Summary
Her presenterer vi protokoller for 1) laboratoriet fange forplantning av føderalt truede Miami blå sommerfugl(Cyclargus thomasi bethunebakeri), og 2) vurdere grunnleggende livshistorie informasjon som umoden utviklingstid og antall larval stadia. Begge metodene kan tilpasses for bruk med andre ex situ bevaring programmer.
Abstract
Å forbedre kunnskapen om ex situ beste praksis for risikoutsatte sommerfugler er viktig for å generere vellykkede bevarings- og gjenopprettingsprogramresultater. Forskning på slike fangede populasjoner kan også gi verdifulle data for å løse viktige informasjonshull om atferd, livshistorie og økologi av målskatten. Vi beskriver en protokoll for fangeforplantning av den føderalt truede Cyclargus thomasi bethunebakeri som kan brukes som modell for andre risikoutsatte butterfly ex situ programmer, spesielt de i familien Lycaenidae. Vi gir videre en enkel og enkel protokoll for registrering av ulike livshistoriske beregninger som kan være nyttige for å informere ex situ-metoder samt tilpasset laboratoriestudier av andre lepidoptera.
Introduction
En voksende liste over studier indikerer utbredt og alvorlig global nedgang i sommerfuglpopulasjoner1,2,3,4,5. Dette inkluderer de aller fleste risikoutsatte arter. Bevaringsprogrammer designet for å redusere slike nedganger bruker ofte en blanding av strategier, inkludert befolkningsovervåking, habitatforvaltning og restaurering, vitenskapelig forskning, fangeforplantning og organismetranslokasjon6. Innenfor USA og dets territorier alene er totalt 30 sommerfugltaxa oppført under Endangered Species Act (ESA) som enten truet eller truet, med 21 av disse har godkjent utkast eller endelige utvinningplaner. For slike taxa anbefaler mer enn halvparten av de identifiserte gjenopprettingsstrategiene fangeforplantning eller oppgiring av fanger som bør vurderes7. Bruken av ex situ bevaring innsats for sommerfugler har vokst betydelig de siste årene8,9, og har potensial til å være et kritisk verktøy for å hjelpe utvinning innsats10. Mange institusjoner, organisasjoner og byråer er for tiden involvert i ex situ innsats for minst 11 ESA-noterte sommerfugl taxa (dvs. Cyclargus thomasi bethunebakeri, Euphydryas editha quino, Euphydryas editha taylori, Heraclides aristodemus, Hesperia dacotae, Lycaeides melissa samuelis, Oarisma poweshiek, Pyrgus ruralis lagunae, og Speryeria zerene hippolyta) og flere andre risikobegåren taxa (f.eks, Callophrys irus, Euphydryas phaeton, Speyeria idalia, andlia, andlia, andlialia, andlialia, andlialia, andlialia, andlialia, andlialia, andlialia, andlialia, andlialia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlialia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlia, andlialia, andlialia, and Eumaeus atala)11. Til tross for antall robuste og vellykkede tiltak, er det fortsatt mangel på regelmessig kommunikasjon på tvers av programmer og mellom bevaringsutøvere som involverer utveksling av ideer, data, effektive metoder og resultater. Slik kunnskapsdeling er avgjørende da det bidrar til å minimere duplisering av innsats, forbedrer den generelle beste praksis, og forbedrer bevaringseffekten. Få publiserte hodestart, fangede oppdragelses-, avl- eller husdyrholdprotokoller er lett tilgjengelige for risikoutsatt sommerfugltak, og de som ofte mangler tilstrekkelige fortellende detaljer og/ eller illustrasjoner. Disse gir ofte for det meste oppsummeringsdetaljer med begrensede trinnvise instruksjoner og tilhørende bilder, noe som gjør replikering utfordrende eller søknad til andre taxa vanskelig å vurdere12,13,14,15. Mange av de tilgjengelige protokollene er begrenset på noen måte: de eksisterer bare i grå litteratur, eller i varierende detaljnivåer, alder av publisering, eller som komponentdeler i symposium saksbehandling, byrå / funder rapporter, eller interne manualer16,17,18,19,20,21,22,23,24.
For de fleste bevaringsprogrammer er det primært gjennomført for forplantning for bevaring for å støtte bevaringstranslokasjon, som omfatter gjeninnføring, forsterkning (dvs. forsterkning) og introduksjon25,26. Slike aktiviteter er ment å bli implementert strategisk som en del av den generelle utvinningsstrategien for å forhindre utryddelse av en oppført art, underart eller populasjoner. Det bør imidlertid bemerkes at dette er en av flere andre potensielle roller som slike ex situ programmer kan tjene. Disse kan også omfatte å opprettholde en forsikring (dvs. refugia) befolkning, midlertidig organisme redning, støtte utvinning-relatert forskning og / eller opplæring, og fremme bevaring-relatert utdanning og bevissthet innsats27,28. Uansett om ex situ programmer har et enkelt definert mål eller en blanding av flere, bevaring utøvere bør maksimere muligheter for datainnsamling for å fylle ut viktige informasjonshull når det er mulig. Dette er spesielt viktig fordi det store flertallet av risikoutsatte taxa generelt har blitt dårlig studert før betydelig vill befolkning avtar. Den resulterende forbedrede kunnskapen som er oppnådd på ulike atferdsmessige, økologiske eller livshistoriske aspekter ved fokal taksonen, kan bidra til å fremme effektiv artsbevaring og forvaltning29.
