Summary
In-vitro-Modelle der koronaren Angiogenese können für die Entdeckung der zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese verwendet werden. In-vitro-Explantationskulturen von Sinusvenosus und Endokardgewebezeigen weisen als Reaktion auf VEGF-A ein robustes Wachstum auf und weisen ein ähnliches Muster der COUP-TFII-Expression auf wie in vivo.
Abstract
Hier beschreiben wir einen In-vitro-Kulturtest zur Untersuchung der koronaren Angiogenese. Herzkranzgefäße ernähren den Herzmuskel und sind von klinischer Bedeutung. Defekte in diesen Gefäßen stellen schwere Gesundheitsrisiken dar, wie z. B. bei Arteriosklerose, die bei Patienten zu Herzinfarkten und Herzinsinnen führen kann. Folglich ist die koronare Herzkrankheit eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Trotz seiner klinischen Bedeutung wurden relativ wenig Fortschritte bei der Regenerierung beschädigter Herzkranzgefäße erzielt. Dennoch wurden in jüngster Zeit Fortschritte beim Verständnis des zellulären Ursprungs und der Differenzierungswege der Entwicklung von Koronaren erzielt. Das Aufkommen von Werkzeugen und Technologien, die es Forschern ermöglichen, Vorläuferzellen fluoreszierend zu kennzeichnen, ihrem Schicksal zu folgen und Progenies in vivo zu visualisieren, hat entscheidend dazu beigetragen, die Entwicklung des koronaren Gefäßes zu verstehen. In-vivo-Studien sind wertvoll, haben aber Einschränkungen in Bezug auf Geschwindigkeit, Zugänglichkeit und Flexibilität im experimentellen Design. Alternativ können genaue In-vitro-Modelle der koronaren Angiogenese diese Einschränkungen umgehen und es Forschern ermöglichen, wichtige biologische Fragen mit Schnelligkeit und Flexibilität zu hinterfragen. Das Fehlen geeigneter In-vitro-Modellsysteme könnte den Fortschritt beim Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen des koronaren Gefäßwachstums behindert haben. Hier beschreiben wir ein In-vitro-Kultursystem zum Anbau von Herzkranzgefäßen aus dem Sinus venosus (SV) und dem Endokard (Endo), den beiden Vorläufergeweben, aus denen viele der Herzkranzgefäße entstehen. Wir bestätigten auch, dass die Kulturen einige der bekannten In-vivo-Mechanismen genau rekapitulieren. Zum Beispiel zeigen wir, dass die angiogenen Sprossen in der Kultur von SV DEN COUP-TFII-Ausdruck ähnlich dem, was in vivo beobachtet wird, herunterregulieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass VEGF-A, ein bekannter angiogener Faktor in vivo, die Angiogenese sowohl aus der SV- als auch aus der Endo-Kultur robust stimuliert. Gemeinsam haben wir ein genaues In-vitro-Kulturmodell entwickelt, um die koronare Angiogenese zu untersuchen.
Introduction
Blutgefäße des Herzens werden gemeinhin als Herzkranzgefäße bezeichnet. Diese Gefäße bestehen aus Arterien, Venen und Kapillaren. Während der Entwicklung werden zunächst stark verzweigte Kapillaren etabliert, die sich dann in Herzkranzgefäße und Venen1,2,3,4,5umbauen. Diese anfänglichen Kapillaren werden aus endothelialen Vorläuferzellen im Proepikardien, Sinusvenosus (SV) und Endokardgewebe (Endo)1,6,7,8. SV ist das Zuflussorgan des embryonalen Herzens und Endo ist die innere Auskleidung des Herzlumens. Endotheliale Vorläuferzellen, die in der SV und Endo gefunden werden, bilden die Mehrheit der koronaren Vaskulatur, während das Proepikardie zu einem relativ kleinen Teildavon2 beiträgt. Der Prozess, durch den das Kapillarnetz der Herzkranzgefäße im Herzen aus seinen bereits existierenden Vorläuferzellen wächst, wird als koronare Angiogenese bezeichnet. Koronare Herzkrankheit ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit und dennoch fehlt eine wirksame Behandlung für diese Krankheit. Das Verständnis der detaillierten zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese kann bei der Entwicklung neuartiger und effektiver Therapien zur Reparatur und Regenerierung beschädigter Herzkranzgefäße nützlich sein.
In jüngster Zeit wurde durch die Entwicklung neuer Werkzeuge und Technologien ein Anstieg unseres Verständnisses für die Entwicklung von Herzkranzgefäßen erreicht. Insbesondere die In-vivo-Linienkennzeichnung und fortschrittliche Bildgebungstechnologien waren sehr nützlich bei der Aufdeckung des zellulären Ursprungs und der Differenzierungswege von Herzkranzgefäßen9,10,11,12. Trotz der Vorteile dieser In-vivo-Tools gibt es Einschränkungen in Bezug auf Geschwindigkeit, Flexibilität und Zugänglichkeit. Daher können robuste In-vitro-Modellsysteme In-vivo-Systeme ergänzen, um die zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese in einer Art und Weise mit hohem Durchsatz aufzuklären.
Hier beschreiben wir ein In-vitro-Modell der koronaren Angiogenese. Wir haben ein In-vitro-Explantenkultursystem entwickelt, um Herzkranzgefäße aus zwei Vorläufergeweben, SV und Endo, anzubauen. Mit diesem Modell zeigen wir, dass die In-vitro-Gewebeexplantationskulturen koronare Gefäßsprossen wachsen, wenn sie durch Wachstumsmedium stimuliert werden. Zusätzlich wachsen die Explant-Kulturen schnell im Vergleich zur Kontrolle, wenn sie durch den vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor A (VEGF-A), ein hochwirksames angiogenes Protein, stimuliert werden. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die angiogenen Sprossen aus der SV-Kultur venös dedifferenziert werden (Verlust der COUP-TFII-Expression), ein Mechanismus ähnlich der SV-Angiogenese in vivo1. Diese Daten deuten darauf hin, dass das In-vitro-Explantenkultursystem angiogene Ereignisse, die in vivo auftreten, originalgetreu wieder einführt. Zusammen genommen sind In-vitro-Modelle der Angiogenese, die hier beschrieben werden, ideal für die Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen der koronaren Angiogenese in einer hohen Durchsatz- und zugänglichen Weise.
