Summary
इस विधि का उद्देश्य फेफड़ों के ट्यूमर विकृति और फेफड़ों के मेटास्टेस के मूल्यांकन की परीक्षा के लिए माउस फेफड़ों के परफ्यूजन, मुद्रास्फीति और निर्धारण के लिए एक सरल और कुशल विधि पेश करना है।
Abstract
फेफड़ों के हिस्टोलॉजी का मूल्यांकन करने की क्षमता फेफड़ों के कैंसर अनुसंधान और कैंसर मेटास्टेसिस के क्षेत्रों के लिए महत्वपूर्ण है। खरीदे गए ऊतकों की गुणवत्ता का त्याग किए बिना अध्ययनों से तेजी से और कुशलता से नेक्रॉप्सी करना भी उतना ही महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य डाउनस्ट्रीम हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए माउस फेफड़ों को तेजी से देखना, फुलाने और ठीक करने के लिए एक विधि पेश करना है। यह विधि फेफड़ों की मुद्रास्फीति को मानकीकृत नहीं करती है; इस प्रकार, इसके लिए किसी विशेष प्रक्रिया या उपकरण की आवश्यकता नहीं होती है और इसके बजाय बस दिल के माध्यम से परफ्यूजन के बाद श्वासनली के माध्यम से सीधे फिक्सेटिव को पैदा करता है। यह ट्यूमर के आकार, हिस्टोलॉजी और स्कोरिंग के पर्याप्त अनुमान के लिए अनुमति देता है। यह फेफड़ों के ऊतकों के निर्धारण से पहले जमे हुए ऊतकों के संग्रह के लिए भी अनुमति देता है। यह विधि सीमित है कि यह फेफड़ों के बाद के रूपोमेट्रिक मात्राकरण के लिए अनुमति नहीं देता है; हालांकि, यह आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जीईएम), सिनेनिक मॉडल, साथ ही ज़ेनोबेड़ा ट्यूमर और मेटास्टेसिस अध्ययन से फेफड़ों के ट्यूमर विश्लेषण के लिए पर्याप्त से अधिक है।
Introduction
फेफड़ों के ऑनकोजेनेसिस और कैंसर मेटास्टेसिस के विभिन्न प्रकार के माउस मॉडल फेफड़ों के भीतर ट्यूमर स्थापित करने के लिए जटिल जेम्स से कैंसरजेन-प्रेरित मॉडल तक सिनेजेनिक और ज़ेनोबेड़ा मॉडल तक मौजूद हैं, जहां कैंसर कोशिकाओं को इंट्राकार्डिएक, इंट्राथोरेसिक, पूंछ नस, या फेफड़ों के भीतर ट्यूमर स्थापित करने के लिए अन्य तरीकों के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है। ये सभी मॉडल फेफड़ों के हिस्टोलॉजी और पैथोलॉजी के हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन की सामान्य आवश्यकता को साझा करते हैं। इस प्रकार, अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए फेफड़ों को छिद्रित करते समय चूहों की नेक्रॉप्सी करने के लिए एक मजबूत अभी तक तेजी से विधि होना आवश्यक है, और फेफड़ों की वास्तुकला को स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए फेफड़ों को फुलाने और ठीक करना आवश्यक है। गति इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक है क्योंकि एक ही समय बिंदु पर दर्जनों चूहों से फेफड़ों को इकट्ठा करना आवश्यक हो सकता है। यह प्रक्रिया प्रति माउस 6 मिनट से भी कम समय में की जा सकती है।
