Summary
Her presenterer vi en detaljert prosedyre for å kjøre en Design of Experiment i en automatisert mikrobioreaktor etterfulgt av celleinnhøsting og proteinkvantifisering ved hjelp av en Protein A-kolonne.
Abstract
Optimalisering av bioprosesser for å øke utbyttet av ønskede produkter er av betydning i biofarmasøytisk industri. Dette kan oppnås ved belastningsvalg og ved å utvikle bioprosessparametere. Shake kolber har blitt brukt til dette formålet. De mangler imidlertid evnen til å kontrollere prosessparametrene som pH og oppløst oksygen (DO). Denne begrensningen kan overvinnes ved hjelp av en automatisert mikrobioreaktor. Disse bioreaktorene etterligner dyrking i større skala. En av de viktigste fordelene med dette systemet er integreringen av Design of Experiment (DOE) i programvaren. Denne integreringen gjør det mulig å etablere en design der flere prosessparametere kan varieres samtidig. De kritiske prosessparametrene og optimale bioprosessforholdene kan analyseres i programvaren. Fokuset for arbeidet som presenteres her er å introdusere brukeren til trinnene som er involvert i prosessdesign i programvaren og inkorporeringen av DOE innenfor dyrkingskjøringen.
Introduction
Det globale biofarmasøytiske markedet var verdt mer enn US $ 250 milliarder i 2018 og har kontinuerlig ekspandert1. Farmasøytiske selskaper beveger seg bort fra å produsere små molekylære legemidler til bioteknologisk produserte terapeutiske midler som rekombinant proteiner. Disse alene er ansvarlige for en omsetning på mer enn $ 150 milliarder1. Pattedyrceller er nå mye brukt til produksjon av disse farmasøytiske rekombinantproteiner. I inneværende periode, blant de 68 godkjente produktene produsert av pattedyrceller, produseres 57 av kinesiskhamstereggstokkceller (CHO)2. CHO-celler brukes spesielt til produksjon av rekombinantproteiner som krever post-translasjonelle modifikasjoner. Disse cellene foretrekkes etter hvert som de vokser i en suspensjon og dermed muliggjør reproduserbare resultater i et serumfritt kjemisk definert medium3,,4. Den andre fordelen med å bruke CHO-celler er at glykanstrukturen til produktet ligner på det menneskelige monoklonale antistoffet (mAb) og resulterer i høyere rekombinant proteinutbytte og spesifikk produktivitet på grunn av genforsterkning5.
Utbyttet av rekombinant CHO (rCHO) cellekultur har økt med hundre ganger de siste to tiårene. Denne forbedringen tilskrives optimalisering av prosessparametrene, fôringsstrategi og utvikling av serumfri kjemisk definert medium6. Med økningen i kravene til farmasøytiske produkter øker trykket på kostnader og tidseffektivitet for utviklingen av produksjonsprosessen7. For å redusere trykket samtidig som produktkvaliteten har omdirigert fokuset til den farmasøytiske industrien på Quality by Design (QbD). QbD brukes til å forstå produktproduksjonen samt prosessen. Et viktig verktøy som brukes i ObD er Design of Experiment (DOE). Det bidrar til å øke forståelsen av prosessen ved å avsløre forholdet mellom ulike inndatavariabler og resulterende utdata. Bruk av DOE-tilnærmingen for å optimalisere bioprosessen er gunstig i de tidlige stadiene av prosjektet i assimilering av prosessforholdene og øke titerkvantiteten og kvaliteten. Denne tilnærmingen er gunstig sammenlignet med den gammeldagse strategien: one-factor-at-a-time (OFAT). De statistiske tilnærmingene til DOE ved hjelp av klassisk, shainin eller Taguchi er langt bedre enn OFAT8.