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Protocol
Die Verwendung aller Tiere in diesem Protokoll folgte den Richtlinien des Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Etablierung von Mauszüchtern und Erkennen von Vaginalsteckern für zeitgedauerte Schwangerschaften
- Richten Sie einen Mäusezuchtkäfig mit wilden männlichen und weiblichen Mäusen ein. Stellen Sie sicher, dass das Alter der Zuchtmäuse zwischen 6-8 Wochen liegt. Richten Sie entweder ein Paar (1 Männchen und 1 Hündin) oder als Trio (1 Männchen und 2 Hündin) für die Zucht ein.
- Überprüfen Sie am nächsten Morgen einen Vaginalstecker. Verwenden Sie eine abgewinkelte Metallsonde, um einen tiefen Stecker zu erkennen, indem Sie ihn in die vaginale Öffnung einsetzen. Bezeichnen Sie den Morgen eines positiven Vaginalsteckers als embryonalen Tag 0.5 (e0.5).
HINWEIS: Ein Vaginalstecker kann entweder oberflächlich (leicht sichtbar, siehe Abbildung 1)oder tief (was nicht leicht sichtbar ist) sein. Das Vorhandensein eines tiefen Steckers blockiert das vollständige Einsetzen der Sonde, während das Fehlen eines Steckers ein vollständiges Einsetzen ohne Widerstand ermöglicht. - Halten Sie die zeitliche Schwangerschaft aufrecht, bis die Embryonen e11.5 erreichen, an dem sie geerntet werden. Um die Schwangerschaft vor der Ernte von Embryonen zu bestätigen, erfassen Sie das Gewicht weiblicher Mäuse zwischen e7.5 und e11.5.
HINWEIS: Die tägliche Erhöhung des Gewichts der Mutter deutet auf eine erfolgreiche Schwangerschaft hin, während keine Gewichtsänderung auf eine fehlgeschlagene Schwangerschaft hindeutet.
2. Ernte von Embryonen von schwangeren Mäusen
HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass sie über die folgenden Geräte und Reagenzien verfügen: eine CO2-Euthanasiekammer, 70 % Ethanol, Papiertücher, regelmäßige Zangen, feine Zangen, Scheren, 1x sterile Phosphat-gepufferte Kochstoffe (PBS), 10 cm sterile Petrischalen, Behälter mit Eis, perforierter Löffel, Dissektionsstereomikroskop.
- Legen Sie eine e11.5 schwangere Maus in eine saubere CO2 Euthanasiekammer, um sie zu opfern. Schließen Sie den Deckel der Kammer, um zu verhindern, dass die Maus entweicht.
- Nachdem die Maus in der Euthanasiekammer gesichert ist, schalten Sie CO2ein. Achten Sie darauf, denCo2-Durchfluss pro IACUC-Empfehlungen zu regulieren (d. h. 10-30% Verdrängung pro Minute). Nachdem die Maus vollständig eingeschläfert wurde, führen Sie zervikale Dislokation durch, um den Tod zu gewährleisten.
- Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut mit Zangen über den Bauch, machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer Schere und verlängern Sie den Schnitt seitlich. Vergrößern Den Schnitt vor dem Zwerchfell und entlarven das Gebärmutterhorn, das die Embryonen enthält (Abbildung 2).
- Ziehen Sie die Saite der Embryonen (Gebärmutterhorn + Embryonen) heraus, indem Sie die Gebärmutter greifen und frei schneiden. Legen Sie die Embryoneninin in eiskalte sterile 1x PBS.
- Sezieren Sie die einzelnen Embryonen aus dem Gebärmutterhorn, indem Sie den Gebärmuttermuskel, den Dottersack und das Amnion eins nach dem anderen abschälen (Abbildung 3A-F) unter einem Stereomikroskop. Übertragen Sie die gereinigten Embryonen mit einem perforierten Löffel in eine Petrischale, die sterile 1x PBS auf Eis enthält. Achten Sie darauf, die Embryonen kalt zu halten.
3. Isolierherzen von e11.5 Embryonen
HINWEIS: Vor Beginn stellen Sie sicher, dass Sie die folgenden Geräte und Reagenzien haben: regelmäßige Zange, feine Zange, 1x sterile PBS, 10 cm sterile Petrischale, 6 cm sterile Petrischale, Behälter mit Eis, perforierter Löffel, DissektionStereomikroskop.
- Richten Sie eine neue Petrischale mit eiskalten sterilen 1x PBS unter einem Stereomikroskop ein. Übertragen Sie einen Embryo aus Schritt 2.5 in die Petrischale, um das Herz zu sezieren.
- Entfernen Sie den Kopf des Embryos mit Zangen. Drücken Sie zunächst den Kopf mit einer Hand zwischen die Zange und entfernen Sie dann den Kopf, indem Sie ihn mit der anderen Hand mit geschlossenen Zangen wegkratzen (Abbildung 4A-C).
- Nach dem Entfernen des Kopfes, orientieren Sie den Embryo mit seiner ventralen Seite nach oben, indem Sie den Embryo mit Zange am Bauch mit einer Hand halten (Abbildung 4D).
- Mit der anderen Hand, öffnen Sie die Brustwand des Embryos, indem Sie zuerst einen kleinen Schnitt in der Brust leicht über dem Zwerchfell mit feinen Zangen. Dann vergrößern Sie den Schnitt sehr sorgfältig, indem Sie geschlossene Zangen einsetzen und die Brustwand durch Öffnen der Zange reißen. Achten Sie darauf, nicht zu tief zu stoßen, was das Herz schädigen kann. Mit Hilfe der Zange, halten Sie die Brustwand weit offen, um das Herz und die Lunge in der Brusthöhle auszusetzen (Abbildung 4E).
- Mit feinen Zangen bewegen Sie das Herz vorsichtig anterior (90°) und setzen Sie die dorsale Aorta/Vene aus. Ziehen Sie das Herz/die Lunge vordergründ heraus, indem Sie die dorsale Aorta/Vene an der Basis des Herzens erfassen (Abbildung 4F-H).