Her beskriver vi i detalj den fangede forplantningsprotokollen som ble utviklet for den føderalt truede Miami blå sommerfugl (Cyclargus thomasi bethunebakeri) (Supplementary Figur 1) som en del av et større bevarings- og gjenopprettingsprogram. I dette tilfellet tjener det fangede forplantningsprogrammet tre spesifikke identifiserte roller: 1) en forsikringspopulasjon dersom den eksisterende ville befolkningen går tapt, 2) en forskningspopulasjon designet for å fylle ut identifiserte økologiske og livshistoriske kunnskapshull som kan bidra til å informere utvinning og / eller ledelse, og 3) for å produsere levedyktige organismer for bevaring overføring til steder innenfor skattesønnens historiske område. Den resulterende protokollen har blitt godt undersøkt og bevist, etter å ha blitt utnyttet og forbedret i over et tiår. Derfor føler vi at de beskrevne teknikkene og metodene representerer en levedyktig modell som kan brukes på eller lett tilpasses andre ex situ risikoutsatte sommerfuglprogrammer, spesielt de som involverer Lycaenidae eller relatert taxa. Selv om vi ikke foreslår at den beskrevne protokollen er bedre enn andre, føler vi at det finnes muligheter for å bruke noen av metodene i større grad for å bidra til å øke produktiviteten, omsorgen eller effektiviteten. Dette gjelder spesielt som mye av vår avl er gjort under innendørs laboratorieforhold med begrenset plass, lik bevaring programmer som involverer Euphydryas editha taylori og Speryeria zerene hippolyta17,23. Tallrike andre protokoller bruker ofte pottemateriale for oviposisjon eller larveoppdrett, noe som noen ganger kan føre til økte kompleksiteter knyttet til rovdyrkontroll, miljøkontroll (dvs. fuktighet, temperatur), husdyrovervåking, datainnsamling, planteskadedyrproblemer og plass til å nevne noen21,22. Til slutt skisserer den presenterte protokollen metodene for fangeavl. Mange andre risikoutsatte sommerfuglbevaringsprogrammer involverer hodestart eller fangeoppdragelse med de representative protokollene som reflekterer disse forskjellene. Selv om det ofte er mindre, føler vi at dette bidrar til å utvide den eksisterende utvalget av tilgjengelig informasjon for andre programmer å gjennomgå. Dette er kritisk, fordi de fleste ex situ programmer representerer banebrytende innsats for å bidra til å lette utvinning av sjeldne og ofte dårlig studert taxa. Tilgjengelige protokoller kan tjene som et utmerket utgangspunkt for å bidra til å gi verdifull innsikt, redusere duplisering av innsats og fremme innovasjon. På grunn av "det omfattende interspesifikke mangfoldet av sommerfuglatferd, livshistoriske trekk og økologiske krav kombinert med ofte markerte forskjeller i programfasiliteter, budsjetter, utøverkompetanse" og andre iboende forskjeller, er avhengighet av en enkelt metodikk, selv for nært beslektet taxa, ofte begrensende og uberettiget30. Fleksibilitet til å avgrense eller utvikle nye protokoller skreddersydd til behovene til spesifikk taxa eller programmer er avgjørende for suksess og bør derfor understrekes. Vi beskriver i tillegg laboratorieteknikker for å samle beregninger på organismeutvikling under fangede forhold, inkludert antall larvalinstjerner, varighet av individuelle utviklingsstadier, total utviklingstid og larve og pupallengde. Disse teknikkene har bred anvendelighet for livshistoriske studier av Lepidoptera som kan brukes til å avgrense ex situ protokoller eller informere feltdata.
Protocol
1. Sikre vellykket voksen frieri og parring
- Etter vellykket eclosion, slipp levedyktige voksne sommerfugler inn i en sikker, walk-in, screenet flight bur som ligger i et temperaturkontrollert drivhus (Supplerende figur 2).
MERK: Voksne kan merkes på luftrørets overflate med permanente blekkmarkører hvis identifisering av bestemte individer er ønsket for separasjon av genetiske linjer, lageropprinnelse eller for spesifikk datainnsamling relatert til organismens levetid, atferd, Etc.- Mens de eksakte burdimensjonene kan variere, må du sørge for at det er god plass til tilstrekkelig nektarplantemateriale som er nødvendig for å støtte tettheten av huset voksne sommerfugler og gi rom for et menneske å fritt stå og dreie seg rundt.
- Utover temperaturregulering, sørg for at drivhuset er sikkert slik at det kan gi et andre lag av inneslutning sammen med beskyttelse mot dårlig vær (f.eks. kraftig regn, vind).
- Løft pottenektarplantematerialet slik at det ikke er mer enn 30 cm plass fra innsiden toppen av buret til de høyeste blomstrende blomstene (Tilleggstall figur 2). Dette gir optimal tilgang til tilgjengelige nektarressurser, tilbyr rikelig voksen perches, og minimerer overflødig flyaktivitet.
- Plasser en pottevertanlegg i flyburet. Dette sikrer at selv om et paret er savnet noen resulterende egg lagt kan samles.
- Gi konsistent luftstrøm. Dette forbedrer frieriaktivitet og parring suksess. I en drivhussetting brukes blåsere og faste mount sirkulasjonsvifter best for å forbedre ventilasjon og luftbevegelse. Mindre bærbar ventilasjon, for eksempel boks- eller skrivebordsvifter, kan også brukes.
- Opprettholde den interne drivhustemperaturen mellom 27 °C og 32 °C for å fremme optimal voksen aktivitet og parring suksess. Temperaturen inne i buret overvåkes ved hjelp av et sporbart minneovervåking termometer.
- Mist det skjermede flyburet regelmessig (omtrent en gang hver 2 timer) med vann ved hjelp av en håndpumpe, plasttanksprøyteeller hageslange.
- Samle forsiktig individuelle par fra det skjermede flyburet ved hjelp av et 50 dram klart plasttrykkhetteglass (Materialbord),plasser ett til to par per hetteglass, og transport til et innendørs oppdrettsrom eller laboratorium (Tilleggsnummer 3).
2. Maksimere eggproduksjonen
- Sett sammen oviposisjonskammeret.
- Ta en 12 unse vanlig hvitt papir kopp og ved hjelp av en snap blad verktøyet kniv, lage to horisontale kutt på hver side av koppen tvers fra hverandre. Hvert kutt skal være ca. 1 cm under felgen.
- Skjær en enkelt bomullspinne i to og sett stangenden av hver inn i de to horisontale kuttene på hver side av papirkoppen slik at bomullspinnedelen strekker seg ca. 2 cm mot innsiden av koppen.
- Bruk en kniv med et hurtigbladverktøy, gjør to "X"-kutt i bunnen av papirkoppen. Hvert diagonalt snitt skal være ca. 1 cm langt.
- Ta en 9 unse plast kopp og fylle bunnen med ca 2 cm vann fra springen.
- Plasser en frisk skjæring, ca 15 cm lang, av terminal larval vert plantevekst i papirkoppen ved å sette stammen gjennom en av "X" kutt i bunnen. Skyv stammen gjennom kuttet slik at ca. 4-5 cm stikker ut bunnen.
- Legg papirkoppen med vertsmateriale i plastkoppen, og sørg for at plantestammen er i vann.
- Fyll en 1 ml sub-Q sprøyte (0,45 mm x 16 mm) med en flavored sportsdrikk og mette begge bomullspinner i papirkoppen. Disse fungerer som kunstige blomster.
MERK: Melon og frukt punch flavored sports drink gir det beste nektar alternativet. - Når hvert parpar skiller, plasser 2-3 gravide kvinner i den monterte koppkonfigurasjonen (dvs. oviposisjonskammeret).
- Dekk koppen med et kutt kvadratfragment av svart tyll (ca. 15 cm x 15 cm) og fest den med et gummibånd rundt lokket (Tilleggsfigur 4). Svart tyll gir den beste synligheten i koppen og enkel identifisering av egg som av og til kan legges på tyllen.
- Stimulere voksen sommerfugl aktivitet og oviposisjon.