Prosessen og medieoptimaliseringen kan utføres i shake kolbe. Kolbene er relativt billig. Det er imidlertid ikke mulig å kontrollere parametere som temperatur, pH og oppløst oksygen (DO). For å overvinne disse ulempene, kan multiuse benk-top bioreaktorer som spenner fra arbeidsvolum på 0,5 L til 5 L brukes. Reaktorene gir en omfattende on-line overvåking og prosesskontroll. Bruken av multiuse bioreaktoren er imidlertid tid og arbeidskrevende. For å overvinne disse ulempene, brukes en ny engangsbioreaktor som kombinerer den omfattende prosessen med å overvåke benk-top bioreaktoren og enkel håndtering av ristekolben. Det høye gjennomstrømningsscreeningssystemet og engangsteknologien har bidratt til å forbedre effektiviteten av prosessytelse og utvikling9.
I denne artikkelen er retningslinjene for å laste oppskriften i den automatiserte mikrobioreaktoren (AMBR) programvare oppført. Påvirkningen av ulike rørehastigheter og pH på levedyktig cellekonsentrasjon (VCC) og titer studeres i løpet av dette eksperimentet. Det eksperimentelle resultatet og analysen utføres med design av eksperimentprogramvare MODDE 12. Produktanalysen utføres i et høytrykks flytende kromatografi (HPLC) system med en Protein A-kolonne. Det er basert på prinsippet om at Fc-regionen i mAb binder seg til protein A med høy affinitet10,11. Med denne metoden er det mulig å identifisere og kvantifisere mAb. Kvantifiseringen utføres over de målte områdene på 280 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preculture Prosedyre
MERK: Rekombinant CHO DG44 celler med en levedyktig cellekonsentrasjon på 1 x 107 celler / ml brukes for denne protokollen.
- Tin hetteglasset som inneholder 1,2 ml celler til romtemperatur og overfør umiddelbart cellesuspensjonen til et 15 ml konisk sentrifugerør som inneholder 10 ml kaldt frømedium.
- Sentrifuge det koniske sentrifugerøret i 5 minutter ved 190 x g og romtemperatur og kast supernatanten.
- Pre-heat 150 ml av frømediet i en 500 ml rist kolbe til 36,8 °C.
- Resuspender forsiktig cellepelleten i 10 ml forvarmet frømedium og overfør cellene til ristkolben.
- Bruk 1 ml av prøven fra kolben til å måle den første VCC og levedyktigheten ved hjelp av en celleteller.
MERK: Levedyktigheten bør være over 70% etter tining for vellykket dyrking. - Inkuber ristkolben i en orbital shaker (shakerdiameter på 19 mm) ved 36,8 °C og 7,5 % CO2 med en ristingshastighet på 120 o/min.
MERK: Disse forholdene varierer avhengig av cellebelastning og medium. - Tre dager etter å ha passert cellene, fjern risten kolbe fra shakeren og plasser den under lamitarflytskapet. Ta 1 ml prøve for å måle den endelige cellekonsentrasjonen. Beregn volumet som skal overføres til friskt forvardet frømedium slik at den første cellekonsentrasjonen i den nye passasjen er 2 x 105 celler / ml.
- Passasje cellene 5 ganger totalt før du overfører til bioreaktoren for hoveddyrking.
2. Hoveddyrking
- Mål den endelige cellekonsentrasjonen av prekulturen. Beregn volumet som skal overføres til bioreaktoren slik at den første cellekonsentrasjonen i reaktoren er 3 x 105 celler / ml.
- Fyll reaktoren med produksjonsmediet en dag før inokulasjonen for å likestille reaktoren og angi prosessparametrene som temperatur, pH og DO.
MERK: Dyrkingsforholdene er 36,8 °C og 60 % oppløst oksygenkonsentrasjon (DO). Vi testet rørehastigheter på 1050 rpm og 1300 rpm sammen med pHs på 6,9, 7.1 og 7.3. Den totale varigheten av dyrkingen er 12 dager til cellene høstes. Batchprosessen kjører i 72 timer hvoretter matemediet legges til hver 24 timer. Protokollen som skal brukes til dyrking er oppført i detalj i neste segment.
