Summary
Questo modello animale consente ai ricercatori di indurre linfedema secondario statisticamente significativo nell'arto posteriore dei topi, della durata di almeno 8 settimane. Il modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia del linfedema e per studiare nuove opzioni di trattamento.
Abstract
I modelli animali sono di fondamentale importanza nella ricerca del linfedema per comprendere la fisiopatologia della malattia, ma anche per esplorare le potenziali opzioni di trattamento. Questo modello murino consente ai ricercatori di indurre linfedema significativo della durata di almeno 8 settimane. Il linfodatama viene indotto utilizzando una combinazione di radioterapia frazionata e ablazione chirurgica dei linfatici. Questo modello richiede che i topi ottono una dose di radiazioni da 10 Gray (Gy) prima e dopo l'intervento chirurgico. La parte chirurgica del modello prevede la legatura di tre linfatici e l'estrazione di due linfonodi dall'arto posteriore del topo. Avere accesso a strumenti microchirurgici e un microscopio è essenziale, a causa delle piccole strutture anatomiche dei topi. Il vantaggio di questo modello è che si traduce in linfedema statisticamente significativo, che fornisce una buona base per valutare diverse opzioni di trattamento. È anche una grande e facilmente disponibile opzione per l'allenamento microchirurgico. La limitazione di questo modello è che la procedura può richiedere molto tempo, soprattutto se non praticata in anticipo. Il modello si traduce in linfedema oggettivamente quantificabile nei topi, senza causare grave morbilità ed è stato testato in tre progetti separati.
Introduction
Il linfedema è caratterizzato da un accumulo di fluido linfatico che porta al gonfiore del tessuto localizzato, che si verifica principalmente a causa di un flusso alterato o interrotto del fluido linfatico nei vasi linfatici1. Il flusso linfatico può essere alterato o interrotto da infezione, ostruzione, lesioni o difetti congeniti nel sistema linfatico2. Queste eziologie provocano l'accumulo di liquido linfatico, che porta ad uno stato cronico di infiammazione, con conseguente successiva fibrosi, così come la deposizione del tessuto adiposo3. Il linfedema può essere classificato come linfedema primario o secondario. Il linfedema primario è causato da anomalie dello sviluppo omutazionegenetica 2,4. Linfedema secondario si verifica a causa della malattia sistemica sottostante, chirurgia o trauma2,4. Il linfedema secondario è la forma più comune di linfedema nel mondo2. Nei paesi sviluppati, la causa più comune del linfedema secondario è la terapia oncologica come la radioterapia adiuvante e la dissezione dei linfonodi5. Il linfedema è più frequente tra i pazienti affetti da cancro al seno, ma può anche svilupparsi in pazienti con ginecologia, melanoma, cancro genitourinario o al collo6. È stato suggerito che su tutte le donne diagnosticate con cancro al seno, il 21% svilupperà il linfedema7.
Il linfodema può essere stressante per il paziente sia fisicamente che psicologicamente. I pazienti con linfedema hanno un aumentato rischio di infezione5,8,9, scarsa qualità della vita e possono sviluppare ansia sociale e sintomi di depressione10. Le complicazioni del linfedema cronico portano ad un alto costo delle cure e ad un aumento del carico di malattia9,11. I risultati hanno anche suggerito che il linfedema potrebbe essere associato ad un aumento del rischio di morte dopo il trattamento del cancro al seno12. La gestione conservativa come la compressione dell'area interessata, il drenaggio manuale della linfa e la cura generale della pelle rimangono il primo approccio di linea. Attualmente non esiste un trattamento curativo6. Anche se sono stati fatti progressi nel campo della terapia chirurgica e medica, c'è ancora spazio per migliorare. Sono necessarie ulteriori ricerche, che forniscono informazioni sulla fisiopatologia e la progressione della malattia, per consentire ai medici di fornire migliori opzioni di trattamento per i pazienti5.
I modelli animali vengono utilizzati nella ricerca preclinica per comprendere la fisiopatologia delle malattie e sviluppare potenziali opzioni di trattamento. Diversi modelli animali di linfedema sono stati stabiliti in canini13,14, conigli15, pecore16, maiali17,18 e roditori19,20, 21,22,23,24. Il modello dei roditori sembra essere il modello più conveniente, quando si studia la ricostruzione della funzione linfatica, a causa della facilità accessibili dei roditori e relativamente a basso prezzo25. La maggior parte dei modelli di topi si sono concentrati sull'indurre linfedema nella coda dei topi21,22,23. Il modello di coda è molto affidabile, ma l'esatta tecnica chirurgica per indurre il linfedema varia in modo significativo nel materiale pubblicato in precedenza. Ciò si traduce in fluttuazioni di durata e robustezza del linfedema sviluppato presentato in litterature noto25. Diverse tecniche vengono utilizzate anche per indurre linfedema nel modello dell'arto posteriore e producono anche risultati variabili, ma il modello dell'arto posteriore potrebbe essere più facile da capire da una prospettiva traslazionale. Precedenti modelli di linfedema sono stati ostacolati dalla risoluzione spontanea del linfedema e quindi è necessario un modello di linfedema riproducibile e permanente25. I ricercatori hanno già cercato di aumentare la dose di radiazioni, per prevenire la risoluzione spontanea del linfedema, ma questo ha spesso portato a successiva grave morbilità25.