- Plasser hvert oviposisjonskammer på en laboratoriebenk eller et bord ca. 19 cm under en klemmelampe på 8,5 tommer (21,59 cm) med en aluminiumsreflektor som huser en 40 W glødepære (Tilleggstall figur 5).
MERK: Glødelyset gir den strålende varmen som er nødvendig for å stimulere voksenaktivitet og oviposisjon. - Plasser et sporbart minneovervåking termometer ved siden av lysene og kjør temperatursensoren slik at den hviler på toppen av et ovipositionkammer som ligger rett under et klemmelys.
MERK: Måltemperaturområdet er mellom 27.5 °C-29 °C. - Legg til supplerende klemmelys etter behov, avhengig av det totale antallet ovipositionale kamre utplassert.
- Plugg klemmelys inn i en programmerbar 15 Amp 24 h innendørs plug-in mekanisk timer med to uttak (programmerbare i 30 min tidstidsintervaller).
- Still inn timeren for å slå på klemmelyset i 30 min intervaller (dvs. en repeterbar syklus på 30 min på, 30 min av).
MERK: Denne lyssyklusen bidrar til å maksimere eggproduksjonen ved å gi repeterbare perioder med belysning for å stimulere voksen sommerfuglaktivitet og oviposisjon etterfulgt av korte mørke hvileperioder. - Oppdater bomullspinnene i hver kopp med smaksatt sportsdrikk via sub-Q-sprøyten og tåke regelmessig med vann ved hjelp av en plastsprayflaske omtrent hver 2-3 timer eller etter behov.
MERK: Dette gir tilstrekkelig kunstig nektar og fuktighet for å gjøre det mulig for sommerfuglene å frigjøre mat etter ønske. Det forbedrer dermed både voksen levetid og oviposisjon produktivitet under laboratorieforhold der levende, blomstrende plantemateriale ikke lett kan benyttes. - Overvåk kopper regelmessig og erstatt vertsanlegg med friske borekaks etter behov.
- Når eggene begynner å klekkes eller tettheten av egg blir høy, flytter du kvinnen(e) til en ny kopp med frisk vert og begynner larverprotokoll med nyfødte.
- Plasser hvert oviposisjonskammer på en laboratoriebenk eller et bord ca. 19 cm under en klemmelampe på 8,5 tommer (21,59 cm) med en aluminiumsreflektor som huser en 40 W glødepære (Tilleggstall figur 5).
3. Larval omsorg og vedlikehold
- Gjenta trinn 2.3-2.6 for å montere kopper for larver.
- Når egg begynner å klekkes, flytt vertsplantemateriale med egg og nyfødte larver inn i en nymontert kopp, og plasserer stammen gjennom den andre "X" i bunnen, slik at plantestammen er i vann og etterlater berøre tilstøtende frisk vertskjæring.
- Når larver er unge (nyfødte-2 instar), sjekk larvekopper daglig for friskhet av vertsplantemateriale og tilstedeværelse av mugg eller overdreven frass.
MERK: Daglig fjerning av vertsmateriale anbefales ikke når larver er unge fordi dette kan føre til organismeskade på grunn av håndtering og/eller unødvendig sløsing med ferskt vertsmateriale. - Hvis vertsmateriale er visnet eller i ellers dårlig stand, plasser en annen skjæring av ferskt vertsmateriale i koppen slik at det berører eksisterende løvverk og lar larver flytte til den nye verten alene.
- Når larver når 3rd instar, erstatt papirkopp og legg til ferskt vertsmateriale daglig.
- Bruk en liten kamel hår akvarell pensel for å forsiktig flytte larver fra det gamle vertsmaterialet eller koppoverflaten til friskt vertsmateriale i den nye koppen.
- Plasser det gamle vertsmaterialet i en tom rektangulær plastmatbeholder.
- Gjenta trinn 3.5-3.7 daglig og til alle kopper med larver er behandlet.
- Når du er ferdig, legg til en liten mengde ferskt vertsmateriale på toppen av planteavfallet i oppbevaringsbeholderen for mat og legg løst et lokk på toppen.
MERK: Dette fungerer som en sikring i tilfelle larver blir oversett under daglig behandling fordi de vil krype på det nye vertsmaterialet på toppen av planteavfallet og kan fjernes neste dag. - Vedlikehold kopper under laboratorietemperatur mellom 25 °C-28 °C for optimal larvalaktivitet og utvikling (Tilleggstall skr. 6).
MERK: For å nå optimale oppfølgende temperaturer under innendørs forhold, er det ofte nødvendig å plassere kopper under klemmelys med aluminiumsreflektorer som huser 40 W glødepærer. Temperaturer kan deretter overvåkes aktivt ved hjelp av et sporbart minneovervåking termometer og lyshøyden justert for å nå optimale rearing forhold.
4. Konstruere puperingskammeret
- Klipp en enkelt ansikt bølgepapp papirrull i like stor størrelse 3,8 cm x 3,8 cm firkanter.
- Plasser en firkant i en 2 unse klar plast porsjon kopp.
- Plasser koppen på et klart plastkoppbrett (Tilleggstall figur 7).
5. Forbereder larver for pupering
- Identifiser modne larver klare til å pupere under daglig kolonibehandling.
MERK: Slike larver vil slå en uniform kjedelig grønnbrun, miste chevronene sine, og ofte vandre av verten. - Fjern forsiktig hver modne larve med en liten kamel hår akvarell pensel eller tang og plasser en i hvert puperingskammer.
- Fest det klare plastlokket fast på puperingskammeret.
- Gjenta trinn 5.1-5.3 til alle larver klar til å pupere er overført til puperingkamre som legger til nye plastskuffer etter behov (Tilleggstall skr. 8).
6. Opprettholde pupper
- For hvert brett med puperingkamre registrerer du datoen for første pupering og annen relevant informasjon som trengs (dvs. genetisk linje, eksperimentell studie osv.).
- Organiser skuffer etter dato og plasser på et sikkert sted i laboratoriet (Tilleggsfigur 8).
- Overvåk skuffer daglig for voksen eclosion.
MERK: Laboratorieforhold som temperatur vil sterkt påvirke utviklingstiden. - Før voksen eclosion (vanligvis innen 10 dager etter første pupering), fjern lokkene fra individuelle pupation kamre og legg brettet i en 34,29 cm x 34,29 cm x 60,96 cm sammenleggbar mesh pop-up oppdrett bur (Supplerende Figur 9).
MERK: Pupae godt festet i sporene på de bølgepapppapirfirkantene gjør det enklere å lykkes voksen eclosion (Tilleggstall stil). - Gjenta hele protokollen fra trinn 1.1 for den påfølgende fangegenerasjonen.
7. Vurdere utviklingstid for umodne stadier og antall stadia
- Legg en enkelt larve under et dissekeringsmikroskop. Bruk en liten kamel hår akvarell pensel for å forsiktig flytte og isolere larver for å unngå skade på organismen.
