Summary
이 방법의 목적은 폐 종양 병리학의 검사 및 폐에 전이의 평가를 위한 마우스 폐의 관류, 인플레이션 및 고정을 위한 간단하고 효율적인 방법을 제시하는 것입니다.
Abstract
폐 장학적 연구를 평가하는 능력은 폐암 연구 및 암 전이 분야에 매우 중요합니다. 조달된 조직의 품질을 희생하지 않고 연구에서 신속하고 효율적으로 부검을 수행하는 것이 똑같이 중요합니다. 이 프로토콜의 목표는 다운스트림 조직 분석을 위해 마우스 폐를 신속하게 퍼퓨즈, 팽창 및 수정하는 방법을 제시하는 것입니다. 이 방법은 폐 인플레이션을 표준화하지 않습니다; 따라서 특별한 절차 나 장비가 필요하지 않으며 대신 단순히 심장을 통해 관류 다음 기관을 통해 직접 고정을 주입합니다. 이것은 종양 크기, 작사학 및 점수의 충분한 추정을 허용합니다. 이것은 또한 폐 조직 고정의 앞에 동결된 조직의 집합을 허용합니다. 이 방법은 폐의 나중에 형태화 를 허용하지 않는다는 점에서 제한됩니다. 그러나, 유전자 조작된 마우스 모델(GEMM), 신제모델, 이종이이식 종양 및 전이 연구에서 폐종양 분석을 하기에 충분하다.
Introduction
폐 종양 발생 및 암 전이의 다양한 마우스 모델은 복잡한 GEMM에서 발암 물질 유발 모델, 합성 및 xenograft 모델에 이르기까지 존재하며, 암세포는 심장 내, 내트라토라시, 꼬리 정맥 또는 폐 내종양을 확립하는 다른 방법을 통해 주입된다. 이 모든 모형은 폐 조직학 및 병리학의 조직학 평가를 위한 일반적인 필요를 공유합니다. 따라서, 폐를 흡수하면서 쥐의 부검을 수행하는 견고하면서도 신속한 방법이 필요하며, 폐를 팽창시키고 고정하여 폐 아키텍처를 명확하게 시각화할 필요가 있다. 속도는 단일 시점에서 수십 마리의 마우스로부터 폐를 수집해야 할 수도 있기 때문에 이 절차의 중요한 구성 요소입니다. 이 절차는 마우스 당 6 분 이내에 수행 할 수 있습니다.
이 절차는 종양 조직학을 평가하기에 충분하지만 폐의 입체학 또는 형태 측정을 수행하고자하는 사람들에게는 권장되지 않습니다. 이러한 측정은 폐의 절대 표면적, 절대 부피 및 폐포 크기 및 번호1의계산과 마찬가지로 폐 인플레이션을 표준화할 필요가 있다. 이 방법은 또한 몇몇 화상 진찰 접근에 대 한 최적이 아니다. 예를 들어, 전 생체 형태 분석을 위해 μCT를 통한 폐의 이미징은 폐가 공기2로채워져 있어야 합니다. 공기 공간과 치수의 보존이 주요 관심사인 경우, 관류 탈수 기술3,4에의해 폐를 고치는 것이 좋습니다. 이 모델의 가장 큰 관심사 중 하나는 폐포 벽의 파열에 대 한 잠재력, 폐기종의 연구에 그것의 사용을 감소; 그러나, 폐기종의 연구를 위한 폐의 고정을 위한 권장절차는 10% 포르말린(여기에 기술된 프로토콜과 유사)의 장내 주입에 의해 또는 정시 고정5에의해 폐를 고치는 것이 좋습니다.
여기서 설명된 절차의 장점은 일정한 유체 압력을 필요로 하지 않고, 완전히 팽창할 때까지 폐를 팽창시켜 시술에 필요한 시간을 감소시킨다는 것입니다. 여기서 설명된 절차는 독성학 연구를 위한 폐 고정의 가장 좋은 방법을 추천하기 위하여 소위원회가 형성된 독성병리학의 사회의 무기학에 의해 추천된 방법과 유사합니다. 이 소위원회 내의 과학자의 대다수는 폐가 고정6에남아 있던 시간에 변화한 권고가 있더라도, 주사기를 가진 장 내 주입에 의하여 폐를 고정하는 것을 추천했습니다. 따라서, 다양한 폐 인플레이션 및 고정 방법이 존재하지만, 본 원에 기재된 방법은 다운스트림 종양 조직학적 평가를 위해 폐를 신속하게 팽창시키고 고치는 최적의 방법이 될 것을 제안한다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법은 버밍엄에서 알라바마 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 실험 프로토콜
- 승인된 IACUC 방법을 사용하여 마우스를 희생합니다. 여기서는 5%의 이소플루란으로 마취된 마우스의 자궁경부 탈구를 사용했습니다. 연구에 적합한 마우스를 사용; 여기에서 는 8주 된 FVB 마우스를 사용합니다.