3. Skrive oppskriften i den automatiserte mikrobioreaktorprogramvaren
MERK: Det er to måter å skrive en oppskrift i AMBR cellekultur programvare: det er opprettet enten ved hjelp av en veiviser eller ved å legge til hvert trinn manuelt. I denne protokollen vises trinn ved hjelp av veiviseren.
- Opprette et nytt eksperiment
- Åpne AMBR cellekultur programvare og i Innledning kategorien klikk på Opprett nytt eksperiment.
- Laste inn oppskriften
- I kategorien Nytt eksperiment skriver du inn navnet på eksperimentet sammen med datoen det skal utføres.
- Aktiver kontrollpunktet for kulturstasjonen og fartøyene som skal brukes under dyrkingen. Auto Legg til DOE-koder vil også bli aktivert for en enkel overgang under programmeringen av DOE-eksperimentet. Klikk på Neste for å bytte til neste fane.
- Angi informasjon om tilsetning av medier i fartøyet sammen med skum, inokulum, fôr og glukose.
- Aktiver kontrollpunktet Legg til medieplate. Definer platetype, navn og plassering for platen som inneholder mediet.
FORSIKTIG: Avhengig av type plate og hvis platen inneholder et lokk, aktiverer du kontrollen på Er lokket for å sikre jevn funksjon av væskehåndtereren - Klikk på Legg til medier i fartøy. Angi volumet av mediet som skal legges inn i fartøyene. Definer kartleggingen av overføringen av mediet fra platen til fartøyene. Klikk på Neste for å bytte til neste fane.
- Aktiver kontrollpunktet Legg til medieplate. Definer platetype, navn og plassering for platen som inneholder mediet.
- Sett dyrkingsforholdene i reaktoren.
- Etter at medieinformasjonen er matet inn i programvaren, tilordner dyrkingsforholdene. Klikk på Condition Media og fyll ut temperaturen, målet DO, øvre pH-grense og omrøring spm (Opp omrøring eller ned omrøring).
- Sett tillegg av inokuleringer inn i fartøyene.
- Aktiver Legg til celleplate. Definer platetype, navn og plassering av platen som inneholder mediet.
- Klikk på Legg til celler i fartøy. Angi tidspunktet for inokulasjon og volumet av media som skal legges til fartøyene.
- Definer banen som er reist av væskebehandleren til overføring av cellen fra platen til fartøyene. Klikk på Neste for å bytte til neste fane.
MERK: Sørg for at pipettespissene for gjenbruk er deaktivert for å unngå krysskontaminering og feil innledende brukbar cellekonsentrasjon.
- Sett tilsetning av fôr, glukose og skum.
MERK: Prosedyren for tilsetning av fôr, glukose og skum ligner hverandre. For denne protokollens skyld er prosedyren oppført for "Feed". Dette kan replikeres for glukose og skum.- Aktiver tilsett mateplaten, og definer platetypen, navnet og plasseringen. Klikk på Legg til fôr til fartøy og angi volumet av fôret som skal legges til fartøyene. Definer tilordningen av overføringen av fôret fra platen til fartøyene.
- Avhengig av dyrking, legg til antall fôr tillegg. For denne dyrkingen blir reaktoren matet etter 72 timer for hver 24.
- Legg til tidsforsinkelsen mellom fôringen manuelt ved å skrive inn dataene i Forsinkelse fra celler som er lagt til. Den første fôringsdagen er etter 72 timer med inokulasjon, og den neste er etter 96 timer og så videre.
MERK: Antifoam tillegg er programmert til å bli lagt til hver dag for å unngå skumdannelse under dyrking.
- Angi prøvetaking under dyrkingen.
- Aktiver Legg til prøveplate og definer platetype, navn og plassering.
- Sjekk på Ta prøve fra fartøy og angi volumet av prøven som skal fjernes fra fartøyene. Definer kartleggingen av overføringen av prøven fra fartøyene til platen. Sørg for at volumet ikke reduseres under 10 ml i hele løpet av dyrking.
- Legg til antall prøver som skal tas under dyrkingen. I likhet med fôring, legg til tidspunktet for prøven som fjernes fra fartøyet for hvert inngangsprøvepunkt.
