Summary
En protokol for produktion af dynamiske kemiske landskaber ved fotolyse inden for mikrofluidic og millifluidic opsætninger præsenteres. Denne metode er velegnet til at studere forskellige biologiske processer, herunder motiladfærd, optagelse af næringsstoffer eller tilpasning til kemikalier af mikroorganismer, både på enkeltcelle- og befolkningsniveau.
Abstract
Vi demonstrerer en metode til generering af kontrollerede, dynamiske kemiske impulser – hvor lokaliseret kemoattractant pludselig fås på mikroskalaen – for at skabe mikromiljøer til mikrobielle kemotaxiseksperimenter. For at skabe kemiske impulser udviklede vi et system til at indføre aminosyrekilder nær øjeblikkeligt ved fotolyse af aminosyrer i bur i et polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidic kammer, der indeholder en bakteriel suspension. Vi anvendte denne metode til kemotactic bakterien, Vibrio ordalii, som aktivt kan klatre disse dynamiske kemiske gradienter og samtidig spores af video mikroskopi. Aminosyrer, gengivet biologisk inert ('bur') ved kemisk modifikation med en fotoaftagelig beskyttende gruppe, er ensartet til stede i suspensionen, men ikke tilgængelig til forbrug, indtil deres pludselige frigivelse, som opstår på brugerdefinerede tidspunkter i tid og rum ved hjælp af en nær-UV-A fokuseret LED stråle. Antallet af molekyler, der frigives i pulsen, kan bestemmes af en kalibreringsforhold mellem eksponeringstid og brudfraktion, hvor absorptionsspektret efter fotolyse er karakteriseret ved hjælp af UV-Vis spektroskopi. En nanoporøs polycarbonatmembran (PCTE) kan integreres i den mikrofluidiske enhed, så den kontinuerlige fjernelse af de uncaged-forbindelser og de brugte medier kan fjernes kontinuerligt. En stærk, irreversibel binding mellem PCTE membranen og PDMS mikrofluidic struktur opnås ved belægning membranen med en opløsning af 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) efterfulgt af plasma aktivering af overflader, der skal bindes. Et computerstyret system kan generere brugerdefinerede sekvenser af impulser på forskellige steder og med forskellige intensiteter, så der skabes ressourcelandskaber med foreskrevne rumlige og tidsmæssige variationer. I hvert kemisk landskab kan dynamikken i bakteriebevægelsen i den enkelte skala og deres akkumulering på befolkningsniveau opnås, hvilket gør det muligt at kvantificere kemotaktisk ydeevne og dens virkninger på bakteriesammenlægninger i økologisk relevante miljøer.
Introduction
Mikrober er afhængige af kemotaxis, processen med at opdage kemiske gradienter og ændre motilitet som reaktion1, at navigere kemiske landskaber, tilgang næringsstof kilder og værter, og undslippe skadelige stoffer. Disse mikroskalaprocesser bestemmer makroskalakinetik af interaktioner mellem mikrober og deres miljø2,3. De seneste fremskridt inden for mikrofluidik og mikrofabrikationsteknologier, herunder blød litografi4,har revolutioneret vores evne til at skabe kontrollerede mikromiljøer til at studere samspillet mellem mikrober. For eksempel har tidligere forsøg studeret bakterielke kemotaxis ved at generere stærkt kontrollerede, stabile gradienter af mellemliggende til høje næringsstofkoncentrationer5,6. I naturlige miljøer kan mikroskalakemiske gradienter dog være kortvarige – spredes ved molekylær diffusion – og baggrundsforholdene er ofte meget fortyndet7. For direkte at måle den kemotaktiske reaktion af mikrobielle populationer, der først blev udsat for ustabile kemiske miljøer, udtænkte vi og beskriver her metoder til at kombinere mikrofluidic-teknologi med fotolyse og dermed efterligne gradienter, som vilde bakterier støder på i naturen.
Uncaging teknologi anvender lysfølsomme sonder, der funktionelt indkapsler biomolekyler i en inaktiv form. Bestråling frigiver molekylet i buret, hvilket gør det muligt at forstyrre en biologisk proces8. På grund af den hurtige og præcise kontrol af cellulære kemi, at udbåren giver9, fotolyse af bur forbindelser har traditionelt været ansat af biologer, fysiologer og neuroforskere til at studere aktivering af gener10, ion kanaler11, og neuroner12. For nylig har forskerne udnyttet de betydelige fordele ved fotolyse til at studere kemotaxis13, at bestemme flagella skifte dynamik enkelte bakterieceller udsat for en trinvis kemoattractant stimulus14,15, og at undersøge motilitet mønstre af enkelt sædceller celler i tre-dimensionelle (3D) gradienter16.
