Summary
Bu yöntemin amacı, akciğer tümörü patolojisinin incelenmesi ve akciğere metastazların değerlendirilmesi için fare akciğerlerinin perfüzyonu, enflasyonu ve fiksasyonu için basit ve verimli bir yöntem sunmaktır.
Abstract
Akciğer histolojisini değerlendirme yeteneği akciğer kanseri araştırmaları ve kanser metastazı alanları için kritik öneme sahiptir. Temin edilen dokuların kalitesinden ödün vermeden çalışmalardan hızlı ve verimli bir şekilde nekropsi yapılması da aynı derecede önemlidir. Bu protokolün amacı, aşağı akış histolojik analizi için fare akciğerlerini hızla boğmak, şişirmek ve düzeltmek için bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem akciğer enflasyonuna standardize etmez; bu nedenle, herhangi bir özel prosedür veya ekipman gerektirmez ve bunun yerine kalpten perfüzyonu takiben doğrudan trakea yoluyla fiksatif aşılar. Bu, tümör büyüklüğü, histolojisi ve puanlamasının yeterli tahminini sağlar. Bu aynı zamanda akciğer dokusu fiksasyonundan önce donmuş dokunun toplanmasına izin verir. Bu yöntem, akciğerin daha sonra morfometrik niceliğine izin vermediği için sınırlıdır; ancak genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM'ler), singeneik modellerin yanı sıra ksinograft tümör ve metastaz çalışmalarından akciğer tümörü analizi için fazlasıyla yeterlidir.
Introduction
Akciğer onkogenezi ve akciğere kanser metastazının çeşitli fare modelleri, karmaşık GEMM'lerden kanserojen kaynaklı modellere, kanser hücrelerinin intrakardiyak, intratorasik, kuyruk damarı veya akciğer içinde tümör oluşturmak için diğer yöntemlerle enjekte edildiği singeneik ve ksinograft modellerine kadar çeşitli vardır. Tüm bu modeller akciğer histolojisi ve patolojisinin histolojik değerlendirmesi için ortak ihtiyacı paylaşsa. Bu nedenle, fazla kanı çıkarmak için akciğerlere perfüzyon yaparken farelerin nekropsilerini yapmak ve akciğer mimarisini net bir şekilde görselleştirmek için akciğerleri şişirmek ve sabitlemek için sağlam ama hızlı bir yönteme sahip olmak gerekir. Hız, akciğerleri tek bir zaman noktasında düzinelerce fareden toplamak gerekebileceğinden, bu prosedürün kritik bir bileşenidir. Bu yordam fare başına 6 dakikadan daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir.
Bu işlem tümör histolojisini değerlendirmek için fazlasıyla yeterli olmakla birlikte, akciğerlerin stereoloji veya morfometrik ölçümlerini yapmak isteyenler için önerilmez. Bu tür ölçümler, akciğerin mutlak yüzey alanının, mutlak hacminin ve alveolar boyutunun ve1sayısının hesaplanmasında olduğu gibi akciğer enflasyonunun standartlaştırılmasını gerektirir. Bu yöntem bazı görüntüleme yaklaşımları için de en uygun değildir. Örneğin, ex vivo morfometrik analiz için akciğerlerin μCT ile görüntülenmesi, akciğerlerin hava2ile dolu kalmasını gerektirir. Hava alanlarının ve boyutlarının korunması birincil endişe kaynağı olduğunda, akciğerlerin perfüzyon dehidrasyon teknikleri ile düzeltilmesi önerilir3,4. Bu modelin en büyük endişelerinden biri, amfizem çalışmalarında kullanımını azaltarak alveolar duvarların yırtılma potansiyelidir; bununla birlikte, amfizem çalışması için akciğerlerin sabitlenmesi için önerilen prosedür hala oldukça benzerdir, çünkü akciğerlerin sürekli sıvı basıncı altında % 10 formalin intratraseral aşılama (burada açıklanan protokole benzer) veya yerinde fiksasyon5ile sabitlenmesi önerilir.
Burada açıklanan prosedürün avantajı, sürekli sıvı basıncı gerektirmemesi, bunun yerine akciğerleri tamamen genişleyene kadar şişirmesi ve böylece işlem için gereken süreyi azaltmasıdır. Burada açıklanan prosedür, toksikoloji çalışmaları için en iyi akciğer fiksasyon yöntemlerini önermek için bir alt komitenin oluşturulduğu Toksikoloji Patoloji Derneği'nin bir silahlanma armamentariumunun önerdiği yöntemlere yakından benzemektedir. Bu alt komitedeki bilim adamlarının çoğunluğu, akciğerin fiksatif6'dabırakıldığı zaman farklı öneriler olmasına rağmen, akciğerlerin bir şırınna ile intratrakial aşılama ile sabitlenmesini önerdi. Bu nedenle, akciğer şişirme ve fiksasyon çeşitli yöntemler mevcut iken, burada açıklanan yöntem hızlı bir şekilde şişirmek ve downstream tümör histolojik değerlendirme için akciğerleri düzeltmek için en uygun yöntem olarak önerilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Birmingham'daki Alabama Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Deneysel protokol
- Onaylı bir IACUC yöntemi kullanarak fareyi feda edin. Burada% 5 izofluran ile uyuşturulan bir farenin servikal çıkığı kullandık. Çalışma için uygun bir fare kullanın; Burada, 8 haftalık bir FVB fare kullanıyoruz
- Cerrahi makas kullanarak, alt karın ortasında 3,5-5 mm yatay bir kesi yapın. Daha sonra, kesiden oluşturulan küçük deliğe cerrahi makas yerleştirin ve orta orta çizgiyi farenin boynunun hemen altına dikey olarak kesin.
