Summary
여기에 제시된 보디피 493/503, 지질 방울 특이적 형광 염료를 사용하여 드로소필라 유충에서 에노세포의 해종 및 지질 방울 염색에 대한 상세한 방법이 제시되어 있다.
Abstract
지질은 동물 발달과 생리적 항상성에 필수적입니다. 지질 대사의 dysregulation는 각종 발달 결함 및 질병, 비만 및 지방 간 과 같은 귀착됩니다. 일반적으로 지질은 세포의 다기능 지질 저장 소기관인 지질 방울에 저장됩니다. 지질 방울 크기와 다른 조직에서 다른 조건에서 수 다양. 지질 방울은 그것의 생발생 및 저하의 규제를 통해 단단히 통제 되는 보고 되었습니다. Drosophila melanogaster에서,oenocyte는 지질 물질 대사를 위한 중요한 조직이고 최근 스트레스에 응하여 지질 동원에 관하여 인간 간 유사체로 확인되었습니다. 그러나, oenocytes에 있는 지질 물방울 물질 대사의 규칙의 밑에 기계장치는 애매하게 남아 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 개발 중 및 스트레스 조건 하에서 지질 방울 동적 변화를 직접 시각화하는 신뢰할 수 있고 민감한 방법을 개발하는 것이 가장 중요합니다. 여기에 설명된 지질 방울 특이적 형광 염료인 친유성 BODIPY 493/503을 활용하면 기아에 대한 반응으로 드로소필라 유충의 선혈구에서 해부 및 후속 지질 방울 염색에 대한 상세한 프로토콜이 설명되어 있다. 이것은 공초점 현미경 검사법에 의하여 각종 조건 의 밑에 지질 작은 물방울 역학의 질적인 분석을 허용합니다. 또한, 이 신속 하 고 높은 재현 가능한 방법은 또한 oenocytes 및 다른 조직에 지질 방울 대사를 포함 하는 새로운 유전 요인을 식별 하기 위한 유전 화면에서 사용할 수 있습니다.
Introduction
지질은 세포 생존에 필수적입니다. 세포막 시스템의 필수 구성 요소로서의 전통적인 역할 외에도 지질은 또한 개별 동물의 수명 주기 전반에 걸쳐 에너지 공급 및 신호 변환에 중요한 기능을 합니다1. 따라서 지질 대사는 세포에서 생리적 지혈을 유지하기 위해 엄격한 규정을 준수해야합니다. 지질 대사의 조절은 당뇨병이나 지방간 과 같은 다양한 질병을 초래하는 것으로 알려져 있다. 동물 건강에 지질 대사의 큰 중요성에도 불구 하 고, 지질 물질 대사 규칙 기본 메커니즘 크게 알 수 없는 남아.
초파리는 토마스 H. 모건 교수가 유전학 및 기타 기본적인 생물학적 질문을 포함하는 연구에서 그들을 사용하기 시작한 이후 년 동안 광범위하게 사용되어왔다2. 지난 수십 년 동안, 새로운 증거는 Drosophila가 비만1,3과같은 많은 지질 물질 대사 관련 질병의 연구에서 우수한 모델 유기체임을 보여주었습니다. 특히, Drosophila는 인간과 고도로 보존된 신진 대사 유전자를 공유하고 지질 물질 대사를 위한 유사한 관련 조직/기관 및 세포 모형을 소유합니다.
예를 들어, 트리 아 실 글리세라이드 저장에 대 한 책임은 Drosophila의지방 체, 인간의 지방 조직과 유사한 기능. 최근, 인간 간과 기능성 유사체로 보고된 전문 간세포형 세포(즉, 에노세포)의 클러스터는 과일 파리에서 지방산 및 탄화수소 대사에 관여하는 것으로 나타났다4,5. 포유류 간에서와 유사하게, oenocytes는 애벌레와 성인 Drosophila둘 다에 있는 지질 방울 대형을 활성화해서 기아에 반응합니다, oenocytes에 있는 지질 방울 축적의 결과로4,6,7,8. 해부학적으로, oenocytes는 복부 hemisegment 당 대략 6개의 세포의 클러스터에 있는 측방 표피의 기저 내부 표면에 단단히 붙어, 이는 표피에서 oenocyte 군집을 격리하는 것을 실행 불가능하게 합니다. 따라서, oenocytes는 해부 및 염색 도중 표피에 부착되어야 합니다.