- Dypp et enkelt hår av penselen i giftfri lysende maling (Materialtabell),og legg forsiktig en liten dråpe maling på baksiden (dorsum) av larven. Bruk en malingsfarge som skiller seg ut fra bakgrunnsfargen og mønsterfargen på larven (Tilleggsfigur 11). Sørg for å unngå å plassere maling på larvens hode.
- Når malingen tørker (ca 30 s eller så), plasser hver enkelt larve i sin egen 2 unse klar plast porsjon kopp som inneholder ca 1-3 små blader av fersk terminal vertsmateriale og skrive en unik identifikator på koppen og lokket (Supplerende figur 12).
- Kontroller forsiktig hver larve daglig. Fjern blader og sett på hvit overflate. Inspiser kopp, klart lokk og undersøk blader under et dissekeringsmikroskop for tilstedeværelse av larvaleksuvia (støpte skinn) og/eller hodekapsler.
- Hvis det oppdages et larvaleksuvia, fjerner du den fra koppen og plasserer den i et mikrocentrifugerør merket med tilsvarende koppnummer og datoen (se trinn 8.1-8.6. nedenfor).
- Male larver etter hver smeltet og ta opp smeltede datoer.
- Mål den totale kroppslengden (hode til siste abdominal segment) av hver larve daglig ved hjelp av digitale kalipere. Ta tre målinger og registrer gjennomsnittet av de tre, sammen med dato og klokkeslett. For tidlig instar larver bør et forstørrelsesglass eller dissekereomfang brukes ved måling for å sikre nøyaktige målinger.
- Returner larven til sin tilsvarende plastporsjonskopp.
- Legg til ferskvertmateriale etter behov og fjern alle frass og gamle host rusk. Hvis mugg finnes i koppen, kast og bruk en ny kopp. Skriv riktig unikt identifikatornummer i den nye koppen.
- Gjenta trinn 7.5-7.9 til alle larver når sin siste instar og start prepupal scenen. Når larver slutter å mate, slå en uniform kjedelig grønnbrun farge, miste chevrons, og ofte vandre av verten, minimere forstyrre dem.
- Legg et lite stykke bølgepapp i koppen (se trinn 4.1).
- Når hver larve er helt pupert, mål den totale lengden som i trinn 7,8 ovenfor og registrere datoen for pupering. Dette blir den siste smeltingen av hver enkelt person.
- Sjekk på pupae daglig og registrer eclosion dato og sex av hver resulterende voksen sommerfugl.
- Mål vingeakkordlengden til hver sommerfugl ved hjelp av digitale kalipere. Sommerfugler kan forsiktig holdes med tang for måling. Hvis sommerfuglen er for aktiv til enkelt å måle, plasser den midlertidig i kjøleskap i 30 s eller mindre og prøv igjen.
8. Innsamling av larveeksuviae
- Når det observeres et larvaleksuvia, fyller du et mikrocentrifugerør med 0,2 μl glyserin. Merk toppen av lokket og siden med larvenummeret, smeltedens dato og hodekapsel (H.C.).
MERK: Larvene til noen lepidopteran larver bruker regelmessig eksuviaen, men hodekapselen skal forbli. - Legg larvalexuvia og tilhørende hodekapsel i et klart plastporsjonslokk og legg et par dråper etanol i den.
- Undersøk larvalexuvia under et dissekeremikroskop ved å plassere det i et klart plastporsjonslokk og sette noen dråper etanol på den. Hvis larvalhodekapselen allerede er skilt fra eksuvia, plasser en dråpe glyserin på spissen av spisse entomologiske tang og berør hodekapselen forsiktig til glyserin. Plasser hodekapselen i det tilknyttede mikrocentrifugerøret.
- Hvis hodekapselen fortsatt er festet til larvaleksuvia, bruk spisse tang og en insektpinne for å skille hodekapselen fra larvaleksuvia.
- Når den er separert, bruk glyserinteknikken til å plukke opp hodekapselen. Hvis det er for mye etanol, kan du bruke et lite papirhåndkle for å fjerne noen, men vær forsiktig så du ikke ved et uhell fjerner hodekapselen.
- Plasser hodekapselen i et merket glyserinfylt hetteglass og lukk lokket tett.
Representative Results
I løpet av to separate bevaringsinitiativer rettet mot utvinning av Cyclargus thomasi bethunebakeri fra februar 2003 til desember 2010 og fra november 2016 til i dag ble denne protokollen brukt til å produsere et overskudd på 51 052 levedyktige organismer. Basert på det ettårige øyeblikksbildet av den samlede innsatte befolkningsproduktiviteten fra juni 2018 til juni 2019 ble det produsert totalt 10 166 levedyktige organismer, som representerer 782,00 ± 118,93 organismer per måned over 13 generasjoner. Tilsvarende var gjennomsnittlig total eggproduksjon per kvinne under laboratorieforhold 114,00 ± 26,12 (n = 12)31. Den resulterende betydelige organismeproduktiviteten rangerer dette programmet blant de største slike ex situ innsats i USA, sammen med de av Euphydryas editha taylori, Speyeria zerene hippolyta, og Lycaeides melissa samuelis24. En del av denne produktiviteten kan tilskrives det faktum at sommerfuglen er kontinuerlig ruget, produserer en generasjon omtrent hver 4-6 uker i fangenskap. De fleste andre bevaringavlsprogrammer involverer taksdyr som er univoltine eller bivoltine. Likevel, selv for programmer som involverer ekstremt fecund taxa som Speyeria spp., det totale antall levedyktige organismer produsert for bevaring translokasjon på årlig basis overstiger sjelden noen tusen32. Følgelig har vår fangebefolkning gjort det mulig for rettet forskning og omfattende datainnsamling på en rekke viktige datahull som er viktige for å forbedre beste laboratorieavl og husdyrholdpraksis (figur 1) samt bidra til å informere utvinning og ledelsebeslutninger.