I vores tilgang implementerer vi fotolyse af buraminosyrer inden for mikrofluidic enheder for at studere en bakteriebestands adfærdsmæssige reaktion på kontrollerede kemiske impulser, som bliver næsten øjeblikkeligt tilgængelige via fotoudgivelse. Anvendelsen af et mål med lav forstørrelse (4x) (NA = 0,13, fokusdybde ca. 40 μm) gør det muligt både at observation af aggregeringiv respons på befolkningsniveau for tusindvis af bakterier over et stort synsfelt (3,2 mm x 3,2 mm) og måling af bevægelse på enkeltcelleniveau. Vi præsenterer to anvendelser af denne metode: 1) frigivelse af en enkelt kemisk puls til at studere bakteriel akkumulering−dissipation dynamik fra ensartede forhold, og 2i) frigivelse af flere impulser til at karakterisere bakteriel akkumulering dynamik under tidsvarierende, rumligt heterogene kemoattractant betingelser. Denne metode er blevet testet på de marine bakterier Vibrio ordalii udfører kemotaxis mod aminosyren glutamat17,men metoden er stort set gældende for forskellige kombinationer af arter og kemoattractants, samt biologiske processer ud over kemotaxis (f.eks næringsstof optagelse, antibiotika eksponering, kvorum sensing). Denne tilgang lover at hjælpe med at belyse økologi og adfærd mikroorganismer i realistiske miljøer og at afdække de skjulte kompromiser, at de enkelte bakterier står over for, når du navigerer flygtige dynamiske gradienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af den mikrofluidiske enhed til single chemical-pulse Eksperiment
- Design kanalen ved hjælp af COMPUTER-aided design (CAD) software og udskrive den på en gennemsigtighed film for at skabe fotomaske(Figur 1A).
- Opfabriker mesteren ved blød litografi (under renrumsforhold).
- Rengør en silicium wafer (4 inches) i hurtig rækkefølge med acetone, methanol og isopropanol, derefter tørre ved hjælp af kvælstof. Waferen bages i ovnen ved 130 °C i 5 min.
- Placer wafer i midten af en spin-coater og hæld SU-8 fotoresist på wafer. Rampe hastigheden af spin-coater op til 500 rpm over 5 s, og holde på 500 rpm for 10 s. Rampe op til den endelige hastighed over 10 s og opretholde ved denne hastighed i 30 s.
BEMÆRK: Den nøjagtige værdi af den endelige hastighed afhænger af den målrettede belægningstykkelse og den anvendte SU-8. - Efter centrifugeringsprocessen bages waferen ved 65 °C og derefter ved 95 °C. Lad waferen køle af ved stuetemperatur (RT) i mindst 5 min.
BEMÆRK: Bagetiden afhænger af den målrettede tykkelse og type fotomodstand, der anvendes. Som hovedregel skal waferen for hvert 100 μm lag bages i 5 min ved 65 °C og 45 min ved 95 °C. - Placer fotomasken på waferen for at sikre, at kun interesseregionen eksponeres og polymeriseres. Udsæt UV-lys for den tid, der anbefales i SU-8 manualen.
BEMÆRK: Her, med eksponering energi på 200 mJ cm-2 på en bølgelængde på 350 nm, wafer blev udsat for 150 s. - Waferen bages ved 65 °C og 95 °C i den anbefalede tid i SU-8-manualen.
BEMÆRK: Som hovedregel skal waferen for hvert 100 μm lag bages i 5 min ved 65 °C og 45 min ved 95 °C. - Fordyb waferen i et bægerglas fyldt med polymethylmethacrylat (PMMA) udvikler for at få masteren. Ryst forsigtigt bægerglasset for at sikre, at den unpolymeriserede fotomodstand vaskes ud. Bag masteren ved 200 °C for yderligere at krydsforbinde SU-8-laget.
- Der fremstilles en blanding af polydimethylsiloxan (PDMS) ved at kombinere elastomeren med dets hærdningsmiddel (Materialetabel) ved et 10:1-forhold i et bægerglas (her 40 ml). Bland kraftigt, indtil væsken er homogen.
BEMÆRK: PDMS-blandingen ser uigennemsigtig ud, fordi der genereres bobler under blandingsprocessen.
FORSIGTIG: For at undgå, at huden kommer i kontakt med potentielt farlige kemikalier eller biologisk materiale, skal du altid bære en laboratoriekittel og engangsplasthandsker i hele protokollen og følge eventuelle specifikke sikkerhedsprotokoller i henhold til sikkerhedsdatablad (MSDS). - Afgas PDMS blandingen i et vakuum kammer i 45 min på RT. For at fremskynde processen, med jævne mellemrum frigive vakuum for at sprænge boblerne, der danner på grænsefladen.
BEMÆRK: Afgasningsprocessen skal udføres inden for 1 time for at forhindre, at PDMS-blandingen begynder at helbrede. - Fjern støv fra masterens overflade med trykrenser, hæld derefter den afgassede PDMS-blanding på masteren og bages i en ovn ved 80 °C i 2 timer.