지질은 세포9의단층 막을 가진 세포기관인 지질 방울의 형태로 저장됩니다. 지질 방울은 다른 종에 걸쳐 거의 모든 세포 유형에 존재10. 지질 방울 역학, 그것의 크기와 수를 포함 하 여, 환경 스트레스에 대 한 응답에서 변경. 이는 노화및기아와같은 스트레스에 반응하여 대사 상태를 반영한 것으로7,8. 따라서, 개발 중 및 스트레스 조건 하에서 oenocytes에서 지질 방울 역학을 질적으로 결정하는 실현 가능하고 신뢰할 수있는 방법을 개발하는 것이 매우 중요합니다. 특히, 제3 인스타 유충에서, oenocytes는 공급 조건 하에서 검출 가능한 지질 방울을 거의 또는 전혀 함유하지 않지만, 영양 부족 후 수많은 큰 지질 방울을 함유한다4. 이 방법의 효과를 확인하기 위해, 굶주린 조건하에서 에노 세포에서 지질 방울 염색을 수행하는 것이 좋습니다.
현재, 몇몇 친유성 염료는 불형색 염료 수단 블랙 및 오일 레드 O 및 형광 염료 나일 레드 및 BODIPY 493/50311과같은 지질 방울 염색에 사용할 수 있다. 수단 블랙과 오일 레드 O는 일반적으로 조직 콜레스테릴 에스테르와 트리 아실 글리세롤에 사용되며 가벼운 현미경 검사법에 의해 쉽게 검출 될 수있다. 그러나, 상대적으로 높은 배경 염색 및 상대적으로 낮은 해상도는 지질 액적 역학의 질적 분석에서 그것의 응용에 대한 두 가지 제한 요인이다. 비형광 염료의 한계를 극복하기 위해 나일 레드와 BODIPY 493/503은 지질 방울 염색을 위한 이상적인 대체품으로 활용됩니다. 나일 레드는 또한 BODIPY 493/503 세포 지질 방울에 대 한 더 구체적인 염료를 만드는 일부 unesterified 콜레스테롤을 감지할 수 있다 보고되었습니다.,어느 정도12,13,14.
무엇보다도, 이 프로토콜은 oenocytes에 있는 지질 방울의 신속하고 민감한 분석에 대한 필요를 충족하기 위하여, 얼룩 염료로 BODIPY 493/503를 사용하여 고착성 지질 방울 특정 염색의 실현 가능하고 고도로 재현 가능한 방법을 제시합니다. 이 보고에서는, oenocytes는 해부되고, BODIPY 493/503는 공초점 현미경 검사법에 의해 지질 방울이 검출되는 oenocytes에 있는 지질 작은 물방울 염색을 위해 이용됩니다. 이 절차의 용이성과 경제성은 유세포 측정과 같은 다른 응용 분야에서 수정 및 추가 사용에 이상적입니다.
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Protocol
1. 계란 누워
- 계란 누워 표준 옥수수 가루 음식을 준비합니다.
참고: 여기에서 사용되는 표준 옥수수 가루 식품에 대한 조리법 및 조리 절차는 이전에 게시 된 세부사항 15를참조하십시오. - 50 mL 원심 튜브에 활성 건조 효모 4g에 증류수 6 mL을 추가하여 신선한 효모 페이스트를 준비합니다. 주걱을 사용하여 섞어서 페이스트를 만듭니다.
- 옥수수 가루 음식을 병에 채우고 약 1 g의 효모 페이스트를 주걱으로 옥수수 가루 음식의 표면에 펴서 계란 누워 병을 만듭니다.
- 원하는 유전자형의 파리를 계란 누워 병에 놓고 25 ° C의 일정한 온도와 60 %의 습도로 인큐베이터에 놓습니다.
참고: 이상적인 십자가는 일반적으로 150 처녀 파리와 적어도 75 남성으로 구성되어 있습니다. 계란 누워 병 위에 방대한 상자를 배치하여 어두운 파리를 유지하는 것은 재생 속도를 증가시킬 것이다. - 계란 수집 하기 전에, 파리 여성 난관에 저장 남아 있는 모든 오래 된 계란의 제거를 허용 하기 위해 1 시간 동안 계란을 낳을 수 있습니다.
- 파리가 1 시간 동안 새로운 계란 누워 병에 계란을 낳고 병에서 성인을 제거하자.