- 수술 가위를 사용하여 하복부 중간에 3.5-5mm 수평 절개를 합니다. 다음으로, 절개로 만든 작은 구멍에 수술 가위를 삽입하고 마우스의 목 바로 아래 중앙 중간선을 수직으로 잘라.
- 손가락으로 피부를 다시 당기고 축산 림프절을 검사합니다.
- 외과 가위를 사용하여 3.5mm 측면 절개를 하여 복강을 열고 흉부 바닥까지 전방 방향으로 자른다. 간, 비장, 신장 등 복강기관의 장기검사를 한다.
- 수술 가위의 평평한 또는 집게를 사용하여 간을 움직여 다이어프램을 노출시합니다. 종양 성장 또는 전이에 대한 다이어프램을 검사합니다. 그런 다음 작업자의 오른쪽에 있는 다이어프램을 부드럽게 잘라서 확장합니다. 흉부 구멍과 폐를 노출시키기 위해 횡격막을 오른쪽에서 왼쪽으로 부드럽게 자릅니다. 폐를 자르지 않도록 주의하십시오.
- 왼쪽 늑골 케이지(작업자의 오른쪽)의 측면 극단을 잘라 폐의 왼쪽 엽을 검사합니다.
- 폐의 오른쪽 엽을 부드럽게 움직이며 오른쪽 갈비뼈 케이지의 측면 극단을 잘라 내고 흉곽을 제거합니다.
참고: 제거는 나중에 폐 인플레이션을 명확하게 볼 수 있지만, 흉곽의 제거는 선택 사항입니다.- 신선하거나 냉동된 폐 조직이 필요한 경우, 후면 집게를 사용하여 왼쪽 엽의 기관지를 고정하고 관류 전에 외과 가위를 사용하여 왼쪽 폐를 절제하십시오.
- 집게를 사용하여 기관진을 덮는 조직을 들어 올리고 과도한 조직을 잘라냅니다. 그런 다음 기관지 안감의 얇은 조직을 부드럽게 잘라 기도를 노출시합니다.
- 외과 가위로 신장 동맥을 잘라냅니다.
- 폐를 견딜 수 있도록 22G 바늘이 달린 3mL 주사기를 사용하여 심장의 오른쪽 심실로 10 개의 U /mL 헤파린이있는 1 x PBS를 주입하십시오. PBS/헤파린으로 약 300 μL/s의 폐를 천천히 침투합니다. 폐는 자주 하얗게 변합니다. PBS의 2.5 mL은 일반적으로이 단계에서 사용된다.
- 폐 인플레이션의 경우, 22 G 바늘로 3mL 주사기를 사용하시며, 이번에는 기관지와 평행하게 유지됩니다. 바늘을 기관체에 삽입하고 폐가 완전히 팽창 할 때까지 - 200 μL / s보다 큰 흐름의 속도로 10 %의 포르말린을 주입하십시오. 폐가 팽창되면 포르말린이 기관에서 흘러 나올 것입니다. 바늘을 몇 초 더 제자리에 고정한 다음 철회하십시오.
- (선택 사항) 바늘과 폐 인플레이션을 철회하기 전에 봉합사실을 사용하여 기관지를 묶습니다. 이를 위해 작은 한 쌍의 집게로 스레드의 점을 잡고 있는 4인치 의 봉합사 스레드를 사용합니다. 기관지의 등쪽 에 실을 놓고 당겨 바늘 주위에 루프를 만듭니다. 다음으로 바늘 주위에 오버핸드 매듭을 만듭니다. 매듭을 단단히 당기고, 기관지에서 바늘을 제거하고, 매듭을 닫습니다.
- 집게를 사용하여 심장을 들어 올리고, 폐 바로 뒤에 수술 가위를 삽입하고, 폐를 절제하기 위해 심장을 들어 올리는 동안 결합 조직을 잘라냅니다.
- 폐에서 제거하는 심장을 잘라.
- 폐에 마우스 ID 또는 연구 ID로 표시된 카세트를 배치합니다. 카세트를 10% 버퍼링된 포르말린에 놓고 24-48h를 수정합니다. 폐는 원하는 경우 1 년 이상 고정에 남아있을 수 있습니다.
- 폐를 함유한 카세트를 70%에탄올로 옮기고 히스토로지 처리를 진행한다.