BEMÆRK: Alternativt ville bagning natten over (eller i mindst 12 timer) ved 60 °C opnå den samme hærdede PDMS. - Klip PDMS med en klinge omkring mikrostrukturerne (i en afstand af ca. 5 mm) og skræl derefter forsigtigt PDMS fra masteren.
- Punch huller til at tjene som indløb og udløb af mikrokanalen (her, en indløb og en stikkontakt, se figur 1A). Sørg for, at intet rører den nederste side af PDMS, hvor funktionerne er placeret.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Mikrokanalen skal forsegles med tape for at forhindre ophobning af støv og andre partikler under opbevaringen. - Bond PDMS mikrokanal til et glas dias.
- Rengør en glasrutsjebane grundigt med sæbe, isopropanol og deioniseret vand. Lad glasset glide tørt eller bruge trykluft til at fremskynde processen.
- Fjern støvpartikler ved at dabbing med tape. Binde PDMS mikrokanal på det rene glas dias, umiddelbart efter behandling af begge overflader med plasma (ved hjælp af enten et koronasystem eller et plasma iltkammer) i 2 min.
- Anbring den mikrofluidiske anordning for at opvarme på en kogeplade ved 80 °C i mindst 1 time for at styrke den kemiske binding med glasset.
2. Fremstilling af den 3D-printede millifluidic enhed til eksperimentet med flere impulser
- Design 3D-formen ved hjælp af 3D-design software og udskrive master for PDMS mug med en høj opløsning 3D-printer (Figur 1B).
BEMÆRK: Se Materialetabellen for 3D-printeren og skimmelmaterialet, der bruges til at oprette masteren. - Gentag trin 1.3−1.4, og rengør derefter mesterens overflade ved at dabbing med tape. Sæt master på en skala, så samtidig undgå den centrale region af master, der vil blive besat af membranen, hæld på den nøjagtige mængde uhærdet PDMS blanding (her, 23,4 g) for at opnå den ønskede højde af PDMS ved at matche højden af master (her, 0,5 mm). Fjern eventuelle resterende bobler ved hjælp af trykluft.
- Anbring PDMS-støbt på masteren i en ovn ved 45 °C for at bage i mindst 12 timer.
- Bond 3D PDMS skimmel til en petriskål.
- Fjern forsigtigt det hærdede PDMS lag og slagindløbog udløbshuller til injektion af bakteriesuspensionen (figur 1C).
- Aktivér både overfladen af en petriskål (90 mm x 15 mm) og PDMS-formen med iltplasma i 2 min. Bond PDMS-formen på petriskålen. Tryk forsigtigt formen til petriskålen, men tryk ikke på, hvor funktionerne er placeret, da dette kan kollapse forhørskammeret.
- Petriskålen anbringes i PDMS 3D-formen i en ovn ved 45 °C i mindst 12 timer for at styrke den kemiske binding.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
- Membranoverfladefunktionsevne18
- Aktivér den nanoporøse polycarbonatmembran (PCTE) i et iltplasmakammer i 1 min ved RT.
FORSIGTIG: Undgå at bruge et koronasystem til plasmaaktivering, da det vil beskadige membranen. - Under en kemisk hætte fortyndes en kommerciel opløsning af 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) i deioniseret vand til 1% i volumen (her 40 ml) ved hjælp af et polypropylenrør.
FORSIGTIG: APTES-opløsningen er akut giftig (MSDS health hazard score 3) og bør håndteres med ekstrem forsigtighed udelukkende under en kemisk hætte med handsker. Skift handsker umiddelbart efter håndtering af APTES-opløsning. APTES dampe er ødelæggende for slimhinderne og de øvre luftveje. Målet organer APTES er nerver, lever, og nyre. Hvis der ikke er en røghætte til rådighed, skal der implementeres et ansigtsskjold og åndedrætsværn med fuld ansigt. - Overfør den fortyndede APTES-opløsning i en petriskål, og den aktiverede membran nedsænkes i APTES-opløsningen i 20 minutter.
- Fjern membranen fra APTES-opløsningen med pincet og læg den på et renrumstørre til tørre.
- Aktivér den nanoporøse polycarbonatmembran (PCTE) i et iltplasmakammer i 1 min ved RT.
- For fremstilling af PDMS mikrofluidic kanaler, der vil ligge på membranen og tillade vask af den bakterielle arena, gentage trin 1.1−1.7.
- Bond PDMS vaskekanaler til den funktionaliserede membran.
- Aktivér både PDMS vaskekanal og PCTE membran en ilt plasma kammer i 2 min.
BEMÆRK: Membranen, som vil blive klemt inde mellem to PDMS lag, skal være mindre end PDMS vaskekanal. - Umiddelbart efter plasmabehandlingen skal den funktionaliserede membran og PDMS vaskekanalen tages i kontakt ved forsigtigt at trykke PDMS vaskekanalen på membranen.