HINWEIS: Seien Sie sanft beim Herausziehen des Herzens/der Lunge, um ein Reißen des SV zu vermeiden, der sich an der Rückenseite des Herzens befindet. - Spülen Sie das Herz/die Lunge mit kalten 1x PBS, um Blutzellen zu entfernen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6, um das Herz/die Lunge von den verbleibenden Embryonen zu entfernen. Achten Sie darauf, das isolierte Herz/die Lunge auf Eis zu halten.
4. Isolieren von SVs und Ventrikeln von e11.5 Embryonale Mausherzen
- Platzieren Sie die Petrischale mit Herz/Lunge aus Schritt 3.7 unter einem Stereomikroskop, um die SVs und ganzen Ventrikel zu isolieren. Die angehängten Lungenlappen eins nach dem anderen mit feinen Zangen von der Wurzel abziehen.
- Richten Sie das Herz auf seiner Rückenseite aus und entfernen Sie Die vordergründigen Vorhöfe und das angrenzende Gewebe, das den SV vordergründ umgibt, ohne den SV zu zerreißen. Entfernen Sie die linke und rechte Vorstation aus dem Herzen, indem Sie an ihrer Basis halten und sie mit feinen Zangen abkratzen (Abbildung 5B). Entfernen Sie das benachbarte Gewebe, das den SV umgibt, mit einer ähnlichen Technik(Abbildung 5C).
HINWEIS: Denken Sie daran, dass das richtige Atrium an den SV angeschlossen ist, also achten Sie darauf, nur das Atrium zu entfernen. - Um den SV zu isolieren, orientieren Sie zuerst das Herz mit seiner Dorsalseite nach oben (weil der SV auf der Dorsalseite ist) und halten Sie das Herz noch in dieser Position, indem Sie das Herz sanft an seinen Ventrikeln mit Zangen halten.
HINWEIS: Der SV ist ein Zuflussorgan eines embryonalen Herzens, das zwischen den Vorhöfen auf der Rückenseite des Herzens liegt. - Entfernen Sie den SV, indem Sie ihn vorsichtig vom Herzen abschälen, wo er befestigt ist, oder indem Sie den SV mit feiner Zange an der Basis seiner Befestigung halten und ihn mit geschlossenen Zangen abkratzen (Abbildung 5D,E).
- Den isolierten SV mit einer sterilen Transferpipette in eine neue 6 cm Petrischale mit eiskalter steriler 1x PBS auf Eis geben und die Petrischale als SV kennzeichnen.
- Um die gesamten Ventrikel zu isolieren, entfernen Sie den Abflusstrakt (Aorta und Lungenstamm) aus dem Herzen, nachdem der SV entfernt wurde (Abbildung 5F,G).
- Die ganzen Ventrikel mit einer sterilen Transferpipette in eine neue 6 cm Petrischale mit sterilen 1x PBS auf Eis geben und die Petrischale als Ventrikel kennzeichnen. Halten Sie den isolierten SV und ventrikel auf Eis.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.7, um SVs und Ventrikel von den verbleibenden Herzen zu isolieren.
5. Einrichten von Tissue Culture Platten mit Einsätzen und extrazellulärer Matrixbeschichtung
HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass Sie folgende Geräte und Reagenzien haben: kommerzielle extrazelluläre Matrixlösung (ECM; z. B. Matrigel), 8,0 M Polyethylenterephthalat (PET) Kultureinsätze, 24 Wellplatten, 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
- Lassen Sie die ECM-Lösung auf Eis auftauen. Halten Sie die ECM-Lösung auf Eis, um eine Erstarrung zu vermeiden.
- Legen Sie die PET-Membrankultureinsätze (Porengröße = 8,0 m, Filtrationsfläche = 0,3 cm2, Filterdurchmesser = 6,5 mm) in die Brunnen der behandelten Nicht-Gewebekultur 24 Brunnenplatten. Beschriften Sie die Platten als SV oder Ventrikel für den SV bzw. die endokardialen Angiogenese-Assays.
HINWEIS: Richten Sie die Einsätze in separaten Platten für den SV und die Ventrikel ein, wenn beide Kulturen gleichzeitig ausgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Bohrungen für alle experimentellen Proben und Kontrollen einrichten. - Nachdem die ECM-Lösung aufgetaut ist, sofort ECM 1:2 in vorgekühltem Basalmedium (d.h. EBM-2-Basalmedium, siehe Materialtabelle)auf ein ausreichendes Volumen (100 l/Einsatz x Anzahl der Einsätze) verdünnen.
HINWEIS: Wenn es z. B. sechs Einsätze gibt, beträgt das Gesamtvolumen 100 l x 6 = 600 l. Fügen Sie 200 l ECM in 400 l Basalmedium hinzu. - Beschichten Sie die Einsätze mit 100 l frisch verdünntem ECM, indem Sie sie direkt auf die Membran legen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für mindestens 30 min, damit das ECM erstarren kann.
HINWEIS: Dies muss unter einer laminaren Strömungsgewebekulturhaube durchgeführt werden, um eine Kontamination zu vermeiden.
6. SVs und ganze Ventrikelkulturen
HINWEIS: Vor Beginn, stellen Sie sicher, die folgenden Geräte und Reagenzien zu haben: 70% Ethanol, Transferpipette, Stereomikroskop, Zange, laminare Flussgewebe Kultur Haube, mikrovaskuläre endotheliale Zelle Ergänzung Kit (Tabelle der Materialien), Basalmedium, 1x sterile PBS). Abbildung 6 zeigt den Arbeitsablauf der SV- und Ventrikelkultur.
- Den Inhalt des Ergänzungskits auf Eis auftauen. Bereiten Sie das komplette Medium vor, indem Sie den gesamten Inhalt des Ergänzungskits in 500 ml Basalmedium unter einer zertifizierten laminaren Strömungsgewebekulturhaube hinzufügen. Mischen Sie das Medium gut und verteilen Sie in 50 ml Aliquots.
- Sterilisieren Sie die Basis des Stereomikroskops und den umgebenden Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.