Questo modello si traduce in linfedema statisticamente significativo, senza causare grave morbilità, combinando microchirurgia con radiazioni. Il modello è stato rivisto da un precedente modello chirurgico aggiungendo una dose di irradiazione che induce il linfedema, senza causare grave morbilità26. Offre anche una grande opportunità per l'allenamento microchirurgico. Avere accesso a apparecchiature microchirurgiche e un microscopio è necessario, a causa delle piccole strutture anatomiche dei topi. La procedura chirurgica può essere eseguita quando all'utente sono state insegnate tecniche microchirurgiche di base, come la sutura con strumenti microchirurgici. Gli operatori che hanno eseguito questa procedura tutti guardato video tutorial da Acland sui presupposti di abilità microchirurgiche (1981) e tecnica di microsutura di base (1985). Si consiglia di praticare la procedura chirurgica 8-10 volte prima di utilizzarlo nella ricerca. La pratica della procedura garantisce che vengano commessi meno errori e che la procedura possa essere eseguita in modo più efficiente. Quando masterizzato, la procedura chirurgica può essere eseguita in 45 minuti.
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Protocol
Gli animali erano ospitati presso l'University of Southern Denmark Animal Care Facility secondo le linee guida istituzionali. Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Ispettorato per gli esperimenti sugli animali, dal Ministero dell'Ambiente e degli alimenti della Danimarca.
1. Irradiazione pre-operatoria
NOTA: L'irradiazione pre-chirurgica avviene 7 giorni prima dell'intervento chirurgico.
- Indurre l'anestesia.
- Posizionare il topo in una scatola di induzione e impostare il vaporizzatore al 3% isoflurane con una portata di ossigeno di 0,8-1,2 L/min per indurre l'anestesia di inalazione.
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare anestetici iniettabili, ma per la breve durata dell'irradiazione dell'irradiazione di anestesia era sufficiente. Per ottenere i risultati presentati in questo articolo, 9 settimane vecchia femmina C57BL6 topi sono stati utilizzati. - Assicurarsi che il mouse sia completamente aerato dal test di pizzico della coda o della zampa.
- Posizionare il topo in una scatola di induzione e impostare il vaporizzatore al 3% isoflurane con una portata di ossigeno di 0,8-1,2 L/min per indurre l'anestesia di inalazione.
- Posizionare il mouse per l'irradiazione.
- Se completamente sedato, spostare il mouse dalla scatola di induzione e posizionarlo sotto la fonte di radiazione in posizione supina e fissare delicatamente gli arti posteriori con nastro adesivo.
NOTA: Il mouse rimarrà sedato per la breve durata della radiazione. - Posizionare un cuscinetto di piombo spesso 1,5 mm per garantire che venga irradiata solo l'area che subisce un intervento chirurgico (ad esempio, l'area circolare con un diametro di 25 mm intorno al ginocchio).
- Se completamente sedato, spostare il mouse dalla scatola di induzione e posizionarlo sotto la fonte di radiazione in posizione supina e fissare delicatamente gli arti posteriori con nastro adesivo.
- Somministrare una dose di 10 Gy radiazioni ad un tasso di dose di 5.11 Gy/min (100 kVp, 10 mA).
AVVISO: le precauzioni di sicurezza devono essere prese quando si lavora con le radiazioni. Durante questo esperimento, tutta l'irradiazione è stata eseguita in una stanza isolata dalle radiazioni, e la fonte di radiazioni è stata accesa solo quando tutto il personale aveva lasciato e sigillato la stanza. - Posizionare il mouse nella sua gabbia.
2. Configurazione dell'attrezzatura
NOTA: La chirurgia deve essere eseguita in una stanza dedicata alle procedure chirurgiche. La superficie operativa deve essere sterile.
- Pulire accuratamente tutte le superfici operative con il 70% di etanolo. Indossare rete per capelli e coperture. Utilizzare strumenti chirurgici sterili e guanti sterili.
- Preparare l'anestesia.
- Redigere 1 mL di fentanil (0,315 mg/mL), 1 mL di midazolam (5 mg/mL) e 2 mL di acqua sterile. Utilizzare siringhe e aghi diversi per i diversi componenti.
- Mescolare il fentanil e l'acqua sterile svuotando lentamente le siringhe in un tubo di vetro sterile. Se miscelato, aggiungere midazolam per completare la soluzione di lavoro.
- Preparare l'analgesia.
- Disegnare 0,2 mL di buprenorfina (0,3 mg/mL) e 2 mL di salina.
- Mescolare i volumi svuotando lentamente le siringhe in un tubo di vetro sterile per completare la soluzione di lavoro.
- Accendere il microscopio e assicurarsi che l'illuminazione sia sufficiente e che il microscopio sia ben regolato per gli occhi dell'operatore.
NOTA: Tutte le procedure chirurgiche devono essere eseguite al microscopio operativo. È sufficiente un intervallo di ingrandimento che va da 4x-25x.
3. Preparazione
- Pesare il mouse prima dell'intervento posizionando il mouse in un contenitore vuoto su una scala cancellata.
- Amministrare l'anestetico.
- Disegnare 0,1 mL di anestetico per 10 g di peso corporeo del topo. Iniettare l'anestetico sottocutaneo come iniezione di bolus.