- Lagre prosessen. Den er nå klar for henrettelse.
MERK: Hvis du vil sikre jevn kjøring av protokollen, bytter du til kategorien Prosesstrinn i AMBR-cellekulturprogramvaren og velger Prosesstrinn-visningen for å visualisere flyten av oppskriften.
- I kategorien Nytt eksperiment skriver du inn navnet på eksperimentet sammen med datoen det skal utføres.
- Design av eksperiment i den automatiserte mikrobioreaktoren
- For å kjøre DOE-programvaren til bioreaktoren, sørg for at oppskriften i hovedprogramvaren er lagret og klar til bruk.
- Åpne AMBR 15 DOE-programvaren og klikk på Undersøkelse og velg Ny.
- Skriv inn navnet på den nye DOE-undersøkelsen i dialogboksen Opprett undersøkelse.
- For å tilordne et eksperiment til DOE-undersøkelsen, åpne oppskriften som er opprettet for å studere de forskjellige parametrene. Klikk på Bla gjennom og velg det respektive eksperimentet.
- Definer DOE-faktoren.
- Fartøykodene er allerede registrert i kolonnen. Hvis du vil definere ønsket DOE-faktor, velger du parameteren og klikker på kolonnen merket DOE-faktor. Velg Ny, og legg til enheter, forkortelse, nedre og øvre grense for faktorene (f.eks. temperatur, DO, pH).
- Definer responsfaktoren.
- Når DOE-faktorene er definert, definerer du svaret basert på hvilken eksperimentell analyse som skal struktureres på.
- I kategorien Svar definerer du verdiene som skal vurderes for analysen av dataene.
- Klikk på Rediger DOE-svar og definer navnet på svaret, forkortelsen, enhetene, minimums- og maksimumsgrensene (f.eks. titer, levedyktig cellekonsentrasjon).
- Når svarene er definert, velger du AMBR-variabelen for hvert svar og definerer variabelen. Et svar kan automatisk knyttes til en mikrobioreaktorvariabel, Velg ønsket variabel fra rullegardinlisten.
- Endre ligningen for hvert av svaret avhengig av kravet. Valget er mellom minimums-, maksimums-, første-, siste- og gjennomsnittsdata.
- Opprett en design.
- Bruk veiviseren for startutforming for å velge typen eksperimentell utforming, til å legge til eller fjerne antall replikater og midtpunkter.
- Velg målet, som bestemmer valget av design og modeller:
Screening: Bruker lineære modeller og interaksjonsmodeller for å finne de viktige faktorene
Optimalisering (RSM), Bruker kvadratiske og kubikkmodeller for detaljert modellering og optimalisering
Split mål: Modeller for formulering og prosessfaktorer kan velges separat - Når målet er bestemt, velg modellen og design sammen med antall midtpunkter og replikerer.
- Klikk på Fullfør og bytt til neste fane.
- Definer eksperimentet.
MERK: DOE-faktorene er oppført i høyre kolonne i programvaren. Når du velger de ønskede faktorene, vil fartøyene som kjører det eksperimentet med ønsket parameter, bli uthevet. Fartøyene i kulturstasjonen kan flyttes rundt ved å høyreklikke på fartøyet og flytte det til ønsket sted.- Opprett arbeidspakker som kan importeres i AMBR-cellekulturprogramvaren. Avhengig av antall eksperimenter opprettes og lagres de ulike arbeidspakkene for videre implementering
- Utførelse av eksperimentet i arbeidspakkene som er opprettet på AMBR-kontrollens bærbare datamaskin
- I kategorien Eksperiment klikker du på Opprett DOE-eksperiment og blar etter arbeidspakken som er opprettet ved hjelp av DOE-programvaren.
- Initialiser prosessen ved å klikke Start.
- Analyse av eksperimentelle resultater
- Når eksperimentet er utført, eksporterer du dataene ved hjelp av Eksporter DOE-resultater. Vinduet Eksporter DOE-resultater åpnes, og radene som angir kulturfartøyet og stasjonen, er oppført i tabellen.