Gjennomsnittlig total utviklingstid fra neonat larven til voksen var 28,63 dager (tabell 1). De fleste larver hadde fire molts (figur 2, figur 3), selv om to hadde fem smelter, og en hadde seks smelter. Den totale gjennomsnittslengden på alle larvalinstjerner var 5,97 mm, og larver var størst på fjerde og prepupal livsstadier (Tabell 1). Når bare inkludert variabler med mer enn 30 observasjoner, ble den korteste tiden brukt i de første instar og prepupal stadier, og den lengste ble brukt som pupae (Tabell 1, Figur 2). Kvinner utviklet seg vanligvis raskere i alle umodne stadier sammenlignet med menn, selv om dette ikke var en signifikant effekt (p = 0,625). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av RStudio versjon 1.1.463 (R Core Team 2016)33. Gjennomsnittlig voksen vinge akkord lengde var 12,64 mm (Tabell 2), og det var en betydelig forskjell mellom kjønnene (p = 0,047). Den tosidige t-testen ble kjørt for å evaluere vingeakkordforskjellen mellom kjønnene. Lineær regresjonsmodell og trinnvis regresjon for gjennomsnittlig lengde på hvert livsstadium viste at pupallengde var den beste prediktoren for voksen vingeakkordlengde (Tabell 3, Tabell 4). Regresjonsmodeller for utviklingstid viste at antall dager i fjerde instars og totalt antall dager var de beste prediktorene for voksen vinge akkord lengde, men bare antall dager i fjerde instar var betydelig (Tabell 5, Tabell 6). Fordi variablene var kontinuerlige, ble to lineære regresjonsmodeller kjørt for utviklingstiden for hvert livsstadium, samt lengden på hvert livsstadium, med voksen vingeakkordlengde som avhengig variabel. Trinnvis regresjoner ble kjørt på begge regresjonsmodeller for å bestemme de beste prediktorene for voksen vingeakkordlengde.
Supplerende figur 1: Festede prøver av voksne Cyclargus thomasi bethunebackeri. (A) Voksen mann, dorsal (venstre), ventral (høyre). (B) Voksen kvinne, dorsal (venstre), ventral (høyre). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 2: Skjermet flybur plassert i temperaturkontrollert drivhus. (A) Interiør viser pottede voksne nektar planter og en enkelt potted larval vert plante. (B) Metallhyller bidrar til å heve pottede nektarplanter slik at det ikke er mer enn 30 cm plass fra innsiden toppen av buret til de høyeste blomstrende blomster. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 3: Prosedyre for innsamling av voksne par i kopula. (A) Parpar av voksen Cyclargus thomasi bethunebakeri inne i det skjermede flyburet (kvinne, høyre og mann, venstre). (B) Paring par samlet fra flyburet i snap cap hetteglass og brakt inn i laboratoriet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tilleggstall figur 4: Prosedyre for montering av oviposisjonskammer. (A) To kopp system med terminal vertsmateriale og bomullvattpinner. (B) En 1 ml sub-Q sprøyte (0,45 mm x 16 mm) med flavored sports drikke mettende bomull vattpinner i papirkoppen. (C) Kopper bolig gravid kvinner sikret med svart tyll. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 5: Laboratorieoppsett for å maksimere eggproduksjonen. (A) Oviposition kamre plassert på en laboratoriebenk under et klemmelys med en 40 W glødepære. (B) Et sporbart minneovervåking termometer er plassert ved siden av lysene med temperatursensoren hviler på toppen av et oviposition kammer plassert rett under et klemmelys. (C) En 1 ml sub-Q sprøyte og små beger holder flavored sports drink plassert ved siden av oviposition kamre for å lette forfriskende bomull spinner regelmessig hele dagen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 6: Laboratorieoppsett for larvalpleie og vedlikehold. (A) To kopp system med hver inneholder frisk terminal vertsmateriale og larver. (B) Temperaturen i koppene opprettholdes mellom 25 °C-28 °C for optimal larvalaktivitet og utvikling ved å føre til klemmelys med 40 W glødepærer. (C) Et sporbart minne overvåking termometer med temperatursensoren plassert direkte i en kopp brukes til å overvåke temperaturen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 7: Forberedt epupation kamre. (A) Individuelle plastporsjonskopper plassert på de klare plastkoppbrettene. (B) En bølgepapp firkant er plassert i hver plastporsjonskopp. (C) En enkelt moden larve vil bli plassert i hver forberedt plast porsjon kopp å pupere. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 8: Forbereder larver til pupering og pupalvedlikehold. (A) Modne larve klar til å pupere på bølgepapp. Det er en uniform kjedelig grønnbrun og har mistet noen chevrons. (B) Pupation kamre klar til å motta modne larver ved siden av kopper med fôring larver. Alle puperingskamre med lokk huslarver som forbereder seg på å dukke opp. (C) Pupering kamre med pupper. (D) Banker av pupering kamre med pupper organisert etter dato og vedlikeholdt under laboratorieforhold. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 9: Laboratorietnødbur. (A) En sammenleggbar mesh pop-up oppdrett bur husing okkuperte pupation kamre. (B) Lokkene til alle pupation kamrene er fjernet for å lette vellykket voksen eclosion. (C) Alle resulterende levedyktige voksne sommerfugler vil bli sluppet ut i det skjermede flyburet for å sikre vellykket copulation. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 10: Voksen mannlig sommerfugl vellykket eclosing fra pupa på en bølgepapp firkantet. (A) Voksen eclosing fra pupa. (B) Voksen helt fjernet fra pupal huset. (C) Voksen posisjonert for å utvide sine vinger. (D) Voksen utvide sine vinger. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tilleggstall Figur 11: Femte instar larve merket med giftfri lysmaling. (A) En liten dråpe kontrasterende rød, giftfri lysende maling er plassert på dorsum ved hjelp av en pensel for å markere larven. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 12: Oppdragelse sup for livshistorie studie. (A) Unikt merket 2 unse klar plast porsjon kopper. (B) En enkelt larve er sequestered i hver kopp. (C) Alle larver spores individuelt gjennom alle utviklingsstadier fra nyfødte til voksen sommerfugl. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 1: Antall registrerte par i copula basert på temperatur (°C) innenfor en walk-in, skjermet flybur plassert i et temperaturkontrollert drivhus. Temperaturen ble registrert innen de første 2 min etter en vellykket paringshendelse (n = 411). De resulterende dataene ble brukt til å avgrense de kontrollerte miljøforholdene for å maksimere parringssuksessen og til slutt generell fangeforplantningsproduktivitet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Gjennomsnittlig utviklingstid (antall dager) av hvert umodne livsstadium. (A) Stolper viser gjennomsnittet for hver gruppe, og feilfelt representerer de øvre og nedre standardavviksverdiene for hver gruppe. (B) Mørkeblå barer representerer kvinner, og lyseblå representerer menn. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Hodekapsler samlet inn fra individuelle #25 ved hjelp av livshistorikkprotokoll. Hodekapsler ble fotografert av Johnathan Bremer ved hjelp av et automontagesystem. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Livet scenen | Gjennomsnittlig kroppslengde (mm) | Std. Feil (lengde) | Gjennomsnittlig utviklingstid (antall dager) | Std. Feil (dev. tid) |
| Instar I | 1.69478261 (n=23) | 0.02152643 | 2.90625 (n=32) | 0.08229783 |
| Instar II | 2.77248958 (n=32) | 0.04302826 | 3.375 (n=32) | 0.16649857 |
| Instar III | 5.45751042 (n=32) | 0.12120829 | 3.5 (n=32) | 0.20080483 |
| Instar IV | 10.2369688 (n=32) | 0.23653991 | 3.875 (n=32) | 0.18917265 |
| Instar V | 8.7625 (n=2) | 2.6125 | 1.5 (n=2) | 0.5 |
| Instar VI | 10.2666667 (n=1) | Na | 3 (n=1) | Na |
| Pre-pupa | 11.0858333 (n=24) | 0.23948251 | 2.9375 (n=32) | 0.21504641 |
| Puppe | 9.0316129 (n=31) | 0.12106792 | 11.6578947 (n=38) | 0.3272288 |
Tabell 1: Gjennomsnittlig lengde og utviklingstid for hvert livsstadium. Standardfeil som er inkludert for hver variabel og utvalgsstørrelse i parentes.