- Lasciate riposare il topo in una gabbia con abbondante biancheria da letto e riparo per circa 10 min fino a quando completamente sedato. Esaminare la profondità anestetica valutando il rilassamento muscolare ed eseguire il test del pizzico della zampa o della coda.
- Quando è completamente sedato, radere l'arto posteriore scelto per la procedura utilizzando clipper elettrici. Assicurarsi di pulire i capelli in eccesso.
- Accendere il dispositivo di riscaldamento, ad esempio una piastra di riscaldamento e coprirlo con un panno chirurgico.
- Impostare il flusso di ossigeno a 0,8 L/min e collegarlo con un nosecone. Utilizzare ossigeno al 100%.
NOTA: Il nosecone è solo per la consegna di ossigeno e non l'anestesia. - Applicare unguento oftalmico e iniettare 0,5 mL di sottocutanea salina, preferibilmente nella mischia del topo, per prevenire l'ipovolemia durante l'intervento chirurgico.
- Posizionare il mouse per l'intervento chirurgico.
- Posizionare il mouse sul panno chirurgico in posizione supina. Posizionare il naso sul muso.
- Fissare delicatamente l'estremità degli arti posteriori con del nastro adesivo per evitare che il mouse si sposti durante l'intervento chirurgico.
- Sterilizzare la pelle con alcool / clorhexidine o alcol / iodio povidone.
4. Chirurgia
NOTA: In questo esempio, l'arto posteriore sinistro (quando il mouse è visualizzato in posizione supina), è stato scelto per la procedura.
- Fare un'incisione circolare.
- Sollevare la pelle con pinze lisce e tagliare una piccola apertura di circa 5 mm proximal alla fossa popliteal.
- Far scorrere le forbici affilate nell'apertura e tagliare verso il ginocchio in modo che l'incisione termina appena sopra il ginocchio. Assicurarsi di non forare i vasi sottostanti sollevando la pelle con pinze durante il clipping.
- Spostare il mouse in posizione prona e continuare a tagliare dal ginocchio verso la fossa popliteale fino a quando l'incisione circonferenziale è completa.
- Dissezionare la pelle sotto il ginocchio.
- Sezionate delicatamente l'area sotto il ginocchio a un paio di millimetri sopra la caviglia, aprendo e chiudendo lentamente i microscistori sollevando la pelle con pinze.
- Tagliare con attenzione le restanti aderesi visibili utilizzando microscissors. Utilizzare regolarmente salina sterile per mantenere il tessuto umido durante l'intera procedura.
- Dissezionare la pelle sul bordo prossimale dell'incisione cirferenziale in modo che possa essere ritratta con un retrattore elastico.
NOTA: Il retrattore consente all'operatore una migliore visione del recipiente linfoentico prossimale e impedisce al bordo prossimale di spostarsi durante l'intervento chirurgico. - Mentre è ancora in posizione prona, ruotare delicatamente l'arto posteriore e fissarlo con del nastro adesivo, in modo che la vena ischiatica sia visibile dal punto più prossimale dell'area esposta al punto più distale.
- Iniettare circa 0,01 mL di Brevetto Blu V sottocutaneamente tra il secondo e il terzo dito utilizzando una siringa da 0,5 mL con un ago da 30 G. Premere delicatamente la zampa un paio di volte per distribuire il Brevetto Blu V. Visualizzare i vasi linfatici e il linfonodo al microscopio mentre il Brevetto Blu V riempie i vasi linfatici.
NOTA: Se il colore blu dei vasi linfatici svanisce durante la procedura, massaggiare delicatamente la zampa per promuovere l'assorbimento, anziché iniettare più Brevetto Blu V. L'uso in eccesso di Brevetto Blu V può causare perdite e colorazione del tessuto che circonda i compromettere la procedura. - Individuare le strutture importanti: il linfonodo popliteale (PLN), i due vasi linfatici dissitale al linfonodo (DLV1 e DLV2), e l'unico vaso lincido proscisiale al linfonodo (PLV).
NOTA: Tutti i vasi linfatici si trovano adiacente alla vena ischiatica. Il recipiente lincido prossimale si trova di solito mediale alla vena, i due vasi linfatici distali si trovano mediali e laterali alla vena. Le abbreviazioni delle strutture sono utilizzate nel video di accompagnamento. - Ingrandisci per visualizzare chiaramente il PLV e legialo con una sutura in nylon 10-0 utilizzando il supporto micro-ago e le microforza. Premere la zampa un paio di volte per assicurarsi che nessun Brevetto Blu V passi prossimaalla alla sutura.
NOTA: Potrebbe essere necessario tagliare il grasso che circonda il vaso linfatico. - Ripetere il passo 4.7 per legarsi i due vasi linfatici distale. Premere più volte la zampa per assicurarsi che nessun Brevetto Blu V passi prossima alla legatura. Se i vasi linfatici si trovano vicino alla vena ischiatica, prova a sezionare ancora distally.
NOTA: In questo esempio, si può vedere che uno dei vasi linfatici scoppia a causa della legatura che ostacola il flusso linfatico. I vasi linfatici spesso si dividono dalla vena più in basso. - Rimuovere il linfonodo popliteale.