- Erhalten Sie die Gewebekulturplatten aus Schritt 5.4. Mit Hilfe einer Transferpipette die Expflanzen aus Schritt 4.7 vorsichtig auf die Insert-Membran übertragen. Unter einem Stereomikroskop und mit Hilfe von sauberen Zangen, positionieren Sie die Explants in der Mitte der Einsätze, um sicherzustellen, dass sie nicht in der Ecke der Einsätze stecken oder an den Seitenwänden befestigt sind.
- Nachdem die Explants platziert und auf die Einsätze zentriert sind, entfernen Sie vorsichtig alle zusätzlichen PBS aus den Einsätzen und schließen Sie die Deckel der Platten.
- Fügen Sie unter einer laminaren Strömungsgewebekulturhaube 100 l des vorgewärmten kompletten Mediums auf die Einsätze und 200 l in die Brunnen ein, um die Explanten an der Luft-Flüssig-Schnittstelle so zu kultivieren, dass die Basaloberfläche des Einsatzes mit dem Medium in Kontakt steht. , aber die obere Oberfläche ist der Luft ausgesetzt.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Lautstärke anpassen, um eine Luft-Flüssig-Schnittstelle zu erhalten, wenn Sie ein einsetzende Einsätze/Wellplatten unterschiedlicher Größe verwenden. - Fügen Sie 300 l PBS in die ungenutzten Brunnen der 24 Brunnenplatten und decken Sie mit dem Deckel ab. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator, und wachsen die Kulturen für 5 Tage.
- In den folgenden Tagen beobachten Sie routinemäßig die Kulturen unter einem invertierten Lichtmikroskop, um den Status der Explantkulturen zu beurteilen. Stellen Sie sicher, dass die Explanten kontraktil schlagen und dass alle Explants an der Unterseite der mit ECM eingebetteten Membran befestigt sind. Beachten Sie alle schwimmenden Explants.
HINWEIS: Die periodische Kontraktion der Explanten zeigt an, dass sie am Leben sind. Schwimmende Explanten sollten in der Analyse weggelassen werden. - Nach der Bewertung des Kulturstatus, legen Sie die Kulturplatte wieder in den Inkubator und weiter die Kultur für bis zu 5 Tage wachsen.
7. Behandlung von Kulturen mit VEGF-A (Positive Control)
HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass die folgenden Geräte und Reagenzien: laminare StrömungSgewebe-Kulturhaube, 1x PBS, Basalmedium + 1% fetales Rinderserum (FBS), Basalmedium + VEGF-A, Pipetten und Pipettenspitzen haben.
- Bereiten Sie das Basalmedium + 1% FBS und das Basalmedium + VEGF-A vor.
- Um das Basalmedium + 1% FBS vorzubereiten, bestimmen Sie zunächst die Anzahl der benötigten Kontrollbrunnen. Wenn es z. B. drei Steuerbrunnen gibt, dann ist 300 l/well x 3 = 900 l das gesamt benötigte Volumen. Fügen Sie 9 l FBS in 891 l Basalmedium hinzu, um das Basalmedium + 1% FBS zu bilden.
- Um das Basalmedium + VEGF-A vorzubereiten, bestimmen Sie zunächst die Gesamtzahl der Brunnen, die VEGF-A-Medium benötigen. Wenn es drei Brunnen gibt, dann sind 300 l/well x 3 = 900 l das Gesamtvolumen und 50 ng/well x 3 = 150 ng VEGF-A. Fügen Sie 150 ng VEGF-A in 900 l Basalmedium hinzu, um das Basalmedium + VEGF-A herzustellen.
HINWEIS: Montieren Sie diese Lösung mit einem größeren Volumen als berechnet, um eine ausreichende Anzahl kleinerer Aliquots für jedes Experiment zu versichern.
- Entfernen Sie am 2. Tag die Medien aus beiden Kammern (die Einsätze und die Brunnen). Waschen Sie Kulturen mit 300 l 1x PBS, indem Sie den Einsätzen 100 l und die Bohrungen 100 l und die Bohrungen um 200 l ergänzen. Die Platten ein paar Mal fest wirbeln und die PBS entfernen.
- Fügen Sie 300 l Basalmedium + 1% FBS (100 l in den Einsatz und 200 l in die Brunnen) hinzu, um die Kulturen für 24 h auszuhungern.
- Am 3. Tag nach dem Hungertod 300 l Basalmedium + 1% FBS (100 l in den Einsatz und 200 l in die Brunnen) in die Steuerbrunnen bzw. Basalmedium + VEGF-A (50 ng/well) in die Behandlungsbrunnen geben.
- Nach der Behandlung, weiter die Kulturen im Brutkasten wachsen.
8. Fixierung und Immunostainierung
HINWEIS: Stellen Sie vor Beginn die folgenden Geräte und Reagenzien sicher: 4% Paraformaldehyd (PFA), 1x PBS, primär- und sekundäre Antikörper, einen Shaker, 0,5% nichtionisches Tensid in PBS (PBT).
- Am sechsten Tag der Kultivierung, entfernen Sie die Medium und Waschkulturen mit 1x PBS bei Raumtemperatur (RT).
- Fixieren Sie die Kulturen, indem Sie den Bohrstellen 200 L 4% PFA-Lösung und den Einsätzen 100 l hinzufügen. Feste Kulturen in 4 °C für 20 min beim Schaukeln.
- Nach 20 min Fixierung PFA in einer Dunstabzugshaube aus den Kulturen entfernen und die Kulturen mit 1x PBS waschen, indem Sie 200 l in die Brunnen und 100 l in die Einsätze geben.
- Wiederholungswähbe 3x, je 10 min, beim Schaukeln. Fahren Sie dann mit der Immunfärbung fort.
HINWEIS: Alle Waschschritte werden auf einer Tischplatte bei RT durchgeführt.
- Verdünnung primärer Antikörper (Anti-VE-Cadherin, Anti-ERG 1/2/3) in Blockierlösung (5% Eselserum, 0,5% PBT). Fügen Sie 300 l primärer Antikörperlösung (200 l in den unteren Brunnen und 100 l in die Einsätze) ein. Inkubieren Sie Kulturen in primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C beim Schaukeln.