| Livet scenen | Gjennomsnittlig vinge akkord lengde (mm) | Std. Feil |
| Voksen | 12.63895 (n=38) | 0.1365516 |
| Kvinnelige | 12.960 (n=13) | 0.1465588 |
| Mannlige | 12.472 (n=25) | 0.1863205 |
Tabell 2: Gjennomsnittlig forewing vinge akkord lengde for voksne sommerfugler. Inkluderer midler for kvinner, menn og alle voksne (begge kjønn kombinert).
| LM Modell 1 | Std. Feil på estimat | t verdi | p-verdi |
| Fange opp | 1.9179 | 3.128 | 0.0046 ** |
| Gj.sn. lengde andre instar | 0.6822 | -1.11 | 0.278 |
| Gj.sn. lengde tredje instar | 0.2928 | 0.476 | 0.6381 |
| Gj.sn. lengde fjerde instar | 0.1373 | -0.57 | 0.5739 |
| Gj.sn. lengde puppene | 0.246 | 3.957 | 0.0005 *** |
| p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. | |||
Tabell 3: Koeffisienter tabell for lineær regresjonmodell (LM Modell 1) for å evaluere forholdet mellom gjennomsnittlig lengde på hvert livsstadium (n > 30 inkludert i analyse) og voksen vinge akkord lengde. Avhengig variabel: voksen vinge akkord lengde (mm).
| Koeffisientene | Std. Feil på estimat | t verdi | Pr (>|t|) |
| Fange opp | 1.7091 | 3.031 | 0.0053 ** |
| Gj.sn. lengde puppene | 0.1878 | 4.414 | 0.0002 *** |
Tabell 4: Trinnvis regresjon (Trinnvis 1). Avhengig variabel: voksen vinge akkord lengde (mm).
| LM Modell 2 | Std. Feil på estimat | t verdi | p-verdi |
| Fange opp | 1.1888 | 12.643 | 4.21e-12 *** |
| Antall dager første instar | 0.3486 | 0.937 | 0.3583 |
| Antall dager andre instar | 0.2603 | -0.686 | 0.4993 |
| Antall dager tredje instar | 0.2281 | 1.028 | 0.3141 |
| Antall dager fjerde instar | 0.2048 | 2.378 | 0.0257 * |
| Num. dager pre-pupae | 0.222 | 1.133 | 0.2686 |
| Antall dager pupae | 0.2495 | 0.616 | 0.5435 |
| Totalt antall tall. | 0.1913 | -1.454 | 0.1589 |
| p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. | |||
Tabell 5: Koeffisienter tabell for lineær regresjon modell (LM Modell 2) for å evaluere forholdet mellom utviklingstid og voksen vinge akkord lengde. Avhengig variabel: voksen vinge akkord lengde (mm).
| Koeffisientene | Std. Feil på estimat | t verdi | p-verdi |
| Fange opp | 0.89304 | 16.314 | 7.86e-16 *** |
| Antall dager andre instar | 0.17974 | -1.809 | 0.0811 • |
| Antall dager fjerde instar | 0.16917 | 2.075 | 0.0473 * |
| Totalt antall tall. | 0.04184 | -1.787 | 0.0848 • |
| p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05; • p < 0.1 | |||
Tabell 6: Trinnvis regresjon (Stepwise 2) for utviklingstid. Avhengig variabel: voksen vinge akkord lengde (mm).
Discussion
Her illustrerer vi effektiviteten av denne påviste ex situ bevaring avlsprotokollen for masseproduksjon av risikoutsatte sommerfugler, og hvordan den kan tilpasses vitenskapelig forskning for å bidra til å løse viktige atferds- og livshistorie eller økologiske datahull. Økt forståelse av gjennomsnittlig total utviklingstid (egg til voksen), gjennomsnittlig varighet i hvert livsstadium, og optimal temperatur for parring, for eksempel, ble brukt til å avgrense protokollen og forbedre den generelle programsuksessen. De aller fleste eksisterende protokoller beskriver bare organismehusdyrmetoder og diskuterer ikke datainnsamling, vitenskapelig forskning eller bruk av slike resultater for å bidra til å informere og potensielt tilpasse ex situ metoder.
Denne protokollen krever daglig organismehusdyrhold. Organismehelse og produktivitet maksimeres av rene oppvoksende forhold, mangel på overbefolkning i organismen og tilgjengeligheten av larvalvertsmateriale av høy kvalitet. For det meste bruker vi engangsoppdragelsesforsyninger og beholdere (f.eks. papir- og plastkopper), og erstatter dem vanligvis regelmessig, ofte daglig, og bruker aldri materialet på nytt. Dette er både kostnadseffektivt og minimerer behovet for mer arbeidsintensiv sanitære materialer. Vanlige verktøy, men som entomologiske tang, akvarell pensler, og små pop-up flight bur, samt alle bakre overflater som bordplater og laboratoriebenktopper er regelmessig sanitisert ved hjelp av en 5% blekemiddelløsning. Den nøyaktige tidsplanen for sanitærer er svært avhengig av hyppigheten av bruk, organismefenologi og andre variabler, og bør skreddersys til de spesifikke behovene til hvert ex situ-program. Vi finner i tillegg at hvit slakterpapir er nyttig for å dekke alle rearing overflater. Det gir et billig, lett deployerbart rent substrat, og den hvite bakgrunnsfargen letter observasjon av eventuelle bortkomne organismer. For daglig husdyrhold bør alt laboratoriepersonell alltid bruke engangslaboratorieeksamenshansker for å minimere kontaminering og beskytte personell mot potensiell hudirritasjon som følge av plante- eller organismehåndtering. Dette er spesielt kritisk hvis laboratoriepersonell har husdyr som krever aktuelle loppebehandlinger. Selv en liten mengde aktive ingrediensrester kan være farlige for fangede husdyr.