हालांकि यह प्रक्रिया ट्यूमर हिस्टोलॉजी के मूल्यांकन के लिए पर्याप्त से अधिक है, यह उन लोगों के लिए अनुशंसित नहीं है जो फेफड़ों के स्टीरियोलॉजी या मॉर्फोमेट्रिक माप करना चाहते हैं। इस तरह के माप फेफड़ों की मुद्रास्फीति को मानकीकृत करने की आवश्यकता होती है, जैसा कि फेफड़ों के पूर्ण सतह क्षेत्र, पूर्ण मात्रा और अल्वियोलर आकार और संख्या1की गणना है। यह विधि कुछ इमेजिंग दृष्टिकोणों के लिए भी इष्टतम नहीं है। उदाहरण के लिए, पूर्व वीवो मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए μCT के माध्यम से फेफड़ों की इमेजिंग के लिए आवश्यक है कि फेफड़े हवा2से भरे रहें। जब वायु स्थानों और आयामों का संरक्षण प्राथमिक चिंता का विषय होता है, तो फेफड़ों को परफ्यूजन निर्जलीकरण तकनीकों द्वारा ठीक करने की सिफारिश की जाती है3,4। इस मॉडल की सबसे बड़ी चिंताओं में से एक अल्वेलर दीवारों के टूटने की क्षमता है, जो एम्फिसिमा के अध्ययन में इसके उपयोग को कम करती है; हालांकि, एम्फिसिमा के अध्ययन के लिए फेफड़ों के निर्धारण के लिए अनुशंसित प्रक्रिया अभी भी काफी समान है, क्योंकि लगातार तरल दबाव के तहत या सीटू निर्धारण5में 10% फॉर्मेलिन (यहां वर्णित प्रोटोकॉल के समान) के इंट्राचेल इन्स्टिलेशन द्वारा फेफड़ों को ठीक करने की सिफारिश की जाती है ।
यहां वर्णित प्रक्रिया का लाभ यह है कि इसे लगातार तरल पदार्थ के दबाव की आवश्यकता नहीं होती है, इसके बजाय फेफड़ों को फुलाने तक जब तक वे पूरी तरह से विस्तारित नहीं हो जाते, इस प्रकार प्रक्रिया के लिए आवश्यक समय कम हो जाता है। यहां की प्रक्रिया को बारीकी से वर्णित किया गया है, जो टॉक्सिकोलोजिक पैथोलॉजी सोसायटी के एक आयुध द्वारा अनुशंसित तरीकों जैसा दिखता है, जहां विष विज्ञान अध्ययन के लिए फेफड़ों के निर्धारण के सर्वोत्तम तरीकों की सिफारिश करने के लिए एक उपसमिति का गठन किया गया था। इस उपसमिति के भीतर अधिकांश वैज्ञानिकों ने एक सिरिंज के साथ इंट्राचेल इन्स्टिलेशन द्वारा फेफड़ों को ठीक करने की सिफारिश की थी, हालांकि जब फेफड़े को फिक्सेटिव6में छोड़ दिया गया था, उस समय अलग-अलग सिफारिशें थीं। इस प्रकार, जबकि फेफड़ों की मुद्रास्फीति और निर्धारण के विभिन्न तरीके मौजूद हैं, यहां वर्णित विधि को डाउनस्ट्रीम ट्यूमर हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए फेफड़ों को जल्दी से फुलाने और ठीक करने के लिए इष्टतम विधि होने का प्रस्ताव है।
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Protocol
यहां वर्णित सभी तरीकों को बर्मिंघम में अलबामा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. प्रायोगिक प्रोटोकॉल
- एक अनुमोदित IACUC विधि का उपयोग कर माउस का बलिदान। यहां, हमने 5% आइसोफ्लाणे के साथ एनेस्थेटाइज्ड माउस के सर्वाइकल अपभ्रंश का उपयोग किया। अध्ययन के लिए एक उपयुक्त माउस का उपयोग करें; यहां, हम एक 8 सप्ताह पुराने FVB माउस का उपयोग करें
- सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, पेट के निचले हिस्से में 3.5-5 मिमी क्षैतिज चीरा बनाएं। इसके बाद, चीरा से बनाए गए छोटे छेद में सर्जिकल कैंची डालें और माउस की गर्दन के ठीक नीचे केंद्र मिडलाइन को लंबवत रूप से काटें।
- त्वचा को उंगलियों से वापस खींचें और एक्सिलरी लिम्फ नोड्स का निरीक्षण करें।
- सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, पेट की गुहा को खोलने के लिए 3.5 मिमी पार्श्व चीरा बनाएं, और फिर छाती के नीचे तक पूर्वकाल दिशा में काटें। पेट की गुहा में अंगों का निरीक्षण करें: यकृत, तिल्ली, गुर्दे आदि।