HINWEIS: Anti-VE-Cadherin wird verwendet, um die endotheliale Zellmembran zu beschriften und Anti-ERG 1/2/3 wird verwendet, um den Endothelzellkern zu beschriften, um die angiogenen Sprossen von Endothelzellen zu visualisieren. - Am nächsten Tag die Kulturplatten 10x in 0,5% PBT waschen und rocken, pbT alle 10 min wechseln.
- Verdünnen Sie die sekundären Antikörper (Esel Anti-Ratte Alexa Fluor 488 und Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555) in Blockierlösung. Fügen Sie 300 l des sekundären Antikörpers wie in Schritt 8.2 hinzu und bebrüten die Kulturen über Nacht bei 4 °C beim Schaukeln. Am nächsten Tag die sekundären Antikörper 10x in PBT waschen und PBT alle 10 min wechseln.
HINWEIS: Waschen Sie mindestens 10x, aber mehr Wäschen sind besser. Nachdem die Wässer abgeschlossen sind, können die Kulturen mit 1x PBS gelagert werden, bis sie auf Dias montiert werden.
9. Montage kulturen auf Dias, Imaging und Analyse
HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass die folgenden Geräte und Reagenzien: feine Zange, Dias, Montagemedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), Abdeckungen und konfokale Mikroskop. Nach der sekundären Antikörperfärbung montieren Sie die Kulturen mit den folgenden Schritten zur Bildgebung auf Dias.
- Ziehen Sie die Membran vorsichtig vom Einsatz mit feinen Zangen ab und übertragen Sie sie auf die Dias, indem Sie die Membranseite nach unten legen und die Explantkulturen nach oben setzen. Platzieren Sie die Replikationsproben in denselben Folien, und beschriften Sie die Folien als Steuerelement oder VEGF-A. Fügen Sie ein paar Tropfen Montagemedium mit DAPI direkt auf die Membran und bedecken Sie die Dias mit Deckelscheinen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden, während Sie die Abdeckungen platzieren. - Die Ränder der Dias mit klarem Nagellack abdichten und trocknen lassen.
HINWEIS: Dias können für eine Langzeitlagerung in -20 °C gelagert werden. - Bilddiagleitet mit einem konfokalen Mikroskop.
- Führen Sie Analysen durch, um die Länge des angiogenen Auswuchses zu messen. Quantifizieren Sie die angiogene Auswuchslänge, indem Sie den Abstand der Endothelzellen (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) messen, die sich von der Innengrenze der ERG 1/2/3+-Zellen in den Ventrikelkulturen und vom Zentrum der SV-Explantationen in den SV-Kulturen ausdehnt.
- Um die Quantifizierung mit FIJI/ImageJ durchzuführen, laden Sie zuerst FIJI Software herunter.
- Bilddateien in FIJI öffnen: Gehen Sie zu Datei | Öffnen | Ordner | Dateiname | Öffnen.
- Gehen Sie zu Analysieren | Festlegen von Messungen | Wählen Sie Perimeter.
- Wählen Sie das Werkzeug Gerade Linie aus dem Hauptfenster aus.
- Zeichnen Sie eine Linie über die Länge eines Keims, wie in Schritt 9.4 vorgeschlagen.
- Gehen Sie zu Analysieren | Maßnahme.
HINWEIS: Längenmessungen werden im neuen Fenster angezeigt. - Führen Sie die Quantifizierung in Bildern durch, die mindestens drei zufällig ausgewählte Sichtfelder darstellen. Durchschnittlich die Sprossenlängenmessungen und melden Sie sie als Mittelwert - Standardabweichung.
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Representative Results
Eines der auffälligsten Merkmale der SV-Angiogenese in vivo ist, dass sie einem bestimmten Weg folgt und Zelldedifferenzierungs- und Redifferenzierungsereignisse beinhaltet, die zu stereotypen Zeiten und Positionen1auftreten. Da die ersten SV-Zellen auf den Herzventrikel wachsen, stellen sie die Produktion von venösen Markern wie COUP-TFII (Abbildung 7) ein. Anschließend nehmen koronare Sprossen zwei Migrationspfade, entweder über die Oberfläche des Herzens oder tief im Myokard. Oberflächengefäße werden schließlich zu Venen, während eindringende Gefäße zu Arterien und Kapillaren werden1,6,7. Diese Unterscheidung bleibt erhalten, wenn das Herz wächst und sich die koronare Vaskulatur ausdehnt.
Um die Entdeckung der molekularen Grundlagen der koronaren Entwicklung zu erleichtern, haben wir ein In-vitro-Modell der SV-Sprossen entwickelt, das für Funktionsverlust- und Funktionsgewinne-Experimente genutzt werden kann. SV-Gewebe aus embryonalen Mausherzen wird seziert, auf die Oberseite des verdünnten ECM gelegt (das im Handel erhältlich ist, siehe Tabelle der Materialien),und an der luft-flüssigen Schnittstelle im endothelialen Zellwachstumsmedium gehalten. Das SV Myokard schlägt während der gesamten Kulturzeit weiter. Nach 2 Tagen in der Kultur verlassen Epikarzellen, die das Gewebe aussäumen, das Explant und wandern in die Matrix. Nach 5 Tagen sprießen SV-Endothelzellen aus und wandern auf das Epikardialgewebe(Abbildung 8A, schwarze Pfeilspitzen). Zusammen rekapituliert dieser Prozess angiogene Aspekte der koronaren Entwicklung.
Auch kultivierte SV-Sprossen werden venös entdifferenzierungswürdig. Wie im embryonalen Herzen wird die COUP-TFII-Expression reduziert, wenn die Gefäße vom SV wegwandern (Abbildung 8B, verglichen mit Abbildung 7). Kontrollgefäße wie Nabel- oder Eigelbsackarterien und Venen können keimende Gefäße produzieren. Sie sind jedoch weniger zahl- und kürzer und ändern nicht ihre arterielle oder venöse Identität (nicht dargestellt). Daher ist die venöse Reprogrammierung spezifisch für SV-Spriegung und kein allgemeines Merkmal der Angiogenese oder eine Reaktion auf ECM-Komponenten. Diese Daten deuten auch darauf hin, dass die im SV enthaltenen Zelltypen selbst notwendig und ausreichend sind, um eine Dedifferenzierung zu bewirken.