BEMÆRK: Påfør ikke for meget tryk på nuværende tidspunkt, da det kan forårsage (irreversibel) fastgørelse af membranen på kanalens tag, hvilket blokerer kanalen.
- Aktivér både PDMS vaskekanal og PCTE membran en ilt plasma kammer i 2 min.
- Sandwich membranen mellem to PDMS lag(Figur 1E).
- Aktivér både den bundne laminat PDMS vaskekanal−PCTE membran og 3D PDMS-formen, der tidligere var bundet til petriskålen med et iltplasmakammer i 2 min. Bring dem i kontakt og tryk sammen.
- Petriskålen anbringes i sandwichstrukturen i en ovn ved 45 °C i mindst 12 timer for at styrke den kemiske binding.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
3. Cellekultur
- Vokse en befolkning af V. ordalii (stamme 12B09 eller 12B09pGFP) natten over for 20 timer i 2216 medium19 på en orbital shaker (600 rpm) ved 30 °C og høstceller i slutningen af eksponentiel fase. Til isolater, der huser pGFP, tilsættes spectinomycin (50 μg ml-1)for at opretholde plasmid.
- Centrifuger en 1 ml aliquot af celler ved 2500 x g i 3 min. Gentag dette trin.
- Sult befolkningen i V. ordalii på en orbital shaker (600 rpm) ved 30 °C i 3 timer.
- Forbered en bestand kunstig havvand opløsning på 10 mM (her, 1 ml) af 4-methoxy-7-nitroindolinyl-bur- L-glutamat (MNI-bur-L-glutamat) og opbevares på -20 °C.
BEMÆRK: Beskyt MNI-bur-L-glutamat opløsning fra omgivende lys for at forhindre fotolyse. - Cellerne 50x fortyndes ved at suspendere de udsultede celler igen i enkunstig havvandsopløsning på 1 mM MNI-bur- L-glutamat.
BEMÆRK: Dette vil sikre en endelig bakteriekoncentration på under 5 x 107 ml-1 (den nøjagtige værdi afhænger af den oprindelige koncentration af celler i slutningen af eksponentiel, hvilket typisk er ~ 109 ml-1). Bakteriel koncentration blev anslået ved hjælp af et spektrofotometer ved optisk tæthed (OD) på 600 nm.
4. Kalibrering af uncaging-protokollen
- Der anbringes en dråbe (20 μL) af en kunstig havvandsopløsning af MNI-bur- L-glutamat20 ved koncentration C0 = 10 mM på et glasdias. Indkapsle dråbeved at dække den med et cirkulært PDMS-kammer (diameter d = 5 mm, højde h = 250 μm).
- Placer glasskubpå et mikroskop scene og udsætte hele kammeret i 20 ms til en LED-stråle på en bølgelængde på 395 nm (effekt 295 mW) ved hjælp af en 4x mål (numerisk blænde [NA] = 0,13).
- Åbn PDMS-kammeret, og træk en dråbe (1 μL) til analyse med et UV-Vis spektrofotometer.
- Gentag trin 4.1−4.3 for forskellige varigheder af LED-belysning på 0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (eller indtil mætning af den kemiske reaktion) og 0 s (for at få baggrunden). Repliker proceduretrinnene 4.1−4.4 mindst 3x (her, 4x).
- Fra absorptionsspektret udvindes værdien ved 405 nm, som repræsenterer toppen i absorptionsspektret på burmolekylet21. Brug følgende førsteordenskinetikligning til forsøgsdataenes numeriske pasform17
hvor C(t)er værdien af opløsningens absorptionsspektrum ved 405 nm (efter fjernelse af baggrunden) med en uarbejdsevne på t sekunder. For lille fritid t sådan, at kt 1, Eq. 1 kan forenkles til den lineære formulering
5. Enkelt kemisk-puls eksperiment
- Vedligehold den mikrofluidiske kanal under vakuum i 20 minutter for at reducere gaskoncentrationen i PDMS, så der er mindre sandsynlighed for, at der dannes bobler under påfyldningsprocessen.
- Udtræk kanalen fra vakuumpumpen og straks indføre fortyndet bakteriel suspensioni 1 mM MNI-bur- L-glutamat i kunstigt havvand i mikrokanalen forsigtigt ved hjælp af en mikropipette for at undgå flagellar skader ved mekaniske klipning kræfter (her, hele påfyldningsprocessen tog 5-10 s). Når du har fyldt kanalen med bakterieaffjedringen, skal du suge opløsningen over for meget med køkkenrulle og forsegle indløb og udløb med PDMS-stik ved forsigtigt at trykke dem ind i hullerne.