- Individuare il linfonodo popliteale e ritagliare un piccolo foro con microscissors per accedervi e rimuoverlo con microforcep e microscisors.
NOTA: Il linfonodo ha una superficie liscia simile a una perla in contrasto con il tessuto adiposo circostante. - Per verificare se il tessuto rimosso è un linfonodo, metterlo in una provetta piena d'acqua.
NOTA: Se il tessuto è costituito da grasso, il tessuto galleggia. Se il tessuto è un linfonodo, affonderà sul fondo.
- Individuare il linfonodo popliteale e ritagliare un piccolo foro con microscissors per accedervi e rimuoverlo con microforcep e microscisors.
- Rimuovere il cuscinetto inguinale e il linfonodo.
- Prima di rimuovere il cuscinetto inguinale, utilizzare un coagulatore bipolare per cauterizzare i vasi che attraversano il grasso.
- Riseguitare il cuscinetto di grasso inguinale utilizzando microforcep e microscissors. Agganciare delicatamente i vasi cauterizzati che attraversano il grasso. Quindi resect delicatamente il tessuto adiposo nella zona inguinale.
NOTA: Il linfonodo situato nel grasso è raramente colorato da Brevetto Blu V e può essere difficile da distinguere dal grasso. Rimuovere il cuscinetto di grasso in un unico pezzo è il modo migliore per garantire che il linfonodo sia stato rimosso.
- Sciacquare accuratamente la gamba con una salina sterile e confermare attraverso il microscopio che eventuali piccoli peli e particelle sono stati accuratamente rimossi dall'area chirurgica per evitare la contaminazione e l'infezione della ferita. Assicurarsi che non vi sia alcunsanguinamento attivo.
- Suturare i bordi della pelle fino alla facia muscolare con una sutura di nylon 6-0 utilizzando pinze e porta aghi, lasciando uno spazio di 2/3 mm per vincolare il flusso linfatico superficiale.
NOTA: Il video di accompagnamento mostra un esempio di suture finite. - Amministrare l'analgesia. Disegnare 0,1 mL di analgesia per 30 g di peso corporeo del topo. Iniettare l'analgesia sottocutaneamente come iniezione di bolus.
- Pesare il mouse per post-chirurgia per il confronto.
- Posizionare il mouse in una gabbia in un armadio riscaldato per il recupero.
5. Assistenza postoperatoria
- Dare ai topi singole gabbie per recuperare dopo l'intervento chirurgico con acqua e cibo ad libitum.
- Somministrare una dose sottocutanea bolus di 0,02 mL di buprenorphine 3x al giorno per 3 giorni per l'analgesia.
- Monitorare l'animale ogni giorno per un'adeguata guarigione delle ferite, segni di dolore e infezione. Se sono presenti segni di infezione, utilizzare unguento antibiotico.
6. Irradiazione post-operatoria
- Tre giorni dopo l'intervento chirurgico, ripetere la procedura per l'irradiazione pre-chirurgia (passaggi 1.1.4.4).
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Representative Results
Questa procedura è stata precedentemente utilizzata in tre esperimenti separati. Tutti gli esperimenti sono stati fatti da diversi ricercatori principali che sono tutti co-autori di questo articolo. In tutti e tre gli esperimenti, è stata prestata molta attenzione ad aderire alla stessa procedura descritta in questo protocollo. In tutti e tre gli esperimenti, il linfedema secondario è stato indotto in un arto posteriore, mentre l'altro limbh posteriore fungeva da controllo. I volumi degli arti posteriori sono stati il risultato principale in tutti e tre gli esperimenti. Figura 1 illustra la progettazione dello studio.
Tutti i topi sono stati sottoposti a scansioni di tomografia micro-calcolata nelle settimane successive all'intervento chirurgico per misurare il volume degli arti posteriori. Le scansioni di CT sono state eseguite su uno scanner preclinico multimodalità (Tabella dei materiali) e il volume degli arti posteriori è stato misurato tramite la funzione di regione di interesse (ROI) nel software associato come descritto in precedenza26. L'articolazione tibiofibuare distale si trovava in immagini assonali tridimensionali (3D) utilizzando un metodo descritto in precedenza27. Il ROI è iniziato nell'articolazione tibiofibular distale e comprendeva tutti i tessuti discriminati fino a quel punto. La gamma Hounsfield per l'analisi è stata impostata su -500 a 4000.
Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando un software statistico (Tabella dei materiali). Il test di confronto multiplo di Sidak è stato utilizzato per confrontare il volume dell'arto posteriore del linfedema indotto, con l'arto posteriore di controllo. Una differenza significativa tra l'arto posteriore di controllo e l'adema posteriore è definita come un valore P <0.05.