Es ist bekannt, dass vaskulärer endotheliale Wachstumsfaktor A (VEGF-A) ein potenter Induktor der Angiogenese7,13,14,15,16,17,18ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass Myokard-VEGF-A die endokarde Angiogenese stimuliert, um Herzkranzgefäße zu züchten7. Darüber hinaus haben koronare Endothelzellen gezeigt, dass SIE VEGF-A-Rezeptor exprimieren, und SV-abgeleitete Herzkranzgefäße im Myokard könnten als Reaktion auf VEGF-A in vivo2wachsen. Um zu zeigen, dass unser In-vitro-Modell der koronaren Angiogenese getreu auf VEGF-A reagiert, haben wir SV- und Endokulturen mit VEGF-A stimuliert. Wie erwartet zeigten unsere Ergebnisse, dass sowohl SV als auch Endo sehr auf VEGF-A reagieren. Kulturen, die mit VEGF-A stimuliert werden, zeigen ein erhöhtes Wachstum angiogener Sprossen sowohl in Derdichte als auch in Derlänge (Abbildung 9A,C). SV-Kulturen, die durch VEGF-A stimuliert werden, zeigen eine fast verdreifachende Erhöhung der Sprossenlänge im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 9B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Endothelsprossen von SV und Endo auf ähnliche Hinweise reagieren, die in vivo bekannt sind.
Zusammengenommen deuten unsere Daten darauf hin, dass diese In-vitro-Explant-Kulturen ähnliche zelluläre und molekulare Ereignisse aufweisen, die während der in vivo-koronaren Entwicklung auftreten, einschließlich venöser Dedifferenzierung und robustem Wachstum als Reaktion auf DIE VEGF-A-Stimulation. Daher deuten unsere Daten darauf hin, dass diese Explantationskulturmodelle für die Untersuchung der koronaren Angiogenese in vitro nützlich sind.
Abbildung 1: Vaginalstecker-Identifikation. (A) Ein Vaginalstecker (weißer Fleck). (B) Vergrößerte Ansicht des boxförmigen Bereichs einschließlich des Vaginalsteckers (durch Pfeil gekennzeichnet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zugriff auf die Embryoschnur in der Gebärmutter einer trächtigen Maus. Eine eingeschläferte trächtige Maus wird mit ihrer ventralen Oberfläche nach oben positioniert und mit 70% Ethanol zur Zerlegung auf nasse Haut gesprüht. Die Haut wird im Beckenbereich mit Zangen hochgezogen und ein kleiner Schnitt gemacht. Der Schnitt wird seitlich verlängert. Ein zusätzlicher Schnitt wird vor der Membran angeschnupzt. In der Gebärmutter ist eine Reihe von Embryonen sichtbar (angezeigt durch Pfeilspitzen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Zerlegung und Entfernung von Embryonen aus der Gebärmutter. (A) Bild, das die Gebärmutter zeigt, die eine Reihe von Embryonen enthält. Die Membran auf der Dorsalseite des Embryos (gegenüber der Seite, an der sich die Plazenta befindet) wird abgeschält. (B) Der Embryo im Eigelbsack wird sichtbar, nachdem er die Gebärmuttermembran abgeblättert hat. (C,D) Embryo an der Plazenta mit der Nabelschnur befestigt ist sichtbar nach dem Abschälen des Eigelbsacks. Amnion wird abgeschält, wenn er noch vorhanden ist. (E) Bild, das einen Embryo zeigt, der an der Plazenta durch die Nabelschnur befestigt ist. (F) Bild, das das Ablösen des Embryos von der Plazenta durch Ziehen an der Nabelschnur zeigt (Umb. Schnur) mit Zangen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Entfernung des Herz-Lungen-Zupfens aus Embryonen. (A,B) Der Kopf wird aus dem Embryo entfernt, indem er am Hals gefangen und abgekratzt wird. (C) Bild, das die Entfernung des Kopfes aus dem Körper zeigt. (D) Die korrekte Positionierung des Embryos für die Herzsektion. Der Embryo ist mit der ventralen Seite nach oben positioniert, um leichten Zugang zur Brusthöhle für die Entfernung des Herzens zu haben. Sobald der Embryo wie in D dargestellt positioniert ist, wird die Brusthöhle mit Zange geöffnet. (E) Bild zeigt die offene Brusthöhle mit dem Herz auf seiner ventralen Seite ausgesetzt. (F) Um das Herz zu entfernen, ohne den SV zu beschädigen, wird das Herz vorderlich umgedreht, und die dorsale Aorta wird sichtbar. (G) Bild, das die Position an der Basis des Herzens/der Lunge zeigt, wo die dorsale Aorta/Vene mit Zangen erfasst wird und der Herz-Lungen-Zupf vordergründ herausgezogen wird. (H) Das Bild zeigt das aus dem Embryo entfernte Herz/Lungen-Zupfen e11.5. V. Herz = ventrales Herz; d. Herz = Dorsalherz; d. aorta = dorsale Aorta; LA = linkes Atrium; RA = rechtes Atrium; LV = linker Ventrikel; RV = rechter Ventrikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Isolierung von SV und Ventrikeln aus embryonalen Herzen. (A) Bild, das die dorsale Ansicht des isolierten Herz-Lungen-Zupfens aus dem e11.5-Embryo zeigt. Lage des SV im Herzen ist angegeben. (B) Bild des Herzens, nachdem die Lungenknospen entfernt wurden. (C) Atria und angrenzende Gewebe, die den SV umgeben, werden entfernt, was die Aorta offenbart. Der Standort des SV ist beschriftet. (D) Bild mit Entfernung des SV. Mit Zangen wird der SV an seiner Basis gepackt und vom Herzen abgekratzt. (E) SV aus dem Herzen entfernt wird zusammen mit dem restlichen Gewebe des Herzens gezeigt. Der Aorta- und Lungenstamm (PT), kollektiv Abflusstrakt (OFT) genannt, wird im Herzen sichtbar, nachdem SV entfernt wurde. Der SV wird für die In-vitro-Kultur verwendet, wie in Abbildung 6 (linkes Panel) beschrieben. (F) Die Position