- सर्जिकल कैंची के फ्लैट के साथ, या संदंश का उपयोग करके, डायाफ्राम को बेनकाब करने के लिए जिगर को स्थानांतरित करें। ट्यूमर के विकास या मेटास्टेस के लिए डायाफ्राम का निरीक्षण करें। फिर, धीरे-धीरे ऑपरेटर के दाईं ओर डायाफ्राम को स्निप करें, जिससे इसका विस्तार हो सके। छाती गुहा और फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए धीरे-धीरे डायाफ्राम को दाएं से बाएं काट लें। सावधान रहें कि फेफड़ों को न काटें।
- फेफड़ों के बाएं पालि का निरीक्षण करने के लिए बाईं रिब पिंजरे (ऑपरेटर के दाईं ओर) के पार्श्व चरम के माध्यम से काटें।
- धीरे-धीरे फेफड़ों के दाहिने लोब्स को रास्ते से बाहर ले जाएं और सही रिब पिंजरे के पार्श्व चरम को काट लें और रिब पिंजरे को हटा दें।
नोट: रिब पिंजरे को हटाने वैकल्पिक है, हालांकि हटाने के बाद फेफड़ों की मुद्रास्फीति के स्पष्ट दृश्य सक्षम बनाता है ।- यदि ताजा या जमे हुए फेफड़ों के ऊतकों की आवश्यकता है, तो बाएं पालि के ब्रोंचस को दबाने और परफ्यूजन से पहले सर्जिकल कैंची का उपयोग करके बाएं फेफड़ों को फिर से काटना करने के लिए हीमोस्टेट संदंश का उपयोग करें।
- श्वासनली को कवर करने वाले ऊतक को उठाने के लिए संदंश का उपयोग करना, किसी भी अतिरिक्त ऊतक को काट दें। फिर धीरे से वायुमार्ग का पर्दाफाश करने के लिए श्वासनली अस्तर पतली ऊतक काट ।
- सर्जिकल कैंची के साथ गुर्दे की धमनी के माध्यम से काटें।
- फेफड़ों को छिद्रित करने के लिए, दिल के दाहिने वेंट्रिकल में 10 यू/एमएल हेपरिन के साथ 1x पीबीएस इंजेक्ट करने के लिए 22 जी सुई के साथ 3 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। धीरे-धीरे पीबीएस/हेपरिन के साथ लगभग 300 μL/s पर फेफड़ों को छिद्रित करें। फेफड़े अक्सर सफेद हो जाएंगे। इस चरण में आमतौर पर पीबीएस के 2.5 एमएल का उपयोग किया जाता है।
- फेफड़ों की मुद्रास्फीति के लिए, एक 22 जी सुई के साथ एक 3 एमएल सिरिंज का उपयोग करें, इस बार श्वासनली के समानांतर आयोजित किया । श्वासनली में सुई डालें और प्रवाह की दर के साथ 10% फॉर्मेलिन इंजेक्ट करें जब तक कि फेफड़े पूरी तरह से फुल नहीं जाते हैं। एक बार फेफड़ों फुलाया जाता है, फॉर्मेलिन श्वासनली से बाहर बैकफ्लो होगा। कुछ और सेकंड के लिए जगह में सुई पकड़ो और फिर वापस ले लें।
- (वैकल्पिक) सुई और फेफड़ों की मुद्रास्फीति को वापस लेने से पहले, श्वासनली को बांधने के लिए सीवन धागे का उपयोग करें। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, सीवन धागे के 4 इंच का उपयोग करें जो थ्रिप्स की एक छोटी जोड़ी के साथ धागे के बिंदु को पकड़े हुए है। धागे को श्वासनली के पृष्ठीय पक्ष पर रखें और सुई के चारों ओर एक पाश बनाने के लिए खींचें। अगले सुई के चारों ओर एक ओवरहैंड गाँठ बनाते हैं। गाँठ तंग खींचें, श्वासनली से सुई हटाएं, बंद गाँठ।
- दिल को उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें, फेफड़ों के पीछे सीधे सर्जिकल कैंची डालें, और फेफड़ों को फिर से निकालने के लिए दिल को उठाने के दौरान कनेक्टिव ऊतक में कटौती करें।
- इसे फेफड़ों से निकालने के लिए दिल को काट लें।
- फेफड़ों को माउस आईडी या स्टडी आईडी के साथ लेबल किया गया कैसेट रखें। 10% बफर फॉर्मेलिन में कैसेट रखें और 24-48 घंटे के लिए ठीक करें। फेफड़ों को वांछित होने पर एक वर्ष से अधिक समय तक सुधारात्मक में छोड़ा जा सकता है।
- फेफड़ों वाले कैसेट को 70% इथेनॉल में स्थानांतरित करें और हिटॉटोलॉजी के लिए प्रसंस्करण के लिए आगे बढ़ें।