BEMÆRK: På denne måde forhindres væskestrømmen i kammeret. - Placer mikrokanalen på et mikroskop fase og flytte scenen for at indstille synsfeltet i midten af kanalen. Opsæt mikroskopet til at udføre billeddannelse i fasekontrast (4x objektiv) med en billedhastighed på 12 fps.
BEMÆRK: Denne værdi kan varieres, men bør ikke være mindre end 10 fps for at tillade rekonstruktion af bakterielle baner gennem billedanalyse (se protokol afsnit 7). - Indstil LED-strålens pinhul ved minimum blænde. Ved at indstille kameraets eksponeringstid til 5 s skal du optage et par billeder for at opnå præcise målinger af LED-strålens rumlige placering og størrelse.
BEMÆRK: LED-lyskilden tilsluttes mikroskopets epifluorescensbelysning via væskelysguidetilslutning. LED-strålen påvirker ikke videooptagelse, fordi videoerhvervelse og LED-stimulation er befalet uafhængigt via software. - Udfør kontinuerlig billeddannelse i en samlet varighed på 10 min (20 min for den største kemiske puls), og samtidig aktivere den fokuserede LED stråle på 395 nm for den ønskede varighed (i dette eksperiment, t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) på et brugerdefineret tidspunkt (her, 10 s efter starten af video erhvervelse) via mikroskop software. For at opnå flere replikater af den samme proces, flytte scenen for at registrere den bakterielle reaktion over forskellige positioner i den mikrofluidic kanal. Repliker denne procedure for hver pulsstørrelse ved hjælp af en ny mikrokanal.
BEMÆRK: Den uhæmmende proces genererer en aksisymmetrisk cylindrisk puls, der spreder radialt udad i billedplanet. - Gennemføre separate eksperimenter uden kemisk eskalering ved højere forstørrelse (20x mål, NA = 0,45) ved en højere billedhastighed (50 fps) for at registrere bakteriernes upartiske svømmebevægelse.
6. Flere Kemiske-puls Eksperiment
- Hold det millifluidic kammer under vakuum i 20 min.
- Placer petriskålen, der indeholder det millifluidiske kammer, på et mikroskopstadie. Fyld kammeret under membranen med den fortyndede bakterielle suspension (her tog hele påfyldningsprocessen 10−15 s) gFP-fluorescerende V. ordalii i 1 mM MNI-bur- L-glutamatopløsning i kunstigt havvand. Når du har fyldt kanalen med bakterieaffjedringen, skal du suge opløsningen over for meget med køkkenrulle og forsegle indløb og udløb med PDMS-stik ved forsigtigt at trykke dem ind i hullerne.
BEMÆRK: På denne måde forhindres væskestrømmen i kammeret. For at muliggøre bedre visualisering af bakterier i dette setup, hvor billeddannelse sker gennem nanoporøs membran, anbefales det kraftigt at bruge fluorescerende stammer i stedet for den vilde type (som anvendes i det enkelte kemiske pulseksperiment). - Fyld en sprøjte med en kunstig havvandsopløsning på1 mM MNI-bur- L-glutamat, og fastgør slangen til vaskekanalens indløb og udløb over membranen.
- Tilslut slangen til et affaldsreservoir, og sørg for, at slangen er helt nedsænket i væskeaffaldsbeholderen for at undgå tryksvingninger.
- Indstil den relevante strømningshastighed på sprøjtepumpen (her 50 μL min-1)for at opnå den ønskede gennemsnitlige strømningshastighed i vaskekanalen, som afhænger af kanalens geometri.
- Start sprøjtepumpen for at etablere strømmen i vaskekanalen over membranen.
- Kør softwaren, der styrer LED-strålen og mikroskopstadiet, for at generere brugerdefinerede sekvenser af impulser på forskellige steder og med forskellige intensiteter.
BEMÆRK: Den kontinuerlige strøm af den kunstige havvandsopløsningpå 1 mM MNI-bur- L-glutamat i vaskekanalen over membranen genopfylder den bursammensatte opløsning og vasker det brugte medium fra bakteriearenaen. - Optag video ved hjælp af en 4x målsætning med jævne mellemrum over en periode på flere timer og over flere sammenhængende steder for at dække en stor overflade (her, 1 cm x 1 cm, figur 1F).
7. Billedanalyse og dataanalyse
- Rekonstruktion af de bakterielle baner
- Fra film optaget med 4x mål, rekonstruere bakterielle baner ved hjælp af tracking software17.
BEMÆRK: Disse baner repræsenterer 2D-fremskrivningerne af 3D-bakteriebevægelsen i mikrokanalen. - Fra de rekonstruerede bakterielle baner bestemme stilk den radiale drift hastighed af hver svømning enkelte ved at projicere sin svømning hastighed over retningen mod midten af den kemiske puls(Figur 2D). Til visualisering af den spatio-tidsmæssige dynamik i radiale drivhastighed, skal du bruge et binninggitter med rumlig størrelse 75 μm x 75 μm og tidsmæssigt vindue med 5−10 s interval (figur 2D,E).