- Cildi parmaklarla geri çekin ve aksiller lenf düğümlerini inceleyin.
- Cerrahi makas kullanarak, karın boşluğunu açmak için 3,5 mm yanal kesi yapın ve ardından ön yönde toraksın dibine kadar kesin. Karın boşluğundaki organları inceleyin: karaciğer, dalak, böbrekler vb.
- Cerrahi makasın düzlüğünde veya tokmak kullanarak, diyaframı açığa çıkarmak için karaciğeri hareket ettirin. Diyaframı tümör büyümesi veya metastazları için inceleyin. Ardından, operatörün sağ tarafındaki diyaframı hafifçe kırparak genişlemesini sağlar. Torasik boşluğu ve akciğerleri açığa çıkarmak için diyaframı sağdan sola doğru yavaşça kesin. Akciğerleri kesmemeye dikkat edin.
- Akciğerlerin sol lobunun incelenmesi için sol göğüs kafesinin lateral aşırı (operatörün sağında) kesilmiştir.
- Akciğerin sağ loblarını yavaşça hareket ettirin ve sağ göğüs kafesinin yanal aşırısını kesin ve göğüs kafesini çıkarın.
NOT: Göğüs kafesinin çıkarılması isteğe bağlıdır, ancak çıkarılması daha sonraki akciğer enflasyonunun daha net görülmesini sağlar.- Taze veya donmuş akciğer dokusu gerekiyorsa, sol lobun bronşlarını sıkıştırmak için hemostat tokadı kullanın ve perfüzyondan önce cerrahi makas kullanarak sol akciğeri resect.
- Nefes nefesini kaplayan dokuyu kaldırmak için tokmakları kullanmak, fazla dokuları kesmek. Daha sonra solunum yolunu açığa çıkarmak için nefes borusuna astarlı ince dokuyu hafifçe kesin.
- Böbrek atardamarını cerrahi makasla kesin.
- Akciğerleri boğmak için, kalbin sağ ventrikülüne 10 U/mL heparin ile 1x PBS enjekte etmek için 22 G iğneli 3 mL şırınga kullanın. PBS/heparin ile akciğerleri yaklaşık 300 μL/s'de yavaşça perfuse edin. Akciğerler sık sık beyaza döner. Bu adımda genellikle 2,5 mL PBS kullanılır.
- Akciğer şişirme için, bu kez nefes borusuna paralel tutulan 22 G iğneli 3 mL şırınga kullanın. İğneyi nefes borusuna yerleştirin ve akciğerler tamamen şişirilene kadar ~200 μL/sn'den büyük olmayan akış hızıyla% 10 formalin enjekte edin. Akciğerler şişirildikten sonra formalin nefes borusundan geri akacak. İğneyi birkaç saniye daha yerinde tutun ve geri çekin.
- (İsteğe bağlı) İğne ve akciğer şişirme geri çekilmeden önce, nefes borusu bağlamak için dikiş ipliği kullanın. Bunu başarmak için, ipliğin noktasını küçük bir çift asa ile tutan 4 inç dikiş ipliği kullanın. İpliği nefes borusunun dorsal tarafına yerleştirin ve iğnenin etrafında bir halka yapmak için çekin. Sonra iğnenin etrafında bir el düğümü yapın. Düğümü sıkıca çekin, iğneyi nefes borusundan çıkarın, düğümü kapatın.
- Kalbi kaldırmak için tokmak kullanın, doğrudan akciğerlerin arkasına cerrahi makas yerleştirin ve kalbi akciğerleri resect etmek için kaldırırken bağ dokusunu kesin.
- Kalbi kesip akciğerlerden alın.
- Akciğerlere fare kimliği veya çalışma kimliği ile etiketlenmiş bir kaset yerleştirin. Akciğerler istenirse bir yıldan fazla bir süre sabitlenebilir.