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Representative Results
उपरोक्त प्रोटोकॉल माउस फेफड़ों के त्वरित पर्फ्यूजन, मुद्रास्फीति और निर्धारण के लिए अनुमति देता है। नीचे दिखाए गए आंकड़े प्रत्येक चरण के महत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा 1 में एचएंडई दाग वाले फेफड़ों को दर्शाया गया है जिन्हें पीबीएस और फेफड़ों के साथ प्रेरित किया गया है जिसमें परफ्यूजन कदम को छोड़ दिया गया है या फेफड़े सही ढंग से नहीं चल पाए हैं । जैसा कि दिखाया गया है, खराब पर्षद फेफड़ों में अतिरिक्त रक्त आदर्श हिसटोलॉजी से कम बनाता है और फेफड़ों की वास्तुकला का पूरी तरह से निरीक्षण करना चुनौतीपूर्ण बना सकता है। चित्रा 2 मुद्रास्फीति के महत्व के साथ-साथ अधिक मुद्रास्फीति के खतरों दोनों को दर्शाता है । एल्वेओली के संपीड़न और करीब निकटता के कारण अन-फुलाया फेफड़ों में हाइपरप्लासिया के क्षेत्रों की पहचान करना अधिक कठिन है; हालांकि, ओवरइनफ्लेटेड फेफड़ों में, कई अल्वेलर दीवारों को तोड़ दिया गया है और यदि सावधान नहीं हैं तो यह एम्फिसिमा के लिए गलत हो सकता है। चित्र 3 फेफड़ों में ट्यूमर हिसटोलॉजी को दर्शाया गया है जिसे यहां वर्णित तकनीक का उपयोग करके और फुलाया गया है।
चित्रा 1: प्रतिनिधि एचएंडई ने परफ्यूस्ड और गैर-परफ्यूस्ड फेफड़ों का धुंधला किया। (A)पीबीएस के साथ फेफड़े । (ख)फेफड़े नहीं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: प्रतिनिधि एचएंडई फुलाया, बिना फुलाया, और अधिक फुलाया फेफड़ों के धुंधला । (A)फेफड़ों को फुलाया गया और 10% फॉर्मेलिन के साथ तब तक ठीक किया गया जब तक कि फेफड़ों का पूरी तरह से विस्तार नहीं हो जाता । (ख)फेफड़ों को श्वासनली के माध्यम से फुलाया नहीं गया था और इसके बजाय सीधे 10% फॉर्मेलिन में रखा गया था। (ग)फेफड़ों को फुलाया गया और 10% फॉर्मलिन के साथ तय किया गया लेकिन 10% फॉर्मेलिन को लगातार पूर्ण विस्तार के कारण फेफड़ों में धकेल दिया गया जिसके परिणामस्वरूप अधिक मुद्रास्फीति हुई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: प्रतिनिधि एचएंडई ने बेफिक्र और फुलाया माउस फेफड़ों का धुंधला । (A)फेफड़ों के ट्यूमर को केमिकल कार्सिनोजन यूरिथेन का इस्तेमाल कर प्रेरित किया गया । (ख)एक मानव xenografted सेल लाइन से सहज फेफड़े मेटास्टेस कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
माउस फेफड़ों के पर्फ्यूजन, मुद्रास्फीति और निर्धारण के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रिया फेफड़ों के ट्यूमर हिस्टोलॉजी और पैथोलॉजी विश्लेषण के लिए माउस फेफड़ों की त्वरित और कुशल तैयारी के लिए आदर्श है। प्रक्रिया को किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं होती है और प्रति माउस 6 मिनट से भी कम समय में किया जा सकता है। प्रक्रिया मुद्रास्फीति और न ही लगातार तरल पदार्थ के दबाव के लिए एक निश्चित मात्रा की आवश्यकता नहीं है । चूंकि यह प्रक्रिया मानकीकृत नहीं है, इसलिए फेफड़ों के स्टीरियोलॉजिकल या रूपोमेट्रिक विश्लेषण करने के इच्छुक लोगों के लिए इसकी सिफारिश नहीं की जाती है। जिन प्रक्रियाओं में इस तरह के मानकीकरण की आवश्यकता है , उन्हें बेहतर बताया गया है1,7.
इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण कदम परफ्यूजन और मुद्रास्फीति हैं। दिल के दाहिने वेंट्रिकल के माध्यम से छिद्रित करना महत्वपूर्ण है, जबकि यदि बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से पर्फ्यूजन किया जाता है, तो फेफड़े नहीं होंगे। यह बताना आसान है कि क्या पर्फ्यूजन सही ढंग से किया जाता है क्योंकि फेफड़े सफेद हो जाएंगे। श्वासनली के माध्यम से सुधारक का इन्फ्लेशन फेफड़ों की मुद्रास्फीति की अनुमति देता है, जो फेफड़ों की वास्तुकला के आसान डाउनस्ट्रीम हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण की अनुमति देता है। जैसे ही फेफड़ों का पूरी तरह से विस्तार हुआ है, फिक्सेटिव के प्रशासन को रोकना महत्वपूर्ण है, क्योंकि अधिक मुद्रास्फीति अल्वेलर दीवार टूटना और एम्फिसिमा की उपस्थिति का कारण बन सकती है। एक बार फेफड़ों फुलाया जाता है, कुछ फॉर्मेलिन श्वासनली से बाहर बैकफ्लो होगा। यह सामान्य है और डाउनस्ट्रीम हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण को प्रभावित नहीं करता है; हालांकि, अगर यह एक चिंता का विषय है श्वासनली फेफड़ों को उत्तेजित करने से पहले बांधा जा सकता है।
जबकि यह प्रोटोकॉल फेफड़ों को ठीक करने के लिए 10% बफर फॉर्मेलिन का उपयोग करता है, जो सबसे अधिक अनुशंसित फिक्सेटिव5,6है, इस सुधारक द्वारा पेश की गई कलाकृतियों की रिपोर्टें हैं, अर्थात् फेफड़ों के ऊतकों का सिकुड़ना1,8। यदि यह चिंता का विषय है, तो फेफड़ों की संरचना1के आकलन के लिए अमेरिकन थोरेसिक सोसाइटी और यूरोपियन रेस्पिरेटरी सोसाइटी के दिशानिर्देशों का पालन करें। एक अन्य संभावित सुधारक आमतौर पर अनुशंसित नहीं है लेकिन जो उपयोगी साबित हो सकता है वह है बोइन का समाधान, जो फेफड़ों की सतह नोड्यूल्स9,10के मूल्यांकन के लिए बेहतर विपरीत प्रदान कर सकता है। संक्षेप में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल ट्यूमर हिस्टोलॉजी के लिए माउस फेफड़ों के निर्धारण के लिए एक मजबूत और सरल विधि प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को नेशनल सेंटर फॉर डेवलपमेंटिंग ट्रांसलेशनल साइंसेज द्वारा पुरस्कार संख्या UL1TR003096 (एमडीई), नेशनल हार्ट, फेफड़े और रक्त संस्थान प्रीडॉक्टोरल फैलोशिप इन फेफड़ों के रोग प्रशिक्षण कार्यक्रम 5T32HL134640 (एमएलडी) के तहत समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
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