BEMÆRK: På grund af processens cylindriske symmetri kan data analyseres i polære koordinater og i gennemsnit over den kantede dimension (figur 3). - Fra de rekonstruerede bakteriebaner bestemmes den spatio-tidsmæssige dynamik i fordelingen af bakterier, når de reagerer på de kemiske impulser (figur 2E).
- Fra den højere opløsning film optaget med 20x mål i løbet af enkelt-puls eksperimenter, udtrække fordelingen af svømning hastighed og køre tid for bakteriepopulationen, som de reagerer på den kemiske puls(Figur 4).
- Fra film optaget med 4x mål, rekonstruere bakterielle baner ved hjælp af tracking software17.
- Anslå diffusionskoefficienten for bakterier ved at overveje bakteriepopulationens afspredelsesdynamik efter chemotaxis er afsluttet17 (her for t > 300 s; Figur 3).
- Anslå diffusionskoefficienten for glutamat ved at anvende Stokes-Einstein ligningen
hvor aminosyremolekylerne antages at være sfæriske partikler med hydrodynamisk radius22rG, kB er Boltzmann-konstanten (1,38 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), T er temperaturen (296 K), og η er den dynamiske viskositet af det kunstige havvand (saltindhold 36 g kg-1) ved 23 °C (10-3 Pa s)23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brugte de mikrofluidiske og millifluidiske enheder(figur 1)til at studere bakterielle akkumuleringsprofiler under dynamiske næringsstofforhold. Bakterielle baner blev udvundet fra optagede videoer erhvervet ved fase kontrast mikroskopi af ophobning-spredning dynamik af en bakteriepopulation efter en kemisk puls udgivet af photolyse (Figur 2 og Figur 3). Ved i gennemsnit millioner af baner, den spatiotemporal dynamik radial drift hastighed og bakteriel koncentration blev opnået. Statistikker, der beskriver svømningen uden en kemisk gradient, blev opnået i separate forsøg med højere rumlig og tidsmæssig opløsning (figur 4).
Figur 1: Mikrofluidic og millifluidic enheder til bakterielle eksperimenter under dynamiske næringsstofforhold. (A) Fotomaske af den mikrofluidiske kanal, der anvendes til at observere den bakterielle ophobning til en enkelt kemisk puls. (B) Fotomaske af mikrofluidics kanal, der anvendes til at vaske millifluidic bakterielkammer til multi puls eksperimenter. De små prikker er mikrosøjler (200 μm i størrelse), der hjælper limning af membranen til PDMS, og samtidig hjælpe med at forhindre membranen i buckling eller kollapser i midten. (C) Design af 3D trykte master bruges til at skabe det bakterielle kammer. (D) PDMS-laget med bakteriekammerets mønster. (E) Den komplette millifluidic enhed (top visning, PCTE membran i hvid). F) Skematisk af millifluidic enhed til produktion af dynamiske næringsstofforhold (sideview). Optik strålediagram er vist på bunden af enheden, hvor en violet stråle (395 nm) udfører uncaging af kemoattractant, mens en (uafhængig) blå stråle (470 nm) anvendes til observation af fluorescerende bakterier (huserpGFP) gennem en sCMOS kamera, som fanger bakterietætheden (nederst centrum). Enheden er placeret på en motoriseret fase (nederst til højre), som kan flyttes i x-y flyet for at frigive kemiske impulser på brugerdefinerede positioner (kontrolleret via NIS software, nederst til venstre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative bakterielle reaktioner på en kemisk puls. (A,B) Maksimal intensitetsprojektion, der viser bakterieposition (hvid) over et interval på 0,5 s, vist (A) umiddelbart efter ogb) 40 s efter pulsfrigivelsen (mål: 4x, NA = 0,13, Ph 2; videooptagelse ved 12 fps). (C) Bakterielle baner (sort) vist 60 s efter pulsfrigivelsen. Den skyggefulde region repræsenterer den kemiske puls frigivet af photolyse på t = 0 s i midten af synsfeltet (sort kors), som efterfølgende spreder. Baner blev rekonstrueret ved hjælp af brugerdefineret in-house software. (D,E) Tidsmæssige dynamik af radial drift hastighed (D) og af den bakterielle koncentration (E) efter en puls frigivelse i midten af synsfeltet. I panel D svarer negative værdier af drivhastigheden (i blå farve) til rettet kemotaktisk bevægelse mod midten af pulsen. Dette tal er blevet ændret efter Brumley et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Spatio-tidsmæssige profiler af radial drift hastighed og bakteriel koncentration efter en kemisk puls frigivelse. (A,B) Den radiale drivhastighed (A) og bakteriekoncentrationen(B) som funktion af tid og afstand fra midten af en 35 μM glutamatpuls. I panel A svarer negative værdier af drivhastigheden (i blå farve) til rettet kemotaktisk bevægelse mod midten af pulsen. Værdierne blev beregnet ved at gennemsnit over alle baner. Den sorte stiplede linje på t = 250 s groft afgrænser perioden med aktive kemotaxis (blå skygge i panel A, region I), hvorefter