- Velg de ønskede radene og klikk på Eksporter valgte rader eller Eksporter eksperimentelle data for å lagre alle resultatene og lagre filen for videre analyse.
- Importer dataene til AMBR DOE-modulen ved å bytte til Resultater-fanen og velge Importer resultater.
- Se etter ønsket datafil og klikk på Analyseresultater.
- Analyser resultatene ytterligere i MODDE.
4. Utførelse av dyrking i den automatiserte mikrobioreaktoren
MERK: Følgende trinn utføres av brukeren ved hjelp av protokollen som er skrevet i den nevnte programvaren. Trinnene utføres av brukeren med mindre annet er nevnt.
- Laste fartøyene
- Åpne gammasteriliserte kulturfartøy under et lamitarflytskap og orient i kulturstasjonen som avbildet i figur 2.
- Rengjør klemmeplaten med 70 % etanol og dobbelt destillert vann. Deretter autoklavplaten og plasser på toppen av fartøyet.
- Monter klemmeplaten med en røreplate, og pass på at hver pinne er godt festet.
- Trekk både røreplaten og klemplaten på omrøringsenheten.
- Kjøre mikro-bioreactor-programvaren
- Bruk programmet skrevet i § 3 for å kjøre dyrkingen.
- Visualiser prosesstrinnene som er planlagt eller fullført i kategorien Prosess. Endre dyrkingstrinnene under prosessen som trengs ved først å sette væskebehandleren på pause og deretter redigere prosessoppskriften.
- Tilsett skum til fartøyene før røreren er i gang for å sikre at det ikke er overdreven skumdannelse under dyrkingen. Antiskummet vil bli lagt til regelmessig, og skummet oppdages visuelt.
- Tillegg av medier inn i fartøyet
- Fyll den 24 brønnplaten som følger med mikrobioreaktorene manuelt med sterile medier og plasser i det angitte dekket av systemet. Sørg for at platen er plassert i dekket som er angitt av det skriftlige programmet (avsnitt 3). Fyllingen av fartøyet vil foregå som utformet i pkt. 3.2.2.
MERK: Temperaturen og røreren starter umiddelbart etter tilsetning av media og skummet. Sensorleseren aktiveres 1 time etter at fartøyet er fylt (Start Monitor-trinn). Gassing til hvert fartøy starter når leseren er aktivert. Media er overlatt til å likevektes i minst 6 timer før pH-rekalibrering og inokulasjon. Prosessparametrene kan endres i programvaren som nevnt i pkt. 3.2.3.
- Fyll den 24 brønnplaten som følger med mikrobioreaktorene manuelt med sterile medier og plasser i det angitte dekket av systemet. Sørg for at platen er plassert i dekket som er angitt av det skriftlige programmet (avsnitt 3). Fyllingen av fartøyet vil foregå som utformet i pkt. 3.2.2.
- Inoculation
- Mål den levedyktige cellekonsentrasjonen etter 5th passasjen. Beregn antall celler som skal overføres til fartøyene for å sikre at den første cellekonsentrasjonen i alle fartøyene er 3 x 105 celler/ml.
- Overfør cellene til en 24 dyp brønnplate slik at volumet av suspensjonen er minst 1,6 ganger det nødvendige volumet. For et nødvendig volum på 2 ml i nonometeret, overfør 3,2 ml cellesuspensjon til hver brønn i platen.
- Plasser 24 brønnplaten i det angitte dekket. Fartøyene vil bli vaksinert som i pkt. 3.2.4.
- Daglig prøvetaking og analyse
- Fjern en 460 μL prøve fra fartøyene hver dag ved hjelp av væskebehandleren. Fortynn 200 μL av prøven med 800 μL filtrert 1x PBS-buffer (5x fortynning), og plasser deretter i celletelleren.
- Sentrifuge den gjenværende prøven i 5 min på 190 x g og romtemperatur og lagre supernatantfor videre analyse (glukose, laktat, glutamin og glutamat).