참고: 계란 누워 시간을 제어하여 정확하게 제어된 발달 단계 내에서 애벌레를 얻기 위해 발달 범위를 최소화한다. - 계란이 12 h/12 h의 빛/어두운 주기로 25°C에서 인큐베이터에서 세 번째 인스타 애벌레로 84시간 동안 발달하도록 허용합니다.
2. 애벌레에 대한 기아 치료
참고: 위에서 언급한 바와 같이, 제3의 instar 애벌레에서는, 정상적인 수유 조건 하에서 에노세포에서 검출 가능한 지질 방울이 거의 없거나 전혀 없지만, 수많은 큰 지질 방울은 기아와 같은 스트레스 조건 하에서 에노세포에서 유도될 수 있다. 이 방법을 추가로 확인하려면 이러한 유충을 퇴각하여 에노세포에서 지질 방울 생물 발생을 유도할 필요가 있습니다. 여기서, 12 시간, 24 시간 및 36 시간의 기아 시간 코스가 패러다임으로 선택되었습니다. 특히, 짧은 기간의 기아(예를 들어, 3시간)는 에노세포에서 검출 가능한 지질 방울을 유도하기에 충분하다. 기아 기간은 특정 실험 목표 및 설정에 따라 다를 수 있습니다.
- 기아 및 제어 치료를위한 챔버를 확인합니다.
- 기아 처리 챔버의 경우: 6cm 페트리 접시에 적절한 크기의 필터 페이퍼를 놓고 PBS 1 mL을 필터 용지에 놓습니다.
- 제어 처리 챔버: 페트리 접시에 블루밍턴 표준 옥수수 가루 식품 5 mL을 배치합니다.
- 주걱을 사용하여 여전히 음식에 잠복하고있는 애벌레가 들어있는 음식의 상단 층을 부드럽게 파고 PBS 5 mL로 채워진 페트리 접시로 옮습니다. PBS에서 애벌레를 부드럽게 저어서 애벌레의 음식 오염을 제거하고 가능한 한 깨끗하게 만듭니다.
- 작은 페인트 브러시를 사용하여 동일한 대략적인 크기의 40세 instar 애벌레를 수집합니다. 기아 또는 제어 챔버로 무작위로 정렬, 와 함께 20 애벌레 각.
- 챔버를 60% 습도로 25°C에서 인큐베이터에 놓고 12시간, 24시간 및 36시간 처리를 위한 개발을 허용합니다.
참고: 기아 챔버의 애벌레의 경우, 애벌레 탈수를 피하기 위해 12 시간마다 PBS 1 mL을 추가하십시오.
3. 에노세포 해부
- 작은 페인트 브러시를 사용하여 적절한 연령 (12 시간, 24 시간 또는 치료 후 36 시간)의 애벌레를 선택한 다음 5 mL의 얼음 차가운 PBS로 채워진 새로운 페트리 접시로 옮기십시오.
참고: 대조군실에서 애벌레를 다룰 때 2.2단계를 반복하여 식품 오염을 제거한다. - 얼음으로 차가운 PBS로 해부 판을 채우고 집게를 사용하여 유충을 해부 판으로 부드럽게 옮니다. 해부판을 스테레오 현미경 으로 넣어 다음 해부 단계를 진행한다.
참고: 얼음 차가운 온도는 유충의 움직임을 느리게하고 해부를 용이하게하는 데 도움이됩니다. - 애벌레 복부 쪽을 위로 돌리고 등쪽쪽을 아래로 돌리고 집게를 사용하여 제자리에 부드럽게 잡습니다. 전방 끝에 인두를 가두어 해부 핀을 배치하고 후부 끝에 있는 첨탑을 통해 다른 핀을 배치하여 해부 판에 애벌레를 고정시다.
참고: 등쪽 은 기관의 등쪽 트렁크의 존재에 의해 가장 쉽게 식별됩니다. - Vannas 스프링 가위를 사용하여 앞쪽에서 후방 끝까지 표피를 통해 (세로로) 절개하십시오.
- 집게를 사용하여 표피의 내부 조직을 제거하십시오.
참고: 표피의 내부 표면에 국한되어있는 세포에 손상을 피하기 위해 기관 가지를 제거 할 때주의해야합니다. - 집게를 사용하면 해부 핀을 회수하고 표피를 얼음 위에 PBS로 채워진 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 제거합니다.
- 위에서 설명한 절차에 따라 다른 애벌레를 계속 해부하십시오.
4. 지질 방울 염색
- 해부된 표피를 고정 버퍼에 인큐베이션하여 로터상에서 실온(RT)에서 30분 동안 배양한다.