cellerne diffuse isotropically udad (grøn skygge i panel A, region II). C) Bakteriekoncentration (skaleret over baggrunden B0) som en funktion af afstanden på t = 10, 30, 60 s efter oprettelsen af en diffusing kemisk puls. Bakterier samles tæt på det sted, hvor pulsen på grund af kemotaxis. (D) Bakteriel koncentration tager ~ 20 min at slappe af til baggrunden B0 ved bakteriel diffusion. Indsat viser pasformen af diffusive spredning med en diffusionskoefficient på DB = 165 μm2 s-1. Panel A, C og D er blevet ændret fra Brumley et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Svømmestatistik for en bakteriepopulation i mangel af kemiske gradienter. (A) Baner repræsenterer de to-dimensionelle fremskrivninger af de tre-dimensionelle bakterielbevægelse i mikrokanalen. Bakterielle baner udvindes ved hjælp af en brugerdefineret in-house tracking script. Her angiver det blå kryds starten af sporet, og røde og grønne symboler angiver omorienteringshændelser. Data blev registreret på 50 fps med en 20x mål, NA 0,45. (B) Sandsynlighedsfordeling af målt bakteriel svømmehastighed (sort) sammen med en gammafordelingspasform (blå). Da fokusdybden, når der dannes billeddannelse med et 20x-mål (NA 0,45), kun er nogle få mikron24,er de registrerede baner hovedsagelig planar, og målinger af svømmehastigheden er ikke forudindtaget af projektionen. C) Sandsynlighedsfordeling af tiden mellem successive omlægninger. Disse data var nødvendige for effektivt at kalibrere en individuel baseret model, der tager hensyn til omlægningsmønsteret, fordelingen af svømmehastigheden og omorienteringsstatistikkerne for organismerne. Dette tal er blevet ændret fra Brumley et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode gør det muligt for forskere at studere bakterielke kemotaxis under kontrollerede, dynamiske gradienter i mikro- og millifluidic enheder, så reproducerbare dataindsamling. Den næsten øjeblikkelige skabelse af kemiske impulser på mikroskala ved fotolyse har til formål at reproducere de typer af næringsstoffer pulser, bakterier støder på i naturen fra en række kilder, for eksempel, diffusive spredning af fjer bag synkende marine partikler25, eller næringsstof spredning fra lysed fytoplankton celler26.
Vi præsenterede to anvendelser af denne metode: 1) frigivelseaf en enkelt kemisk puls til at studere bakteriel akkumulering−afledningsdynamik fra ensartede forhold og 2) frigivelse af flere impulser for at karakterisere bakterieakkumuleringsprofilerne under ikke-ligevægtede næringsstofforhold. Den første ansøgning er særligt velegnet til at karakterisere adfærdsmæssige reaktioner af mikrober, når først støder på et næringsstof kilde. Under sådanne forhold, hvor koncentrationen af kemoattractantmolekyler er ekstremt lav, domineres den tidlige fase af kemotaxier af de stokastiske bindings-ubindingshændelser af kemoattractantmolekyler til kemoreceptorerne17. Vores metode, ved hurtigt og præcist at frigive en kendt masse af kemoattractant i en nul-næringsstof baggrund, giver betydelige fordele i forhold til tidligere tilgange til at karakterisere den bakterielle reaktion under dynamiske forhold27,28,29. Fordele omfatter at kende den fulde fordeling af kemoattractant på alle steder og på alle tidspunkter (da dens diffusivity er kendt), og helt undgå den generation af væskeflow, der er i sagens natur forbundet med andre enheder, såsom mikroinjektoren27 eller tre-indløb geometrier30.
I det andet program forekommer de kemiske impulser i et stort, kvasi-2D-domæne i henhold til en brugerdefineret sekvens i tid og rum, der kan tilpasses fuldt ud via software, som kan bruges til at gennemtvinge tilfældige sekvenser eller bestemte mønstre. Vigtigere er det, denne metode giver en stærk sammenhæng mellem den høje opløsning adfærdsmæssige dynamik bakterielke kemotaxis og næringsstof optagelse over tidsskalaer af sekunder og langsigtede dynamik, såsom vækst og potentielt udvikling. Den bakterielle arena er betydeligt større (2 cm x 2 cm) end den rumlige vifte af kemiskinteraktion af bakterier med en enkelt puls (fra hundredvis af mikrometer til de mindste impulser til et par millimeter for de største impulser). Nøglen til opretholdelse af en lav kemisk baggrund (meget lavere end koncentrationen af de kemiske impulser ved deres frigivelse) er inddragelsen af nanoporous PCTE membran klemt inde mellem de to PDMS lag18. Ved at anvende en væskestrøm i den mikrofluidiske kanal placeret øverst på enheden realiseres en kontinuerlig udvaskning af de uncaged forbindelser og brugt medium i bakteriearenaen ved hjælp af molekylær diffusion gennem nanoporøs membranuden at skabe flow i testafsnittet på den enhed, hvor bakterierer er placeret (figur 1).