- Frys 100 μL av supernatanten ved -20 °C til slutten av dyrkingen for proteinkvantifisering.
- Slutten av dyrking
- Når prosessparameterkontrollen (dvs. temperatur, agitasjon, pH og DO) er avsluttet, må du stoppe overvåkingen av prosessen.
- Skru av røreplaten og klemmeplaten.
- Fjern kulturfartøyene og rengjør kulturstasjonene. Plasser tørkeplatene på kulturstasjonene og skru dem inn.
- I mellomtiden rengjør klemmeplatene grundig med 70% etanol og dobbelt destillert vann.
- Klikk på Stopp i bioreaktorprogramvaren når tørkesyklusen er fullført.
- Cellekultur høsting
- Høst celler på dag 12 av dyrkingen ved å manuelt fjerne innholdet i karene i 50 ml sentrifugerør. Sentrifuge cellebuljongen på 190 x g i 30 min.
- Kast cellepelleten og oppbevar supernatanten ved -20 °C.
5. Måling av mAb-konsentrasjon
- Bruk en 1,7 ml protein En kolonne for kvantifisering av proteinet under dyrkingskjøringen.
-
Klargjør likevekts- og elutionbufferen før du tiner prøvene.
- Bruk en løsning på 0,5 M Na2HPO4 som inneholder 0,5 M NaCl med en pH på 7,9 som likevektsbuffer og en løsning på 100 mM glycin som inneholder 0,5 M NaCl med en pH på 2 som elutionbufferen.
- Filtrer begge bufferne gjennom en 0,2 μm membran og degas før de plasseres for analysen.
- Tøm det høyytelses væskekromatografisystemet (HPLC) med nylaget likevektsbuffer.
- Last proteinet En kolonne på HPLC-systemet.
- Utfør kromatografi med en strømningshastighet på 1 ml/min. Still inn søyleovnstemperaturen ved 30 °C og autosamplertemperatur ved 10 °C
- Tin de frosne prøvene ved romtemperatur og filtrer 225 μL av hver prøve gjennom en PVDF-membran på 0,22 μm. Fortynn prøvene med høyere konsentrasjon av ønsket protein er i et 1:20-forhold med likevektsbuffer og filtrer gjennom membranen før du plasserer i autosampleren.
- Plasser prøvene i autosampleren. Last inn metoden og sekvensen i programvaren og start sekvensen.
MERK: Metoden består av tre faser (se figur 1): injeksjon av prøven i kolonnen de første to minuttene; etterfulgt av elutionbuffer i 8 min og kolonneregenerering med likevektsbuffer i 10 min.
Figur 1: Protein A kromatogram, som representerer de forskjellige fasene under en enkelt kjøring. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversikt over dyrkingen som utføres i denne studien presenteres i figur 2.
Figur 2: Skjematisk representasjon av de eksperimentelle forholdene for å teste pH- og rørerhastighetsprofiler i kulturstasjonene. Figuren representerer også riktig layout for å plassere fartøyene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Celleveksten i de automatiserte mikrobioreaktorene kan sammenlignes med bioreaktorene med flere bruk. Dette er avbildet i figur 3. Cellekonsentrasjonen fra de tre forskjellige skalaene sammenlignes, og det observeres at den 15 ml automatiserte mikrobioreaktoren etterligner 2 L glassbioreaktoren. Resultatene fra shake kolbe sammenlignes også med å vise fordelen av AMBR.
Figur 3: Sammenligning av den levedyktige cellekonsentrasjonen i forskjellige skalaer. 15 ml mikrobioreaktor, 150 ml ristekolbe og 2 L flerbruks glassbioreaktor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Påvirkning av forskjellig rørehastighet og pH studeres i de automatiserte mikrobioreaktorene. Levedyktig cellekonsentrasjon (VCC) er en av de vitale parametrene for å sammenligne dyrkingen. Figur 4 representerer sammenligningen av VCC og monoklonal antistoffkonsentrasjon i de forskjellige mikrobioreaktorene. Figur 5 representerer responskonturplottet til de to svarene som vurderes for sammenligningen, nemlig VCC og mAb-konsentrasjon. Verdiene er sammenlignbare i fartøyene med samme pH og forskjellig rørehastighet, noe som indikerer at rørehastigheten som er valgt for denne prosessen, ikke har noen signifikant innflytelse på prosessproduksjonen. For fremtidige dyrkinger, rørerhastighet på 1050 rpm ville bli brukt for å unngå skumdannelse.