참고: 고정 버퍼는 PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유하고 있다. - 고정 버퍼를 제거한 다음 빠른 세척을 수행합니다. 빠른 세척을 수행하려면, PFA의 제거 후 튜브에 RT에서 PBS의 1 mL을 추가, 부드럽게 조직을 다시 일시 중단, 그리고 PBS를 폐기.
주의 사항: 고정 버퍼에는 인간의 건강에 유해한 PFA가 포함되어 있습니다. 고정 버퍼를 유해 폐기물로 올바르게 폐기하는 것이 중요합니다. - PBS로 샘플을 3x 5분 동안 세척하여 가능한 모든 PFA 잔류물을 세척합니다.
- BODIPY 493/503 (1 μg/mL; 재료 표참조)로 표피를 회전자에서 RT에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 이 단계부터 미세 원심 분리튜브를 알루미늄 호일로 감싸서 시료를 빛으로부터 보호하고 가능한 광 표백을 최소화합니다. - BODIPY 493/503 염색 용액을 제거하고 샘플을 PBS로 각각 10분 동안 3x 세척하여 잔류 염료를 완전히 제거합니다.
5. 장착 및 이미징
- 깨끗한 현미경 슬라이드에 장착 매체 6 μL을 놓습니다.
참고: 마운팅 매체는 안티페이드 특성에 따라 더 긴 검출 시간에 사용됩니다. - 집게를 사용하여 표피 하나를 집어 들고 닦아 잔여 PBS를 부드럽게 제거하십시오.
- 표피를 마운팅 매체에 놓고 방향을 조정하여 에노시테를 포함하는 내부 표면이 바닥에 있고 외부 표면이 맨 위에 있도록 합니다.
- 표지슬립을 표피에 부드럽게 놓습니다.
참고: 필요한 경우 덮개 슬립 아래에서 누출되는 여분의 장착 매체를 닦아냅니다. 이미징을 용이하게 하기 위해 포셉으로 커버슬립을 부드럽게 밀어 현미경을 통해 슬라이드를 관찰할 때, 에노시테 클러스터를 하나의 평면에서 쉽게 이미지화할 수 있습니다. 양자택일로, 조직을 장착할 때 전체 표피의 압연을 피하기 위하여 중간 선을 통해서 2개의 반 표피로 표피를 잘라내는 것이 실행가능합니다. - 밀봉 커버 슬립의 가장자리 주위에 명확한 매니큐어를 적용합니다.
- 슬라이드를 내광 성 샘플 상자에 넣고 매니큐어가 RT에서 건조되도록하여 5-10 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 현미경 분석을 진행합니다. 공초점 현미경(최적화된 GFP 또는 FITC 필터 설정으로 63배 배율, 여기 = 488nm, 방출 = 503nm)을 사용하여 이미지를 사용하여 극한의 배경을 사용하여 깨끗하고 민감한 신호를 수집합니다.
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Representative Results
이 절차의 성공적인 실행은 oenocytes에 있는 지질 작은 물방울의 수 그리고 크기를 드러내는 명확한 지질 작은 물방울 얼룩 귀착될 것입니다. 그림 1A,A',A''는 다른 발달 단계 동안 정상적인 먹이 유충의 oenocytes에 검출 가능한 지질 방울 (녹색 점)이 거의 없다는 것을 보여줍니다. 도 1B, B', B'는 12h(B), 24h(B'), 및 36시간(B') 기아 기간에 반응하여 에노세포에서 지질 방울(녹색 점)의 양을 증가시다. 96 시간 후, 먹이 애벌레 (A) oenocytes에 일부 지질 방울 축적을 표시 하는 것 같았다 주목 해야 한다, 그들의 빠른 성장 속도 때문일 수 있습니다. 연구원은이 단계 도중 애벌레를 취급할 때 증가한 주의를 지불해야 합니다.
