationnelle croissante dans la recherche sur le cancer ainsi que les troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs25,26,27. La prolifération incontrôlée de ces cellules souches au début de la vie conduit au médulloblastome28, tandis que la recherche de notre propre laboratoire suggère que leur prolifération anormale et leur différenciation peuvent contribuer à la dégénérescence cérébellaire ultérieure dans la maladie génétique spinocerebellar ataxia type 120. Ces nouveaux protocoles seront utiles pour l’étude de ces cellules et fourniront un aperçu nouveau de leur rôle dans la santé et la maladie. Ces méthodes peuvent également mener à des progrès dans les thérapies régénératives après un accident vasculaire cérébral ou un traumatisme et d’autres insultes au cerveau qui justifieraient la neurorégénérescence. Il est concevable que ces techniques puissent être généralisées pour extraire des cellules souches prominine-1-exprimant d’autres tissus, tels que l’intestin et la moelle osseuse, où elles sont également exprimées15,29.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts n’est déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du laboratoire Opal pour leurs suggestions. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH 1RO1 NS062051 et 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2 mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Culture plates ultra - low attachment | Corning | 3473 | |
| Cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/mL |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/mL |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/mL) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/mL |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 μm |
References
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