Summary
该方法旨在为小鼠肺的灌注、膨胀和固定提供一种简单高效的方法，用于检查肺肿瘤病理学和对肺转移的评价。
Abstract
评估肺组织学的能力对肺癌研究和癌症转移领域至关重要。同样重要的是，在不牺牲所采购组织质量的情况下，从研究中快速有效地进行尸检。本协议的目标是提出一种方法，快速灌注，充气，并固定小鼠肺下游的病理学分析。这种方法不能规范肺部膨胀：因此，它不需要任何特殊的程序或设备，而是简单地通过气管直接灌输固定后，通过心脏灌注。这允许充分估计肿瘤大小，病理学和评分。这也允许在肺组织固定之前收集冷冻组织。这种方法是有限的，因为它不允许以后的肺的形态定量：然而，它足以从基因工程小鼠模型（GEMM）、合成模型以及异种移植肿瘤和转移研究进行肺肿瘤分析。
Introduction
从复杂的 GEMM 到致癌素诱导模型，再到合成和异种移植模型，存在各种小鼠模型，其中癌细胞通过内脏、胸内、尾静脉或其他方法在肺内注射。所有这些模型都有着对肺病理学和病理学进行病理学评估的共同需要。因此，有必要有一个强大而快速的方法，在给肺注入时对小鼠进行尸检，以去除多余的血液，并充气和固定肺部，以清晰地可视化肺部结构。速度是这个过程的关键组成部分，因为可能需要在一个时间点从几十只小鼠身上收集肺部。此程序可以在每个鼠标不到 6 分钟内执行。
虽然这个程序是足以评估肿瘤组织学，它不建议那些谁想要执行立体学或肺部的形态测量。这种测量要求肺膨胀标准化，肺的绝对表面积、绝对体积、肺活体大小和1号的计算也是如此。这种方法对于某些成像方法也不理想。例如，通过μCT对肺部进行成像，以便进行肺活体测量分析，要求肺部保持充满空气2。当空气空间和尺寸的保存是主要关注，建议修复肺部的灌注脱水技术3，4。这种模型最大的担忧之一是肺壁破裂的可能性，减少其在肺气肿研究中的使用：然而，建议的肺部固定程序，以研究肺气肿仍然相当相似，因为它建议修复肺部，无论是通过在恒定的液体压力下10%的体温（类似于这里描述的协议）或原位固定5。
这里描述的程序的优点是，它不需要恒定的液体压力，而是充气肺，直到他们完全扩大，从而减少了手术所需的时间。这里的程序与毒理病理学学会军械库建议的方法非常相似，该协会成立了一个小组委员会，为毒理学研究推荐最佳的肺固定方法。这个小组委员会中的大多数科学家建议用注射器在体内灌输来固定肺部，尽管关于肺留在固定6中的时间有不同的建议。因此，在存在多种肺部膨胀和固定方法的同时，本文所述的方法被认为是快速膨胀和固定肺部以进行下游肿瘤病理学评估的最佳方法。
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Protocol
这里描述的所有方法都已获得伯明翰阿拉巴马大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。
1. 实验协议
- 使用批准的 IACUC 方法牺牲鼠标。在这里，我们使用了用5%异氟素麻醉的老鼠的宫颈错位。使用适当的鼠标进行研究;在这里，我们使用一个8周大的FVB鼠标
- 使用手术剪刀，在下腹部中间做一个3.5-5毫米的水平切口。接下来，将手术剪刀插入切口产生的小孔中，并垂直向上切开中心中线，直切到鼠标颈部以下。
- 用手指拉回皮肤，检查辅助淋巴结。
- 使用手术剪刀，做一个3.5毫米的横切口打开腹腔，然后切入前方向，直至胸腔底部。检查腹腔内的器官：肝脏、脾脏、肾脏等。
- 用扁平的手术剪刀，或使用钳子，移动肝脏，以暴露隔膜。检查隔膜是否肿瘤生长或转移。然后，轻轻剪断操作员右侧的隔膜，使其扩展。轻轻地从右到左切割隔膜，露出胸腔和肺部。小心不要割肺。
- 穿过左肋笼的横向极端（在操作员的右边），检查肺的左叶。
- 轻轻地将肺的右叶移开，切开右肋骨笼的横向极端，取出肋骨笼。
注意：拆除肋骨笼是可选的，虽然去除可以更清楚地看到以后的肺部膨胀。- 如果需要新鲜或冷冻的肺组织，使用造影钳夹住左叶的支气管，并在灌注前使用手术剪刀切除左肺。
- 使用钳子提起覆盖气管的组织，切掉任何多余的组织。然后轻轻切开气管内的薄组织，露出气道。
- 用手术剪刀切开肾动脉。
- 要给肺部注入活力，请使用 3 mL 注射器与 22 G 针头将 1 倍 PBS 与 10 U/mL 肝素注射到心脏的右心室中。用PBS/肝素缓慢地以大约300微升/秒的速度使肺部充满。肺经常变白。此步骤中通常使用 2.5 mL 的 PBS。