그림 1: 지질 방울 염색의 대표적인 이미지. 이미지는 BODIPY 493/503을 사용하여 드로소필라 유충의 호질구에서 개발 및 기아의 시간 과정을 통해 표시됩니다. (A,A',A'') 지질 방울 염색 (녹색 점) 공급 유충에 oenocytes 클러스터의 대표적인 이미지의. (B, B', B'') 지질 방울 염색 (녹색 점) 후 oenocytes 클러스터의 대표적인 이미지에 12 시간 (B), 24 h (B'), 그리고 36 시간 (B') 기아의 기간, 84 h의 나이와 유충에서 시작. 모든 이미지는 동일한 배율로 촬영되었습니다. 배율 표시줄 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
위에서 설명한 것 중에는 이 프로토콜에 몇 가지 중요한 단계가 있으며, 계란 누워 기간은 이들 중 하나입니다. 지질 동원 조직으로서, 에노세포는 영양 상태에 매우 민감하다6,8. 장기간 계란 누워 기간 까마귀 애벌레 와 증가 식품 경쟁 귀 착될 수 있습니다., 부정확 한 결과 선도. 이 프로토콜에 사용되는 1 시간 계란 누워 기간은 유충이 영양 경쟁없이 개발할 수 있습니다. 더 긴 계란 누워 기간에서 유래할 수 있는 애벌레의 훨씬 더 큰 수는 또한 지질 물방울 양 및 패턴 (예를 들면, 크기, 수 및 형태학)에 eenocytes에 영향을 미칠 수 있습니다.
추가적으로, 연장된 계란 누워 기간은 또한 발달 단계의 넓은 변이를 가진 애벌레 인구에서 유래합니다. 이 맥락에서, 연구원은 배아 또는 애벌레 발달에 영향을 미치는 돌연변이를 사용할 때 주의해야 한다, 지질 방울 패턴에 미치는 영향은 발달 결함의 이차 효과에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에. 시간 과정 절차는 지질 방울이 초기 세 번째 instar 애벌레 (84 h)에서 늦은 세 번째 instar 애벌레 (120 h)에 개발 하는 동안 공급 조건 oenocytes에서 거의 검출 되지 않습니다 제안. 또한 성인의 호박색소침착과 달리 애벌레 에노세포는 무색5. 따라서, 특히 주변 조직 (즉, 기관 가지)을 제거 할 때, oenocyte 해부 중에 주의를 기울여야합니다. 또한, 지질 방울은 트리톤 X-1009와같은 세제에 민감한 단층 막 소기관입니다. 따라서 이 프로토콜에 사용된 버퍼에 세제가 포함되어 있지 않은지 확인하는 것이 중요합니다.
위에서 언급 한 바와 같이, 초파리 및 기타 종에서 지질 방울 양과 패턴 변화를 결정하는 데 사용되는 여러 염료가 있습니다. 이 중, BODIPY 493/503은 다른 형광(예를 들어, 나일 레드) 또는 비형광 염료(예를 들어, 오일 레드 O)에 비해 지질 액적 특이적 염색에 가장 적합할 수 있다; 하지만, 더 소설과 고급 염료가 개발되고있다. 예를 들어, LipidSpot 488 및 그 파생 은 세포 막 및 기타 세포기관의 최소한의 배경 염색으로 새로 개발 된 형광 염료 시리즈입니다. 그들은16,17이필요한 세척 단계없이 살아있는 세포와 고정 된 세포 모두에서 지질 방울의 신속한 염색을 허용합니다. 이 지질 방울 염색 프로토콜의 제한은 지질 방울 크기, 수 및 형태학의 정성적 평가에 잘 작동하더라도 세포의 지방 매장량을 정량적으로 측정하는 데 최적이 아니라는 것입니다.
이 방법은 에노세포의 지질 방울 염색 이외에, 조직 해부 및 절편7동안 경미한 변형으로 애벌레(즉, 근육, 지방체 및 장 조직)의 다른 조직에도 적용될 수 있다. 또한,이 방법은 성인 조직의 지질 방울 염색에도 잘 작동7. 이 방법의 변형된 버전은 항체로 염색하는 면역조직화학과 함께 광범위한 응용분야로 확장될 수 있다. 이 경우 고정 된 조직은 기존의 세제 대신 사포닌 (0.1 % 30 분 동안 RT)으로 침투하여 항체로 배양하여 혈장 막을 가로 질러 항체의 교차및 지질 액적 무결성유지를 용이하게합니다8.
요약하면, 이 프로토콜은 특정 유전 적 또는 환경 조작이 지질 방울 양과 패턴 (즉, 크기, 수 및 형태)의 질적 변화를 유발하는지 여부를 조사할 수있는 가능한 방법을 제공합니다. 어려운 작업 과 비싼 장비 및 재료.
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Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 사업은 중국 국립자연과학재단(31671422, 31529004, 31601112), 111프로젝트(D18010), 광동펄강 인재프로그램(2017BT01S155) 및 중국 박사 후 과학 재단 (2018M640767).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
References
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