Figura 1: Progettazione dello studio e punti temporali per le misurazioni dei risultati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'esperimento 126 includeva 32 topi distribuiti in gruppi di quattro. Uno degli obiettivi era quello di studiare diverse dosi di radiazioni e trovare la dose più preferibile, per indurre linfedema duraturo senza causare grave morbilità. Il gruppo a cui sono state somministrate due dosi di 10 Gy di irradiazione comprendeva quattro topi. La figura 2 mostra che uno stato costante di linfedema è stato raggiunto in tutte le 8 settimane. La tabella 1 mostra che c'era una differenza significativa di volume tra l'arto posteriore del linfedema e l'arto posteriore di controllo nelle settimane 1, 7 e 8. Sebbene sia stato raggiunto uno stato costante di linfedema indotto, non c'era una differenza statisticamente significativa tra gli arti posteriori durante tutte le 8 settimane. Questo risultato differisce dagli altri due esperimenti e potrebbe essere spiegato a causa delle dimensioni del campione relativamente più piccole di quattro topi. Aumentare il numero di misurazioni aumenterebbe la potenza dello studio e quindi la probabilità di rilevare una differenza se esiste una differenza28.
Figura 2: Volume medio degli arti posteriori: Esperimento 1. In questa figura sono incluse le misurazioni di 4 topi del gruppo a cui sono state somministrate due dosi di 10 Gy di irradiazione. Questo grafico mostra i volumi medi dell'arto posteriore in mm3 nelle 8 settimane dopo l'intervento chirurgico. Tutti i topi hanno ricevuto una dose di 10 Gy irradiazione pre e post-chirurgia. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| settimana | Volume del linfedema in mm3 (n | Volume di controllo in mm3 (n ) | Valore P | 95% Intervallo di confidenza |
| 1 | 218,53 x 9,3 | 136,78 x 2,48 | 0.002 | 53,77-109,73 |
| 2 | 202,25 : 10,24 | 141,88 x 8,02 | 0.066 | (-6,53) |
| 3 | 193,28 x 10,80 | 141,20 - 6,80 | 0.060 | (-3,7) |
| 4 | 194,95 : 21,05 | 141,50 x 8,03 | 0.224 | (-41,85) |
| 5 | 193,75 : 7,07 | 141,70 x 8,60 | 0.051 | (-0,27)-104.37 |
| 6 | 193,23 x 3,42 | 141,78 x 10,29 | 0.054 | (-1,56) |
| 7 | 194,95 - 7,26 | 143,23 x 8,90 | 0.050 | 0,17-103,28 |
| 8 | 195,8 : 9,65 | 152,18 - 5,81 | 0.009 | 19,88-67,38 |
Tabella 1: test di confronto multiplo di Sidak: Esperimento 1. Questa tabella mostra il confronto statistico tra i volumi medi degli arti posteriori linfatici indotti e gli arti posteriori di controllo durante le 8 settimane successive all'intervento chirurgico. Tutti i topi hanno ricevuto una dose di 10 Gy irradiazione pre e post-chirurgia. I valori sono presentati come: media : SD in mm3. Il valore P < 0,05 è considerato una differenza significativa tra l'arto posteriore di controllo e l'arto posteriore linfata. n (numero di osservazioni) : 4 .
L'esperimento 2 includeva 45 topi. 15 topi hanno servito come controlli e sono stati dati iniezioni saline. I controlli sono utilizzati come risultati rappresentativi in quanto si presume che le iniezioni saline non abbiano avuto alcun effetto sul volume del linfedema indotto. La figura 3 mostra che il linfedema era meno stabile rispetto all'esperimento 1. Inoltre, il volume degli arti posteriori di controllo è aumentato durante le 8 settimane. Ciò riduce la differenza relativa presentata nella tabella 2. È stato ipotizzato che i topi usino di più la loro zampe posteriore non operata, nelle settimane successive all'intervento chirurgico, e che questo porta all'ipertrofia e all'aumento del volume degli arti dell'arto posteriore non operato. Ancora più importante, la tabella 3 mostra che c'è una differenza statisticamente significativa tra l'arto posteriore del linfedema e l'arto posteriore di controllo durante tutte le 8 settimane dopo l'intervento chirurgico. Il maggior numero di topi dimostra che questa procedura può indurre linfedema statisticamente significativo per almeno 8 settimane.
Figura 3: Volume medio degli arti posteriori: Esperimento 2. Le misurazioni di 15 topi del gruppo di controllo sono incluse in questa cifra. Questo grafico mostra i volumi medi dell'arto posteriore in mm3 nelle 8 settimane dopo l'intervento chirurgico. Tutti i topi hanno ricevuto una dose di 10 Gy irradiazione pre e post-chirurgia. Le barre di errore rappresentano SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Esperimento 1 | Esperimento 2 | Esperimento 3 | Esperimento 1, 2 e 3 combinati | |||||
| settimana | Differenza assoluta (mm3) | Differenza relativa (%) | Differenza assoluta (mm3) | Differenza relativa (%) | Differenza assoluta (mm3) | Differenza relativa (%) | Differenza assoluta (mm3) | Differenza relativa (%) |
| 1 | 81,75 x 7,20 | 0,60 x 0,04 | 104.34 : 25,96 | 0,76 - 0,23 | 85,20 X 35,05 | 0,64 x 0,27 | 94.02 - 29,57 | 0,69 x 0,24 |
| 2 | 60,38 x 17,21 | 0,43 x 0,14 | 107.12 - 44,33 | 0,79 x 0,33 | 85,63 x 37,94 | 0,63 x 0,29 | 92,77 x 41,68 | 0,68 x 0,31 |
| 3 | 52,08 x 14,35 | 0,37 - 0,11 | 78,77 x 39,45 | 0,57 - 0,28 | 74,67 x 49,57 | 0,54 x 0,38 | 73,74 x 41,51 | 0,53 x 0,31 |
| 4 | 53,45 x 24,51 | 0,38 x 0,19 | 50,67 x 29,94 | 0,36 x 0,21 | 50,62 x 16,35 | 0,37 - 0,11 | 51.01 - 24,03 | 0,37 - 0,17 |
| 5 | 52,05 : 13,46 | 0,37 - 0,11 | 32,74 x 24,66 | 0,22 x 0,17 | 42,67 x 11,81 | 0,31 - 0,07 | 39.08 - 20,02 | 0,27 x 0,14 |
| 6 | 51,45 x 13,63 | 0,36 - 0,11 | 26,80 x 22,35 | 0,18 x 0,14 | 32,86 x 10,90 | 0,22 - 0,08 | 32,32 x 18,96 | 0,21 - 0,13 |
| 7 | 51,73 x 13,26 | 0,36 - 0,11 | 19.04 - 17,22 | 0,12 - 0,11 | - | - | 25,92 x 21,15 | 0,17 - 0,15 |
| 8 | 43,63 x 6,11 | 0,29 x 0,04 | 15,15 x 11,70 | 0,10 - 0,08 | - | - | 21.15 x 15,96 | 0,14 x 0,10 |
Tabella 2: Differenza assoluta e relativa. Questa tabella mostra la differenza assoluta di volume tra linfedema e zampe posteriori di controllo: SD in mm3 e la differenza relativa SD in percentuale.