- 对于肺部膨胀，使用 3 mL 注射器与 22 G 针，这次与气管平行。将针头插入气管，注射10%的正品，流速不超过±200微升/s，直到肺部完全膨胀。一旦肺部充气，正式素会从气管中回流。将针头保持到位几秒钟，然后取款。
- （可选）在取出针头和肺部膨胀之前，使用缝合线连接气管。为此，使用 4 英寸的缝合线，用一对小钳子保持螺纹点。将螺纹放在气管的后侧，拉过，绕针转。接下来在针头周围打个过手结。拉结紧，从气管中取出针头，紧结。
- 使用钳子抬起心脏，在肺部后面插入手术剪刀，在抬起心脏以切除肺部时切割结缔组织。
- 切开心脏，将其从肺中取出。
- 将肺部贴上鼠标 ID 或学习 ID 的盒式磁带。将盒式磁带放在 10% 缓冲的正品中，固定 24-48 小时。如果需要，肺可以固定一年以上。
- 将含有肺部的盒式磁带转移到70%的乙醇中，然后进行病理学处理。
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Representative Results
上述协议允许快速灌注、通货膨胀和固定小鼠肺。下图表示每一步的重要性。 图1 描绘了H&E染色的肺部，这些肺部与PBS和肺部一起渗透，其中灌注步骤已被跳过或肺部未能正确灌注。如前所示，灌注不良的肺部的过量血液导致组织学不理想，因此很难完全观察肺部结构。 图2 既显示了通货膨胀的重要性，也显示了过度通货膨胀的危险。由于肺泡的压缩和接近，更难识别未膨胀的肺部增生区域：然而，在过度膨胀的肺部，许多肺壁已被打破，这可能被误认为肺气肿，如果不小心。 图3 描绘了肺部肿瘤病理学，这些肿瘤是使用本文描述的技术进行灌注和充气的。
图1：有代表性的H&E染色香水和非香水肺。（A） 肺与PBS一起灌注。（B） 肺不灌注。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：代表H&E染色膨胀，未膨胀，和过度膨胀的肺部。（A） 肺被充气和固定与10%的形式，直到肺完全扩大。（B） 肺没有通过气管膨胀，而是直接放入10%的正品中。（C） 肺被充气和固定与10%的形式素，但10%的甲醛不断被推入肺部超过完全膨胀，导致过度通货膨胀。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：有代表性的H&E染色香水和充气小鼠肺。（A） 肺肿瘤是使用化学致癌素尿烷诱导的。（B） 来自人类异种移植细胞系的自发肺转移 请点击这里查看此图的较大版本。
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Discussion
上述用于小鼠肺的灌注、膨胀和固定的程序是快速高效地准备小鼠肺进行肺肿瘤病理学和病理分析的理想方法。该程序不需要任何特殊设备，每只鼠标可在 6 分钟内完成。该程序不需要固定的通货膨胀量，也不要求恒定的流动压力。由于此程序不标准化，因此不建议希望对肺部进行固态或形态学分析。需要这种标准化的程序已更好地描述1，7。
该协议最关键的步骤是灌注和通货膨胀。通过心脏的右心室进行香水很重要，而如果通过左心室进行灌注，肺部不会香水。很容易判断灌注是否正确，因为肺会变白。通过气管灌输固定性允许肺部膨胀，从而更容易地对肺结构进行下游结构分析。重要的是，一旦肺部完全扩张，就停止固定管理，因为过度膨胀会导致肺壁破裂和肺气肿的出现。一旦肺部膨胀，一些正式的会从气管中回流。这是正常的，不影响下游的病理学分析：然而，如果这是一个问题，气管可以绑在切除肺之前。
虽然这个协议使用10%缓冲形式素来修复肺，这是最常见的建议固定5，6，有报告的文物引入这种固定，即肺组织收缩1，8。如果这是一个问题，按照美国胸腔学会和欧洲呼吸学会的指导方针来评估肺结构1。另一个潜在的固定不常推荐，但可能证明是有用的是Boin的解决方案，这可能提供更好的对比评价肺表面结节9，10。总之，本文描述的协议提供了一个强大和简单的方法，固定小鼠肺肿瘤病理学。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本出版物中报道的研究得到了国家促进转化科学中心的支持，奖励编号为UL1TR003096（MDE）、国家心脏、肺和血液研究所肺病培养计划5T32HL134640（MLD）的博士前研究金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
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