I tillegg bør det utvises forsiktighet for å minimere overbefolkning i organismen. Overbefolkning av larver kan raskt føre til redusert organismehelse og til og med kannibalisme i visse tak, spesielt Lycaenidae. Regelmessig skille larver for å redusere antall i oppdrett av beholdere og / eller til og med isolere individuelle larver som beskrevet i livshistoriedelen av protokollen kan være nødvendig. De ideelle tallene per container kan variere betydelig basert på den spesielle taksonen og ulike ex situ programbegrensninger som tilgjengelig budsjett, laboratoriefasiliteter og totalt antall husdyrholdpersonell. Vi anbefaler på samme måte å forlate tilstrekkelig plass mellom kopper som huser larver for å minimere potensialet i organismebevegelse mellom beholdere. Til slutt, for større fangede populasjoner, anbefales det sterkt å skille lager mellom ett eller flere laboratorieanlegg. Denne beskyttelsesstrategien kan bidra til å minimere katastrofale tap av hele befolkningen på grunn av sykdom eller andre uforutsette konsekvenser.
Larval vert plantekvalitet og tilgjengelighet driver husdyrproduksjon og sterkt påvirker både larval utvikling priser og generelle befolkningen helse. Likevel, få publiserte rapporter eller studier fremheve dette backstage kravet eller diskutere beste barnehage praksis. Vellykket ex situ programplanlegging må ta hensyn til tilstrekkelige plantemengder, produksjon og vedlikehold. Så mange larver krever eller foretrekker visse plantedeler (f.eks. terminal ny vekst, blomsterløk og blomsterstander, frukt osv.), effektiv iscenesettelse for å sikre at det er nødvendig med riktig plantefenologi.
Ytterligere hensyn inkluderer riktig demografisk og genetisk styring, og minimering av eventuelle negative effekter av fangenskap. Vi anbefaler utviklingen av en genetisk forvaltningsplan. Dette kan omfatte strategier for å inkludere infusjon av nytt genetisk materiale regelmessig, maksimere mangfoldet og forhindre nær innavl, periodisk evaluere viktige organisme fitness variabler, og overvåke genetikk på et eller annet nivå for å muliggjøre sammenligning til bevarte populasjoner og sjekke fanget lager helse. Periodisk sammenligning av egenskapene til fangede individer til personer fra grunnleggelsen populasjoner er også berettiget34,35.
Disse protokollene representerer bevist beste praksis. De bør være gunstige for en rekke forskere og bevaringutøvere som direkte kan bruke eller tilpasse våre metoder til sine egne studier og ex situ risikoutsatt sommerfugl eller insekt bevaring og utvinning programmer. Den spesifikke skisserte fangeavlsprotokollen gjelder sannsynligvis mest for programmer som fokuserer på andre Lycaenidae, relatert e-post eller mindre store taksjer. Likevel, mange komponenter som de som involverer sikring vellykket frieri og copulation, voksenvedlikehold med kunstig nektar, maksimere oviposition, og generell larval omsorg kan uten tvil bli mer bredt brukt eller tilpasset et bredere array av taxa. Som nevnt tidligere, mens protokollfleksibilitet bør vektlegges, kan tilgang til andre etablerte metoder bidra til å gi verdifull innsikt og et levedyktig utgangspunkt for tilpasning og innovasjon. Metodene som presenteres for å vurdere ulike livshistoriske egenskaper som larvalutviklingstid og antall larval stadia har uten tvil bred anvendelse for andre bevaringsavlsprogrammer og risikoutsatt taxa. Vi oppfordrer andre til å bidra til å løse viktige økologiske datahull når det er mulig og publisere vetted protokoller og programresultater.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra U.S. Fish and Wildlife Service's Conservation Recovery Initiative (F17AP00467) og Disney Conservation Fund. Ytterligere støtte ble gitt av Florida Museum of Natural History og Institutt for entomologi og nematologi ved University of Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 oz plain white paper cups (Karat) | Lollicup | C-KC16 | |
| 15-Amp 2-Outlet Mechanical Residential Plug-in Countdown Lighting Timer | Lowes | UTTNI2423 | |
| 1ml sub-Q syringes (0.45 mm x 16 mm) | Fisher Scientific | 14-829-10F | |
| 2 oz clear plastic portion cup lids | Party City | #791091 | |
| 2 oz Clear Plastic Portion Cups | Party City | #791088 | |
| 34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm collapsible mesh popup rearing cage | Bioquip | 1466BV | |
| 8.5" 1-Watt Incandescent Clamped Work Light | Lowes | PTC301L | |
| Adoric Electronic Digital Caliper | Amazon.com | B07QX2SK2F | |
| Big Kid's Choice Arts & Crafts Brush Set-12/Pkg, assorted sizes | Walmart | #10965135 | |
| Clear Plastic Cup Tray | Frontier Scientific Services | AG_9040 | |
| Fisher Scientific traceable memory monitoring thermometer | Fisher Scientific | 15-077-8D | |
| Forceps, Straight Points, Swiss Style #4, Stainless | BioQuip | 4531 | |
| Humco Glycerin 6 oz | Walmart | #303951037966 | |
| Luminous Paint Kit, Blue, Red, Yellow, 4 Dram | Bioquip | 1166A | |
| Melon flavored Gatorade Fierce Thirst Quencher or fruit punch flavored Gatorade Thirst Quencher sports drink | Walmart | #568456137 | |
| Neoteck Digital 2 in 1 Hygrometer-Thermometer | Amazon.com | NTK026 | |
| Olympus 0.6 ml Microtubes, Clear, Polypropylene, Nonsterile | Amazon.com | 24-272C | |
| Plastic Tank Sprayer | Lowes | #5318 | |
| Q-tips Cotton swabs | Walmart | #551398298 | |
| Rectangular plastic tupperware container with lid (Rubbermaid) | Walmart | #554320171 | |
| Showgard 903 Stamp Tongs, 4 5/8 inch Spade Tip | Amazon.com | #787793151378 | |
| Single face corrugated paper roll | Amazon.com | BXSF12 | |
| Snap blade utility knife | OLFA | #5023 | |
| Solo 9 oz plastic cups | Solo | SQ950 | |
| Thorton Plastics 50 dram clear plastic snap cap vial (6.25 oz.) | Thorton Plastics | #50 | |
| Tulle Spool 9 inch x 150 feet - Black | Jo Ann Fabrics | #16029696 | |
| Zep 32 oz Plastic Spray Bottle | Lowes | HDPRO36 |
References
- Thomas, J. A.
- Swengel, S. R., Schlicht, D., Olsen, F., Swengel, A. B. Declines of prairie butterflies in the Midwestern USA. Journal of Insect Conservation. 15 (1-2), 327-339 (2011).
- Habel, J. C., et al. Butterfly community shifts over two centuries. Conservation Biology. 30 (4), 754-762 (2016).
- Gilburn, A. S., et al. Are neonicotinoid insecticides driving declines of widespread butterflies? Peer J. 3, e1402 (2015).