| settimana | Volume del linfedema in mm3 (n - 15) | Volume di controllo in mm3 (n - 15) |
Valore P | 95% Intervallo di confidenza |
| 1 | 241,82 : 35,69 | 137,48 x 21,54 | <0.001 | 82.21-126.47 |
| 2 | 242,41 - 45,13 | 135,29 x 5,81 | <0.001 | 69.33.144.89 |
| 3 | 216,85 : 41,47 | 138,08 : 5,31 | <0.001 | 45,15-112,39 |
| 4 | 193,10 - 31,27 | 142,43 x 5,29 | <0.001 | 25,15-76,18 |
| 5 | 180.03 - 26,03 | 147,29 - 6,45 | 0.002 | 11.72-53,76 |
| 6 | 179,89 - 25,00 | 153,09 - 6,56 | 0.004 | Ore 7.74-45,85 |
| 7 | 176,45 : 19,77 | 157.41 - 7,49 | 0.008 | 4,35-33,71 |
| 8 | 166,97 x 11,8 | 151,82 : 10,07 | 0.002 | 5,18,25,12 |
Tabella 3: Test di confronto multiplo di Sidak: Esperimento 2. Questa tabella mostra il confronto statistico tra i volumi medi degli arti posteriori linfatici indotti e gli arti posteriori di controllo nelle 8 settimane successive all'intervento chirurgico. Tutti i topi hanno ricevuto una dose di 10 Gy irradiazione pre e post-chirurgia. I valori sono presentati come: media : SD in mm3. Il valore P < 0,05 è considerato una differenza significativa tra l'arto posteriore di controllo e l'arto posteriore linfata. n (numero di osservazioni) : 15.
L'esperimento 3 includeva 36 topi. 12 topi hanno servito come controlli e sono stati dati iniezioni saline. I controlli sono utilizzati come risultato rappresentativo in quanto si presume che le iniezioni saline non abbiano avuto alcun effetto sul volume del linfedema indotto. In questo esperimento il volume degli arti posteriori dei topi è stato misurato per 6 settimane invece di 8. L'esperimento è durato solo 6 settimane a causa di difficoltà logistiche quando l'esperimento è stato eseguito. La figura 4 mostra un linfedema più coerente dell'esperimento 2. Tabella 4 mostra che c'è un linfedema statisticamente significativo nelle 6 settimane dopo l'intervento chirurgico.
Figura 4: Volume medio degli arti posteriori: Esperimento 3. In questa figura sono incluse le misurazioni di 12 topi del gruppo di controllo. Questo grafico mostra i volumi medi dell'arto posteriore in mm3 nelle 6 settimane successive all'intervento chirurgico. Tutti i topi hanno ricevuto una dose di 10 Gy irradiazione pre e post-chirurgia. Le barre di errore rappresentano SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| settimana | Volume del linfedema in mm3 (n - 12) | Volume di controllo in mm3 (n - 12) | Valore P | 95% Intervallo di confidenza |
| 1 | 219,06 - 35,00 | 133,86 - 10,02 | <0.001 | 51,66-118,74 |
| 2 | 220,90 x 36,98 | 135,27 - 5,89 | <0.001 | 49.33.121.94 |
| 3 | 211,74 x 47,30 | 137,07 - 7,56 | 0.002 | Numero di ore su 27.24.122.11 |
| 4 | 186,09 x 20,36 | 135,47 - 5,70 | <0.001 | 34,98-66,27 |
| 5 | 182,35 : 18,25 | 139,68 - 7,45 | <0.001 | 31,37-53,98 |
| 6 | 183,44 x 12,11 | 150,58 x 8,37 | <0.001 | 22,42-43,29 |
Tabella 4: Test di confronto multiplo di Sidak: Esperimento 3. Questa tabella mostra il confronto statistico tra i volumi medi degli arti posteriori linfatici indotti e gli arti posteriori di controllo nelle 6 settimane successive all'intervento chirurgico. Tutti i topi hanno ricevuto una dose di 10 Gy irradiazione pre e post-chirurgia. I valori sono presentati come: media : SD in mm3. Il valore P < 0,05 è considerato una differenza significativa tra l'arto posteriore di controllo e l'arto posteriore linfata. n (numero di osservazioni) : 12.