PH har imidlertid en iøynefallende innvirkning på prosessutgangsdataene. Den negative påvirkningen av pH 6.9 på VCC kan observeres i figur 4A. Veksten av cellene forbedret seg betydelig under kulturen på pH 7.3 sammenlignet med pH 7.1. I figur 5Bsammenlignes monoklonal antistoffkonsentrasjon av de forskjellige dyrkingene. Produksjonen av mAb er langsommere i fartøyene som opprettholdes ved pH 7.3; Den endelige produktkonsentrasjonen kan imidlertid sammenlignes med fartøyet som opprettholdes ved pH 7.1.
Figur 4: Resultatet av DOE-eksperimentet. (A) Levedyktig cellekonsentrasjonsprofil av dyrkingskjøringen for å studere påvirkning av pH- og rørehastighet (B) Monoklonal antistoffkonsentrasjonsprofil over fed-batchprosessen i de respektive dyrkingsforholdene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Responskonturplott som indikerer påvirkning av pH og rørehastighet på henholdsvis maksimal levedyktig cellekonsentrasjon og monoklonalt antistoff. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
En av fordelene ved å bruke AMBR er kontinuerlig overvåking og kontroll av dyrkingen. Overvåkingen av pH kan observeres i figur 6. PH styres på settpunktet ved hjelp av CO2. Bolusfôringen fra dag 3 er ansvarlig for økningen i verdiene.
Figur 6: pH-overvåking i de automatiserte mikrobioreaktorene for dyrking, med settpunkter på pH 6.9, 7.1 og 7.3 og en rørehastighet på 1050 o/min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Prosessparametrene som brukes for fremtidige tester ble innsnevret ned til en rørehastighet på 1050 rpm og pH på 7,1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimalisering av prosessen for å øke utbyttet er av avgjørende betydning i biofarmasøytisk industri. Ristflasker kan potensielt brukes til screening av belastningen; Overvåkingen av prosessparametrene som pH og DO er imidlertid utilgjengelig ei kolbene. Mikrobioreaktorene har en fordel da de tillater kontinuerlig overvåking og kontroll av prosessen. Disse kontrollløkkene i mikrobioreaktoren gir også en tilstand som ligner på de i større skala, og dermed gir resultater som kan sammenlignes med de større bioreaktorene. En annen fordel med mikro-bioreactor er det brede spekteret av forhold som kan testes innen samme tidsramme og til en lavere pris sammenlignet med benktopp bioreaktorer i form av tid og arbeidskraft12,13 . Den mindre størrelsen er også en fordel når det gjelder lavere driftskostnader på grunn av redusert mengde substrat og redusert plasskrav for parallelle operasjoner; Imidlertid må kostnaden for fartøyene vurderes som det kan være dyrere å kjøre en dyrking i engangsmikrobioreaktorer sammenlignet med benktoppen multiuse bioreaktor.
Mens det er flere fordeler med systemet, er det noen betydelige ulemper ved å bruke mikrobioreaktorene. Det er mulig å endre pH og DO for hvert av fartøyet innenfor en kulturstasjon; Rørerhastigheten og temperaturen kan ikke endres for et enkelt fartøy. Dette øker antall eksperimenter som utføres for å etablere optimal rørehastighet og temperatur. De elektroniske målingene er begrenset til pH og DO. Sanntidsprosessovervåking av de kritiske prosessparametrene (CPP), for eksempel temperatur, pH, DO, ville være gunstig for å unngå forsinkelsen mellom prøvetaking og analyse. Det har potensial til å være et nyttig verktøy for å optimalisere produktiviteten14. Utvikling innen spektroskopiske målinger i mikrobioreaktorer kan vise seg å være gunstig i de fremtidige modellene.