- Akciğerleri içeren kaseti% 70 etanol'e aktarın ve histoloji için işlemeye devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki protokol, fare akciğerlerinin hızlı perfüzyonunu, enflasyonuna ve sabitlenmesine izin verir. Aşağıda gösterilen rakamlar her adımın önemini temsil eder. Şekil 1' de PBS ile perfüzyona uğramış H&E lekeli akciğerler ve perfüzyon adımının atladığı veya akciğerlerin doğru şekilde perfüzyona maruz kalmadığı akciğerler tasvir edilmiştir. Gösterildiği gibi, zayıf perfüzyonlu akciğerlerdeki fazla kan ideal histolojiden daha az oluşturur ve akciğer mimarisini tam olarak gözlemlemeyi zorlaştırır. Şekil 2 hem enflasyonun önemini hem de aşırı enflasyonun tehlikelerini göstermektedir. Alveollerin sıkışması ve yakınlığı nedeniyle şişirilmemiş akciğerlerde hiperplazi alanlarını tanımlamak daha zordur; bununla birlikte, aşırı şişirilmiş akciğerlerde, alveolar duvarların çoğu kırılmıştır ve dikkatli değilse bu amfizem ile karıştırılabilir. Şekil 3'te burada açıklanan teknik kullanılarak perfüzyona maruz kalan ve şişirilen akciğerlerdeki tümör histolojisi tasvir edilmiştir.
Şekil 1: Perfüzyonlu ve perfüzyonsuz akciğerlerin temsili H&E lekesi. (A) PBS ile perfüzyona maruz akciğerler. (B) Akciğerler perfüzyona maruz değildir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Şişirilmiş, şişirilmemiş ve aşırı şişirilmiş akciğerlerin temsili H&E lekesi. (A) Akciğerler tamamen genişleyene kadar %10 formalin ile şişirildi ve sabitlendi. (B) Akciğerler trakeadan şişirilmedi ve bunun yerine doğrudan% 10 formalin içine yerleştirildi. (C) Akciğerler % 10 formalin ile şişirildi ve sabitlendi, ancak% 10 formalin sürekli olarak tam genişlemeden geçerek akciğerlere itildi ve bu da aşırı enflasyonla sonuçlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Perfüzyonlu ve şişirilmiş fare akciğerlerinin temsili H&E lekesi. (A) Akciğer tümörleri kimyasal kanserojen üretan kullanılarak indüklendi. (B) İnsan ksinografted hücre hattından spontan akciğer metastazları Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare akciğerlerinin perfüzyonu, enflasyonu ve fiksasyonu için yukarıda açıklanan prosedür, akciğer tümörü histolojisi ve patoloji analizi için fare akciğerlerinin hızlı ve verimli bir şekilde hazırlanması için idealdir. Prosedür herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve fare başına 6 dakikadan daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Prosedür, enflasyon veya sabit sıvı basıncı için sabit bir hacim gerektirmez. Bu işlem standart hale getirmediği için akciğerin stereolojik veya morfometrik analizlerini yapmak isteyenler için önerilmez. Bu tür standardizasyonun gerekli olduğu prosedürler daha iyi tanımlanmıştır1,7.
Bu protokolün en kritik adımları perfüzyon ve enflasyondur. Kalbin sağ ventrikülünden perfüzyon yapmak önemlidir, oysa perfüzyon sol ventrikülden yapılırsa akciğerler perfüzyon yapmaz. Akciğerler beyazlayacağı için perfüzyonun doğru yapılıp yapılmadığını söylemek kolaydır. Trakea yoluyla fiksatifin aşılanması, akciğer mimarisinin daha kolay aşağı akış histolojik analizini sağlayan akciğerlerin enflasyonuna izin verir. Aşırı enflasyon alveolar duvar kırılmasına ve amfizem görünümüne neden olabileceğinden, akciğerler tamamen genişler genişlemez fiksatifin yönetimini durdurmak önemlidir. Akciğerler şişirildikten sonra, bazı formalinler nefes borusundan geri akacak. Bu normaldir ve aşağı akış histolojik analizini etkilemez; ancak, bu bir endişe ise, nefes borusu akciğerleri çıkarmadan önce bağlanabilir.
Bu protokol akciğerleri düzeltmek için% 10 tamponlu formalin kullanırken, en sık önerilen fiksatif5,6, bu fiksatif, yani akciğer dokusunun büzülmesi tarafından tanıtılan eserler raporlarıvardır 1,8. Bu bir endişe ise, akciğer yapısının değerlendirilmesi için Amerikan Toraks Derneği ve Avrupa Solunum Derneği'nin yönergelerine uyun1. Yaygın olarak tavsiye edilmeyen ancak yararlı olabilecek bir başka potansiyel fiksatif bouin çözeltisi, akciğer yüzey nodüllerinin değerlendirilmesi için daha iyi kontrast sağlayabilir9,10. Özetle, burada açıklanan protokol, tümör histolojisi için fare akciğerlerinin sabitlenmesi için sağlam ve basit bir yöntem sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ul1TR003096 (MDE), Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Akciğer Hastalıkları Eğitim Programı 5T32HL134640 (MLD) ödül numarası altında Ulusal Çeviri Bilimleri İlerleyen Merkez tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography. Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).
- Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. Lung fixation for the preservation of air spaces. Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).
- Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions. Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species. American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).
- Edmonds, M. D., et al. MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).
- Zhao, K., et al. Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways. PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).