La figura 5 e la tabella 5 mostrano il volume medio degli arti posteriori di tutti e tre gli esperimenti combinati. La tabella 5 mostra che l'uso di questa procedura si traduce in un linfedema statisticamente significativo della durata di almeno 8 settimane. I dati delle prime 6 settimane sono le misurazioni combinate di 31 topi degli esperimenti 1, 2 e 3. Nella settimana 7-8 abbiamo avuto solo i dati degli esperimenti 1 e 2 che hanno ottenuto misurazioni combinate da 19 topi.
Figura 5: Volume combinato dell'arto posteriore medio: Esperimento 1, 2 e 3. Trentuno topi inclusi nelle prime 6 settimane dopo l'intervento chirurgico e 19 topi inclusi nelle due settimane successive. Questo grafico mostra i volumi medi dell'arto posteriore in mm3 nelle 8 settimane dopo l'intervento chirurgico. Tutti i topi hanno ricevuto una dose di 10 Gy irradiazione pre e post-chirurgia. Le barre di errore rappresentano SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| settimana | Volume del linfedema in mm3 (Settimana 1-6 n - 31) (Settimana 7/8 n - 19) |
Volume di controllo in mm3 (Settimana 1-6 n - 31) (Settimana 7/8 n - 19) |
Valore P | 95% Intervallo di confidenza |
| 1 | 230,00 : 34,46 | 135,99 : 16,03 | <0.001 | 78.19-109.84 |
| 2 | 228,90 : 40,91 | 136,13 - 6,32 | <0.001 | 70,47,115,07 |
| 3 | 211,83 : 41,15 | 138,09 - 6,36 | <0.001 | 51,53-95,95 |
| 4 | 190,63 x 25,81 | 139,62 - 6,54 | <0.001 | 38,15-63,87 |
| 5 | 182,70 x 21,52 | 143,62 - 7,79 | <0.001 | 28,36-49,79 |
| 6 | 182,98 : 19,11 | 150,66 x 8,36 | <0.001 | 22,18,42,47 |
| 7 | 180,34 x 19,31 | 154,43 : 9,60 | <0.001 | 11.61-40.22 |
| 8 | 173,04 - 16,42 | 151,89 x 9,19 | <0.001 | 10.35-31,94 |
Tabella 5: Test di confronto multipli di Sidak: Esperimento 1, 2 e 3 combinati. Questa tabella mostra il confronto statistico tra i volumi medi degli arti posteriori del linfedema indotta e gli arti posteriori di controllo di 31 topi nelle prime 6 settimane dopo l'intervento chirurgico e 19 topi nelle due settimane successive. Tutti i topi hanno ricevuto una dose di 10 Gy irradiazione pre e post-chirurgia. I valori sono presentati come: media : SD in mm3. Il valore P < 0,05 è considerato una differenza significativa tra l'arto posteriore di controllo e l'arto posteriore linfata. n (numero di osservazioni) : 31.
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Discussion
Ci sono alcuni passaggi critici in questo protocollo. In primo luogo, è importante che i ricercatori prendano precauzioni di sicurezza quando lavorano con la radioattività. In secondo luogo, durante la parte chirurgica di questo protocollo, è importante iniziare la procedura una volta che il mouse è stato anetizzato e finirlo senza interruzioni inutili. Questo è importante per evitare un periodo chirurgico eccessivamente lungo per l'animale e per evitare che l'anestesia perda effetto durante l'intervento chirurgico. Si raccomanda di somministrare solo una iniezione di bolus di anestetico e completare la procedura chirurgica in una sola seduta. È anche un passo critico, non somministrare troppo Patent Blue V, poiché l'eccesso di Brevetto Blu V scolorirà il tessuto che circonda i vasi linfatici. Se il tessuto circostante diventa scolorito può essere quasi impossibile visualizzare i vasi linfatici e questo compromette la procedura. Anche se si riesce a visualizzare i vasi linfatici, il tessuto scolorito renderà difficile valutare se il Brevetto Blu V passa prossimale alla legatura o meno. Ciò è problematico perché l'operatore deve essere sicuro che le legature posizionate stiano restringendo il flusso linfatico, per garantire che la procedura abbia successo. È anche importante lasciare uno spazio di 2-3 mm quando si chiude la ferita. Come un divario temporaneo della pelle è spesso necessario per imitare il processo di guarigione della ferita umana29.