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Representative Results
위의 프로토콜은 마우스 폐의 빠른 관류, 인플레이션 및 고정을 허용합니다. 아래 그림은 각 단계의 중요성을 나타냅니다. 그림 1은 관류 단계가 건너뛰거나 폐가 올바르게 침투하지 못한 PBS 및 폐와 함께 퍼진 H&E 염색 폐를 묘사합니다. 표시된 바와 같이, 제대로 퍼진 폐에 있는 과잉 혈액은 이상적인 히스토로지 보다는 적게 생성하고 완전히 폐 건축을 관찰하는 것을 어렵게 만들 수 있습니다. 그림 2는 인플레이션의 중요성과 과다 인플레이션의 위험성을 모두 보여줍니다. 폐포의 압축 및 근접성으로 인해 팽창되지 않은 폐에서 증식 부위를 식별하는 것이 더 어렵습니다. 그러나, 과팽창 폐에서, 폐포 벽의 많은 깨진 되었습니다 그리고 이 조심 하지 않을 경우 폐기종에 대 한 오해 될 수 있습니다. 도 3은 본원에 기재된 기술을 사용하여 침투및 팽창된 폐의 종양 장학적학을 묘사한다.
그림 1: Perfused 및 불응성 폐의 대표적인 H&E 염색. (A)PBS가 침투한 폐. (B)폐가 침투하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 팽창, 팽창 해제 및 과팽창폐의 대표적인 H&E 염색. (A)폐는 폐가 완전히 팽창할 때까지 10%의 포르말린으로 팽창및 고정되었다. (B)폐는 기관을 통해 팽창되지 않고 대신 10% 포르말린에 직접 배치하였다. (C)폐는 10%의 포르말린으로 팽창및 고정되었지만, 10%의 포르말린은 과도하게 팽창하는 결과로 전체 팽창을 지나 폐로 지속적으로 밀려났다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마우스 폐가 침투되고 팽창된 사람의 대표적인 H&E 염색. (A)폐종양은 화학발암물질 우레탄을 사용하여 유도하였다. (B)인간 이종이접힌 세포주로부터의 자발적인 폐 전이는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
마우스 폐의 관류, 인플레이션 및 고정을 위해 위에서 설명한 절차는 폐 종양 조직학 및 병리학 분석을 위한 마우스 폐의 빠르고 효율적인 준비에 이상적입니다. 절차는 특별한 장비를 필요로하지 않으며 마우스 당 6 분 이내에 수행 할 수 있습니다. 이 절차는 인플레이션또는 일정한 유체 압력에 대한 고정 된 볼륨을 필요로하지 않습니다. 이 절차는 표준화되지 않기 때문에 폐의 입체적 또는 형태학적 분석을 수행하고자하는 사람들에게는 권장되지 않습니다. 이러한 표준화가 필요한 절차는1,7을더 잘 설명했습니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 관류와 인플레이션입니다. 좌심실을 통해 관류가 이루어지는 반면, 심장의 오른쪽 심실을 통해 퍼퓨즈하는 것이 중요합니다. 폐가 하얗게 변하기 때문에 관류가 올바르게 수행되었는지 쉽게 알 수 있습니다. 기관진을 통한 고정화를 주입하면 폐 구조의 강하 조직 학적 분석이 용이하도록 폐의 인플레이션이 허용됩니다. 과잉 인플레이션이 폐포 벽 파손및 폐기종의 출현을 일으킬 수 있기 때문에 폐가 완전히 확장되는 즉시 고정 투여를 중단하는 것이 중요합니다. 폐가 팽창되면 일부 포르말린은 기관에서 역류합니다. 이것은 정상이며 다운스트림 조직학 분석에 영향을 미치지 않습니다. 그러나, 이것이 우려되는 경우에 기관체는 폐를 절제하기 전에 묶일 수 있습니다.
이 프로토콜은 10% 완충 된 포르말린을 사용하여 폐를 고치기 위해 가장 일반적으로 권장되는 고정5,6,폐 조직의 고정, 즉 수축에 의해 도입 된 유물의 보고가 있습니다1,8. 이것이 우려되는 경우에, 폐 구조물의 평가를 위한 미국 흉부 학회 및 유럽 호흡기 학회의 지침에 따라1. 다른 잠재적 인 고정은 일반적으로 권장하지 않지만 유용 할 수 있습니다 그 유용 할 수 있습니다 부인의 용액, 이는 폐 표면 결절9의평가를위한 더 나은 대조를 제공 할 수 있습니다9,10. 요약하자면, 본명 설명된 프로토콜은 종양 조직학을 위한 마우스 폐의 고정을 위한 견고하고 간단한 방법을 제공한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 간행물에 보고된 연구는 수여번호 UL1TR003096 (MDE), 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 전 박사 과정 5T32HL134640 (MLD)에 따라 번역 과학 을 발전시키기위한 국립 센터에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
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