Ved at modulere den fokuserede LED-stråle i tid, amplitude, størrelse og geometri giver fotoreleaseteknologien eksperimentatoren med stor fleksibilitet til at generere forskellige typer kemiske miljøer. Samtidig, mens de test, der præsenteres her blev udført under quiescent betingelser, kan vores metode udvides yderligere til at teste bakterielke kemotaxis under forskellige flow konfigurationer. Ved trofast at rekonstruere bakteriel akkumulering dynamik gennem video mikroskopi, vores metode genererer store mængder af høj kvalitet data, der kan bruges til at vurdere statistikkerne over bakteriel adfærd og den potentielle næringsstof optagelse af bakterieceller. Vores eksperimentelle mikrofluidic tilgang, efterligne næringsstof landskaber, at bakterier kan stå over for under naturlige miljømæssige forhold, giver mulighed for systematisk undersøgelse af fouragering adfærd mikrobielle arter, der er afgørende i cykling af næringsstoffer på makroskopisk skala2,3. Som sådan er den type data, der genereres gennem denne metode, nyttig til effektivt at kalibrere befolkningstilvækstog bedre udlede næringsstofkinetik i mesoscale økosystemmodeller.
Fremstillingen af PDMS forme for at gøre den store bakterielle arena blev udført ved hjælp af en kommerciel 3D-printservice. Der kan dog opnås lignende resultater ved hjælp af en avanceret 3D-printer i huset med en opløsning på 50−100 μm, der kræves for at løse de mindste funktioner i mikrokanaldesignene. En glat overflade af det 3D-printede materiale til PDMS-formen er nødvendig for at opnå en god binding mellem den støbte PDMS og de andre overflader af enheden (dvs. glas, polystyren, PDMS). Til vores anvendelse, brug af en polystyren Petri skål (90 mm x 15 mm) som den nederste overflade af 3D-arenaen præsenterer to fordele i forhold til brugen af et glas dias som almindeligt anvendt i mikrofluidics undersøgelser: for det første, det reducerer i betydelig grad fastgørelse af bakterieceller i forhold til en glasoverflade (selv om fastgørelse kan afhænge af de særlige overfladeegenskaber af mikrobe under overvejelse); for det andet giver det sekundær indeslutning, som kan forhindre lækage af medier over mikroskopi udstyr i tilfælde af spild. PDMS-formens hærdningsproces forekommer typisk ved en høj temperatur (70−80 °C), men i denne applikation skal eksperimentatoren bage PDMS-formen ved en betydeligt lavere temperatur (45 °C i det aktuelle tilfælde, se Materialetabel), under varmeafbøjningen og smeltetemperaturen af det materiale, der anvendes til 3D-printning af masteren. Den lavere bagetemperatur forlænger hærdningsprocessen betydeligt (natten over), men ændrer ikke PDMS's mekaniske og kemiske egenskaber.
Selv om vores metode er blevet anvendt på en bestemt kombination af bakterier og kemoattractant, metoden er egnet til at teste forskellige biologiske processer, herunder optagelse af næringsstoffer eller antibiotika eksponering, og kan anvendes på modelsystemer af forskellige arter og kemoattractants, da et utal af molekyler har været (eller kan være) bur8. En potentiel begrænsning skyldes omkostningerne ved kommercielt tilgængelige burforbindelser, men disse omkostninger kan sammenlignes med dem, der opstår, når de molekylære sonder, der typisk anvendes i biovidenskaberne, for cellelevedygtighed, optælling eller intracellulær farvning. På trods af denne potentielle begrænsning kan den foreslåede metode finde brede anvendelser på tværs af biofysiske og biomedicinske videnskaber for at karakterisere tidlige reaktioner og tilpasningsdynamik af mikrobielle populationer ved en enkelt celleopløsning på dynamiske kemiske gradienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker den første mikrofabrikation facilitet på ETH Zürich. Dette arbejde blev støttet af en australsk Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (til D.R.B.), en Gordon og Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (til RS), og en schweizisk National Science Foundation tilskud 1-002745-000 (til R.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. The biology of the chemotactic response. , Cambridge University Press. (1991).
- Azam, F., Malfatti, F.
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C.
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R.
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- Nikon depth of field calculator. , Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019).
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