I limiti di questo metodo sono che si tratta di una procedura che richiede molto tempo che richiede l'accesso a un microscopio e precedente formazione microchirurgica. Quando si esegue la parte chirurgica di questo protocollo, è importante pianificare il tempo intermedio tra le procedure chirurgiche. Un sacco di tempo passa ad aspettare che l'animale venga anetizzato, radendo l'arto posteriore e generalmente prepararsi per ogni procedura chirurgica. Pertanto, si consiglia di preparare l'alloggio e l'anestesia in anticipo. È importante notare che per essere certi che il linfedema cronico è stato indotto, l'istopatologia deve essere analizzata. Non abbiamo incluso la istopatologia in questo articolo, che è una limitazione. Senza la istopatologia a sostegno del fatto che sono avvenuti cambiamenti istologici ai vasi linfatici, i cambiamenti di volume negli arti posteriori possono essere descritti solo come edema. L'articolo che include tutti i dati sui quattro topi dell'esperimento 126 include l'istopatologia e mostra che ci sono state modifiche significative all'istopatologia usando questa tecnica. L'articolo include anche l'imaging linfatico. La stessa procedura è stata utilizzata sui topi nell'esperimento 2 e 3, ma l'istopatologia non ha mostrato alcuna differenza significativa tra linfedema zampe posteriore e controllo dell'arto posteriore in questi esperimenti. Ulteriori studi, tra cui l'istopatologia, sono necessari per questo modello per chiarire se il linfedema è indotto a livello istologico. Gli esperimenti 2 e 3 non sono ancora stati pubblicati e pertanto non possiamo farvi riferimento.
Durante l'uso delle scansioni a zCT per misurare il volume degli arti posteriori può essere argenziato come più obiettivo rispetto all'utilizzo del metodo di spostamento dell'acqua o delle misurazioni circonferenziali, ha ancora i suoi limiti. La tecnica di misurazione è costosa, richiede molto tempo e richiede l'accesso a uno scanner a tè e al software di analisi.
Una delle maggiori sfide con i modelli di linfedema roditore in generale, sono state la risoluzione spontanea del linfedema, a meno che non sia stata eseguita un'eccessiva radiazione25. Durante lo sviluppo di questo modello, abbiamo testato diverse dosi di radiazioni per trovare una dose che avrebbe indotto linfedema duraturo senza causare grave morbilità26. In precedenza, i modelli di linfedema non sono stati standardizzati nei metodi di induzione del linfema o valutazioni dei risultati. Oashi et al.20 utilizzarono una singola dose di 30 Gy di irradiazione e ligarono ogni vaso linfatico in tre punti separati. In questo studio, la procedura chirurgica ha richiesto 90 min per eseguire. Anche se il metodo presentato in questo articolo può essere considerato dispendioso in termini di tempo, la parte chirurgica della procedura può ancora essere eseguita circa il doppio della velocità del metodo presentato da Oashi et al.20. Hanno anche avuto un periodo di follow-up di 6 mesi, che è notevolmente più lungo di qualsiasi degli studi presentati in questo articolo. Tuttavia, hanno incluso solo un topo e hanno misurato manualmente la circonferenza degli arti per valutare il gonfiore, mentre i volumi presentati in questo articolo sono stati misurati su 31 topi utilizzando scansioni CT e software di analisi 3D. Komatsu et al.30 rimosso i linfonodi inguinali e i vasi linfatici periferici associati e tessuto adiposo utilizzando un coltello elettrico. L'uso di un coltello elettrico potrebbe essere un approccio più semplice che non richiede un allenamento microchirurgico, ma l'edema indotto risolto dopo il giorno 4 mentre il metodo presentato in questo articolo offre un linfedema costante della durata di almeno 8 settimane.
Si spera che questo protocollo consenta ai ricercatori di considerare i limiti e i vantaggi del modello di linfedema rivisto. Il protocollo dovrebbe anche aiutare i ricercatori a replicare con successo il modello. Il metodo può essere utilizzato in futuri studi osservazionali e interventistici per comprendere la fisiopatologia del linfedema e le nuove opzioni di trattamento della ricerca. Negli studi futuri, sarebbe anche interessante avere un follow-up più lungo di 8 settimane per osservare quanto dura il linfedema indotto. Sarebbe anche interessante osservare l'effetto dell'esecuzione di un'irradiazione più mirata dei topi prima e post-chirurgia. Questa operazione può essere eseguita eseguendo una tac e pianificando un volume di destinazione. In studi futuri, questo modello potrebbe anche essere supportato da studi di imaging linfatico, perometria o bioimpedance guidati da fluorescenza. Questo metodo offre linfedema statisticamente significativo della durata di almeno 8 settimane, che è stato misurato direttamente tramite la TC volumetrica in tre esperimenti separati da diversi ricercatori principali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Peter Bollen, capo del Laboratorio Biomedico per aver prestato le attrezzature necessarie per registrare le riprese viste attraverso i microscopi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
| 6-0 Nylon suture - Dafilon | B Braun | C0933112 | |
| Coagulator - ICC 50 | ERBE | ||
| Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
| Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
| Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
| Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
| Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
| Heating pad - PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
| Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
| Isoflurane vaporizer - PPV | Penlon | ||
| Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
| Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
| Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
| Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
| Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
| Microlance syringe 25g | BD | ||
| Microlance syringe 27g | BD | ||
| Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
| Needle holder - Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
| Non woven swabs | Selefa | ||
| Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
| Patent blue V - 25 mg/ml | Guerbet | ||
| Scissors - Joseph | BD | RH1630 | |
| Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
| Source of radiation - D3100 | Gulmay | ||
| Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
| Temgesic - 0,2 mg | Indivior | ||
| Vet eye ointment - viscotears | Bausch & Lomb |
References
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