des zu sezierenden OFT ist durch eine gestrichelte weiße Linie gekennzeichnet. (G) Aorta/PT (Abflusstrakt) wird durch Sezieren an der in Tafel F dargestellten Position aus den Ventrikeln entfernt. Die übrigen Ventrikel ohne OFT werden für Ventrikelkulturen verwendet, wie in Abbildung 6 (rechtes Panel) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Schema, das den Arbeitsablauf von SV und Ventrikelkultur zeigt. Links: Verfahren für SV-Kultur. Zunächst wird der SV von e11.5 Herzen entfernt und auf einen Kultureinsatz gelegt. Insert enthält poröse Membran am Boden (8 m Pore) und ist mit Wachstumsfaktor reduziert ECM beschichtet. Die Einsätze werden in die Brunnen einer 24-Well-Platte gelegt. Medium wird sowohl in der unteren als auch in der oberen Kammer hinzugefügt, ohne die Explantation zu bedecken. Die Kultur wird für 5 Tage angebaut. Nach 5 Tagen wird die Membran aus dem Einsatz entfernt und zur Bildgebung und Analyse auf die Dias montiert. Rechts: Verfahren für die Ventrikelkultur. Ventricles ohne DEN SV, atria und OFT werden aus den e11.5 Herzen entfernt und werden wie oben beschrieben für den SV kultiviert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: DER COUP-TFII-Ausdruck geht in den SV-Sprossen in vivo verloren. (A) Dorsale Ansicht von e11.5 Herzen. Konfokales Bild des Endothelmarkers (rot), das den Sinus venosus (SV), koronare Sprossen (cs, gepunktete Linie) und Endokardie (Endo) beschriftet, die das Herzlumen aussäumen. (B) Der venöse Hersteller COUP-TFII (grün), ein venen transkriptionischer Faktor (trx), ausgedrückt im SV, geht allmählich verloren, wenn Sprossen den SV verlassen und auf den Ventrikel wachsen. Rechts: Höhere Vergrößerung des koronaren Sprossens, die im Kastenbereich des Panels A. Scale bar = 100 m dargestellt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: In-vitro-Modelle venöser Identität und Neuprogrammierung. (A) Hellfeldbild des kultivierten SV-Gewebes. Gefäßsprossen (Pfeilspitzen) wachsen aus der ursprünglichen Explantation (schwarz gepunktete Linie) über das ECM-Substrat. (B) Immunfluoreszenz von SV-Kulturen, die mit Antikörpern gekennzeichnet sind, die die Endothelzelloberfläche (VE-Cadherin), endotheliale Zellkerne (ERG 1/2/3) sowie Venen- und Epikardialkerne (COUP-TFII) kennzeichnen. Die Kerne sind sowohl für ERG 1/2/3 als auch für COUP-TFII beim SV positiv, aber ERG 1/2/3 nur bei Sprossen, die über das ECM wandern. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: SV und Endokard reagieren in vitro auf VEGF-A. (A) Konfokales Bild der 5-Tage-alten Steuerung und VEGF-A behandelten SV-Explantationskultur. Endothelzellen werden mit VE-Cadherin (grün), endotheliaalen Zellkernen mit ERG 1/2/3 (rot) Antikörpern und Zellkernen mit DAPI (blau) immungefärbt. (B) Das angiogene Auswachsen von Endothelzellen wird quantifiziert, indem die Länge der Sprossenverlängerung gemessen wird (der Abstand, der von ERG 1/2/3+ Endothelzellen aus dem Explant migriert wird, angezeigt durch weiße feste Linien in den unteren Platten von (A). (C) Konfokales Bild einer 5 Tage alten Kultur eines kontrollierbaren und VEGF-A behandelten Ventrikeln. Endothelzellen werden mit VE-Cadherin (grün) immunstainiert und Endothelzellkerne sind mit ERG 1/2/3 (blauen) Antikörpern gefärbt. Punkte sind Einzelmessungen und Fehlerbalken sind mittelwert . SD. Skalenbalken = 200 m (A,C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Einige der wichtigsten Schritte für den erfolgreichen Anbau von Herzkranzgefäßen aus dem SV- und Endo-Vorläufergewebe sind: 1) Korrekte Identifizierung und Isolierung des SV-Gewebes für die SV-Kultur; 2) Verwendung von Ventrikeln aus Embryonen im Alter von e11-11,5 für eine genaue Endo-Kultur; 3) Aufrechterhaltung steriler Bedingungen während der gesamten Sezierzeit und halten das Gewebe zu jeder Zeit kalt; und 4) Beibehaltung der Anspannung der ECM-beschichteten Membran, um zu vermeiden, dass Gewebe im Medium schwimmt.
Erstens kann die Isolierung von SV-Gewebe eine Herausforderung sein. Es ist wichtig zu erkennen, dass der SV auf der Rückenseite des Herzens zwischen dem linken und rechten Vorhöf liegt, der in den Lungenlaubeln versteckt ist. Daher ist es schwierig, zu trennen und zu isolieren. Stattdessen muss zuerst das ganze Herz/Lungenzupfen extrahiert werden. Der SV wird dann vom Zupfen isoliert, indem die Lungenlappen sorgfältig entfernt und das angrenzende Gewebe mit Hilfe feiner Zange gereinigt wird. Außerdem muss man beim Aufräumen der angrenzenden Gewebe sehr vorsichtig sein, um den SV nicht zu verlieren.
Zweitens ist es für eine genaue endokardiale Angiogenese wichtig, Ventrikel von Embryonen zu kultivieren, die nicht älter als e11.5 sind. Bei e12.5 und älteren Embryonen wachsen die Koronare des SV zu einem signifikanten Anteil der Ventrikel. Daher können die Herzkranzgefäße, die aus älteren Ventrikeln wachsen, sowohl aus den SV- als auch den Endo-abgeleiteten Koronaren1,2,10,19,20bestehen. Aus diesem Grund ist es für die genaue Assay der Koronargefäßwachstum aus dem Endo, es ist wichtig, Kultur Ventrikel (minus SV und Abflusstrakt) aus e11.5 Embryonen20. Darüber hinaus ist der SV relativ größer und mit e11.5 leichter zu isolieren.