- Sánchez-Bayo, F., Wyckhuys, K. A. G. Worldwide decline of the entomofauna: A review of its drivers. Biological Conservation. 232, 8-27 (2019).
- Daniels, J. C., Magdich, M., Tolson, P. Butterfly recovery planning: Determining how to contribute. Butterfly Conservation in North America: Efforts to Help Save Our Charismatic Microfauna. Daniels, J. C. , Springer Science+Business Media B.V. New York. 1-21 (2015).
- U.S. Fish and Wildlife Service. Environmental Conservation Online System. Listed Animals. , https://ecos.fws.gov/ecp (2019).
- Schultz, C. B., Russell, C., Wynn, L. Restoration, reintroduction and captive propagation efforts for at-risk butterflies: a review. Israel Journal of Ecology and Evolution. 54, 41-61 (2008).
- Grow, S., Allard, R., Luke, D. The role of AZA-accredited zoos and aquariums in butterfly conservation. Butterfly Conservation in North America: Efforts to Help Save Our Charismatic Microfauna. Daniels, J. C. , Springer Science+Business Media B.V. New York. 23-34 (2015).
- Crone, E. E., Pickering, D., Schultz, C. B. Can captive rearing promote recovery of endangered butterflies? An assessment in the face of uncertainty. Biological Conservation. 139, 103-112 (2007).
- Sanchez, S. J., Daniels, J. C. The butterfly conservation initiative: Developing a new conservation vision through compound eyes. News of the Lepidopterists' Society. 49 (3), 75-77 (2007).
- Wardlaw, J. C., Elmes, G. W., Thomas, J. A. Techniques for studying Maculinea butterflies: I. Rearing Maculinea caterpillars with Myrmica ants in the laboratory. Journal of Insect Conservation. 2 (1), 79-84 (1998).
- Mattooni, R., Longcore, T., Krenova, Z., Lipman, A. Mass rearing the endangered Palos Verdes blue butterfly (Glaucopsyche lygdamus palosverdesensis:Lycaenidae). Journal of Research on the Lepidoptera. 37, 55-67 (1998).
- Pearce-Kelly, P., et al. The captive rearing of threatened Orthoptera: a comparison of the conservation potential and practical considerations of two species' breeding programmes at the Zoological Society of London. Journal of Insect Conservation. 2 (3-4), 201-210 (1998).
- Wells, C. N., Edwards, L., Hawkins, R., Smith, L., Tonkyn, D. A rearing method for Agrynnis (Speyeria) diana (Lepidoptera: Nymphalidae) that avoids diapause. Psyche. , 1-6 (2011).
- Grosboll, D. N. Captive Rearing the Endangered Mardon Skipper (Polites mardon) and Taylor's Checkerspot (Euphydryas editha taylori) Butterflies: Initial Results (Lepidoptera, Nymphalidae). Proceedings of the species at risk, pathways to recovery conference. , Species at Risk Pathways to Recovery Conference Organizing Committee. Victoria. 1-6 (2004).
- Barclay, E., Arnold, M., Andersen, M., Shepherdson, D. Husbandry manual: Taylor's checkerspot (Euphydryas editha taylori). , 1st edition, Oregon Zoo. Portland, Oregon. (2009).
- Johnson, J., et al. Captive Rearing of the Laguna Mountains Skipper (Pyrgus ruralis laguanae): Final Report. , (2010).
- Linders, M. Captive rearing and translocation of Taylor's checkerspot in South Puget Sound: 2011-2012. 2012 Annual Progress Report to the ACUB Technical Review Committee. , (2012).
- Linders, M., Lewis, K. Captive rearing and translocation of Taylor's checkerspot butterfly (Euphydryas editha taylori.): South Puget Sound, Washington, 2012–2013. 2013 Annual Report to the US Fish and Wildlife Service (Cooperative Agreement F12ACI00835), Joint Base Lewis-McChord Fish and Wildlife Program and JBLM-ACUB Technical Review Committee. , (2013).
- Department of Conservation and Research, Toledo Zoo. Propagation Handbook for the Karner Blue Butterfly Lycaeides melissa samuelis. , Fourth edition, (2006).
- Johnson, J. J., et al. Captive Rearing of Lange's Metalmark Butterfly, 2011-2015. United States Fish and Wildlife Service, CVPIA Habitat Restoration Program (F11AP00168). , (2016).
- Andersen, M. J., et al. Oregon Silverspot Butterfly Husbandry Manual. , Oregon Zoo. Portland, Oregon. (2010).
- Washington Department of Fish and Wildlife. Threatened and Endangered Wildlife in Washington: 2012 Annual Report. Listing and Recovery Section, Wildlife Program, Washington Department of Fish and Wildlife. , Olympia. (2013).
- McGowan, P. J. K., Traylor-Holzer, K., Leus, K. IUCN guidelines for determining how ex situ management should be used in species conservation. Conservation Letters. 10 (3), 361-366 (2017).
- Pearce-Kelly, P., et al. The conservation value of insect breeding programmes: Rationale, evaluation tools and example programme case studies. Insect Conservation Biology: Proceedings of the Royal Entomological Society's 23nd Symposium. Stuart, A. J. A., New, T. R., Lewis, O. T., et al. , 57-75 (2007).
- U.S. Fish and Wildlife Service. Policy Regarding Controlled Propagation of Species Listed Under the Endangered Species Act. United States Federal Register. 65 (183), 56916-56922 (2000).
- IUCN/SSC. Guidelines on the use of ex situ management for species conservation. Version 2.0. IUCN Species Survival Commission. , Gland, Switzerland. (2014).
- Sutherland, W. J., Pullin, A. S., Dolman, P. M., Knight, T. M. The need for evidence-based conservation. Trends in Ecology & Evolution. 19 (6), 305-308 (2004).
- Daniels, J. C., Nordmeyer, C., Runquist, E. Improving standards for at-risk butterfly translocations. Diversity. 10, 67 (2018).
- Saarinen, E. V. Population genetics of the endangered Miami blue butterfly Cyclargus thomasi bethunebakeri.: implications for conservation. , University of Florida. Gainesville. (2009).
- Becker, T. Propagation and repatriation of the regal fritillary butterfly. , http://titag.org/2016/2016papers/beckerregal.pdf (2019).
- R Core Team. R A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2016).
- Schultz, C. B., Dzurisin, J. D., Russell, C. Captive rearing of Puget blue butterflies (Icaricia icarioides blackmorei) and implications for conservation. Journal of Insect Conservation. 13 (3), 309-313 (2009).
- Frankham, R., Loebel, D. A. Modeling problems in conservation genetics using captive Drosophila populations: Rapid genetic adaptation to captivity. Zoo Biology. 11 (5), 333-342 (1992).