Fordelene oppveier ulempene ved å bruke den automatiserte mikrobioreaktoren. Det er imidlertid noen kriterier som skal vurderes når du bruker disse systemene. Først og fremst er utformingen av skriptet for å kunne kjøre dyrkingen. Det er av avgjørende betydning at skriptet som er skrevet, er inkluderende for alle de avgjørende trinnene som definisjon av platene sammen med riktig kartlegging av platen og fartøyene. Alle parametrene må kontrolleres før du starter eksperimentet. Kontroller at ingen prosesstrinn er planlagt å skje samtidig. Dette vil resultere i at arbeidsstasjonen velger ett trinn over det andre.
Et annet viktig kriterium å være fokusert på er bruk av klemmeplatene. Platene er autoklativerfør hver dyrking; dette kan føre til skade på O-ringene. Kontroller O-ringene visuelt før du klaser. Defekte O-ringer kan føre til uventet variasjon i DO- og pH-kontrollen. Den andre faktoren for defekte avlesninger kan være en løs forbindelse mellom klemmeplaten og karene. Kontroller klemplaten og røreplatene er godt festet til omrøringsenheten. Bruk strammeverktøyet som følger med systemet.
Under dyrkingen er det avgjørende å visuelt overvåke skummet. Minst 20 μL av skum er nødvendig ved starten av dyrkingen. Skumdannelse vil resultere i at væske er tilstede i bunnet på klemmeplaten. Overskudd av skummet i klemmeplaten vil føre til overløp, noe som fører til at skummet samles på bunnen av kulturstasjonen, og skjuler pH- og DO-flekkene som skal leses av sensoren.
En annen viktig faktor å fokusere på er bruken av DOE-programvaren. Den integrerte DOE-programvaren muliggjør rask utforming av prosessen som omfatter de relevante forholdene. Visualiseringen av fartøyene som brukes sikrer at ingen faktor har blitt oversett. En av fordelene med DOE-analyse er at eksperimentene kan konfigureres via arbeidspakker, og konfigurere hver bioreaktor med definerte bioprosesseringsparametere. Alle dataene som genereres analyseres ved hjelp av MODDE. Programvaren administrerer den store mengden data som genereres i løpet av eksperimentet. Et generelt delsettdesignoppsett genererer en sekvens med redusert utformingssett, og løser dermed problemet med multivariatkalibrering.
En detaljert prosedyre for å kjøre en Design of Experiment i en automatisert mikrobioreaktor er demonstrert i denne artikkelen. Protokollen ble utformet for å fokusere på feed batch prosessen. DOE-programvaren hjalp til med å etablere de optimale prosessparametrene for å øke biomassen og titerkonsentrasjonen. Dyrkingsdataene ble også sammenlignet med et eksperiment utført i en shake kolbe og en 2 L benk-top bioreaktor. Resultatene viser reproduserbarheten og skalerbarheten av prosessen. Målet med protokollen var å demonstrere bruken av automatiserte mikrobioreaktorer i en fôrbatchprosess og å analysere bioprosesseringsparametrene ved hjelp av DOE-programvaren. Det kan konkluderes med at de automatiserte mikrobioreaktorene er nyttige for prosessutviklingen, og disse kan utvides til et semiperfusjonssystem15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), Det føderale utdannings- og forskningsdepartementet, Tyskland og BioProcessing-teamet til Sartorius Stedim Biotech GmbH, Tyskland, for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
- Langer, E. S. 15th Annual report and survey of Biopharmaceutical Manufacturing Capacity and Production: A study of Biotherapeutical Developers and Contract Manufacturing Organizations. Bioplan Associates. , Available from: http://bioplanassociates.com/wp-content/uploads/2018/07/15thAnnualBiomfgReport_TABLEOFCONTENTS-LR.pdf (2019).
- Walsh, G.
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells - where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, Springer. New York. (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al.
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