Drittens: Da das Protokoll außerhalb der Gewebekulturhaube einen erheblichen Arbeitsaufwand erfordert, ist es von entscheidender Bedeutung, ein steriles Arbeitsumfeld aufrechtzuerhalten. Es ist wichtig, die Sezierwerkzeuge (Zangen, Scheren, etc.) und die Gewebekulturplatten zu sterilisieren und den Kontakt mit unsterilen Bereichen jederzeit zu vermeiden. Es ist wichtig, den Arbeitsbereich und den Sezierbereich mit 70% Ethanol zu besprühen. Um eine Kontamination zu vermeiden, ist es wichtig, den Seziervorgang schnell durchzuführen und die Arbeit außerhalb der Gewebekulturhaube zu minimieren.
Viertens ist es wichtig, dass die Expflanzen jederzeit an der Membranbasis befestigt bleiben, um gesunde Expflanzenkulturen zu erhalten. Schwimmende Expflanzen im Medium müssen vermieden werden, um die Explantkulturen erfolgreich anzubauen. Um Floating zu vermeiden, ist es wichtig, eine luft-flüssige Schnittstelle beizubehalten, bei der die Basaloberfläche des Einsatzes mit dem Medium in Kontakt steht, die obere Oberfläche jedoch der Luft ausgesetzt ist. Eine solche Schnittstelle wird erhalten, wenn die Explantation ausreichend vom Medium abgedeckt ist, aber nicht vollständig untergetaucht ist. Es ist wichtig, das Volumen des Mediums täglich zu überwachen, da Volumen durch Verdunstung verloren gehen kann. Um dies zu verhindern, kann die Kulturplatte befeuchtet werden, indem PBS in die ungenutzten Brunnen der Kulturplatten eingebracht wird.
Ähnliche Explant-Kulturen von SV und Endo werden an anderer Stelle beschrieben20. Bei diesen Methoden wurden die Explanten direkt in die Brunnen von Gewebekulturplatten kultiviert, was die hochauflösende konfokale Bildgebung einschränkt. Die in dieser Einstellung aufgenommenen Bilder sind im Vergleich zu der hier vorgeschlagenen Methode relativ schlecht, was detaillierte mikroskopische Analysen einschränkt. Um dies zu umgehen, haben wir Kultureinsätze verwendet, aus denen die Kulturhaltigen Membranen abgeschält und zur Bildgebung auf die Glasgbesser montiert werden können. Dies ermöglicht eine hochauflösende konfokale Bildgebung, bei der zelluläre Details wie Ausdrucksmuster und Morphologie betrachtet werden können. Darüber hinaus erfordert die direkte Kultivierung auf Platten ein separates Färbeprotokoll für DAPI oder andere pannukleare Markerfärbung. Dieses Protokoll erfordert keine separaten Färbeschritte, da die Folien mit dem Montagemedium mit DAPI montiert werden können. Darüber hinaus ermöglicht die Montage auf Dias eine langfristige Lagerung ohne fluoreszierendes Ausbleichen, während Kulturen, die in Brunnen mit flüssigem Medium gelagert werden, zu einem schnellen Ausbleichen führen und nicht für die langfristige Lagerung und Bildgebung geeignet sind.
Die hier beschriebenen In-vitro-Kulturmodelle sind ideal für die Verhörzell- und Molekularmechanismen der koronaren Angiogenese in hoher Durchsatz- und Zugänglichkeit. Dieses In-vitro-System kann verwendet werden, um nach potenziellen Medikamenten oder molekularen Zielen zu suchen, um ihre Wirkung auf die koronare Angiogenese zu bewerten. Darüber hinaus kann dieses System auch verwendet werden, um die Funktionsverstärkung und den Funktionsverlust verschiedener Gene für ihre autonome Funktion in der koronaren Angiogenese zu untersuchen. Wir beobachteten, dass koronare Sprossen von SV der epikardialen Migration in unseren In-vitro-Kulturen folgten, was auf eine wichtige Wechselwirkung zwischen koronaren Endothelzellen und Epikardialzellen hindeutet. Es ist bekannt, dass das Epicardium eine reiche Quelle von Wachstumsfaktoren für die koronare Angiogenese aus dem SV ist. So haben bisher nachweislich epikardiale Wachstumsfaktoren wie VEGF-C und ELABELA die SV-abgeleitete koronare Angiogenese2,19reguliert. Wir können dieses SV-Kultursystem nutzen, um die Wechselwirkung zwischen dem Epikard und den koronaren Endothelzellen weiter zu untersuchen und neuartige epikardialabgeleitete molekulare Bahnen der koronaren Angiogenese zu identifizieren. Darüber hinaus deuten unsere In-vivo-Daten darauf hin, dass myokardiale Hypoxie an der endokardialen Angiogenese19beteiligt sein kann. Unser In-vitro-Kultursystem bietet ein ausgezeichnetes Modell, um die Rolle der Hypoxie bei der endokardialen Angiogenese zu untersuchen, indem die Kulturen unter hypoxischen oder normoxischen Bedingungen inkubiert werden. Dies sind schwierige Experimente in vivo durchzuführen, weil es erfordert, dass eine schwangere Maus in einer kontrollierten hypoxischen Kammer platziert werden. Aus eigener Erfahrung ist es eine große Herausforderung, konsistente und zuverlässige Ergebnisse aus In-vivo-Experimenten zu erhalten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser In-vitro-Modell der koronaren Angiogenese ein zuverlässiges System zur Hinterfrage stellung gibt, um eine Vielzahl von Fragen im Zusammenhang mit der Zell- und Molekularbiologie der koronaren Angiogenese zu hinterfragen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Mitgliedern des Sharma-Labors für die Bereitstellung einer unterstützenden Forschungsumgebung. Ein besonderer Dank gilt Diane (Dee) R. Hoffman, die unsere Mauskolonie pflegt und pflegt. Wir möchten auch Drs. Philip J. Smaldino und Carolyn Vann für das gründliche Korrekturlesen des Manuskripts und die Bereitstellung hilfreicher Kommentare danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel des Ball State University Provost Office und des Department of Biology an B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant Funds to B.S, nIH (RO1-HL128503) und The New York Stem Cell Foundation funds to K.R. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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