Summary
Микромасштабный термофорез быстро получает константы связывания при низких материальных затратах. Микромасштабный термофорез без маркировки или этикетки коммерчески доступен; однако термофорез без меток не способен к разнообразию измерений взаимодействия, которые могут быть выполнены с использованием флуоресцентных этикеток. Мы предоставляем протокол для маркировки измерений термофореза.
Abstract
Способность определять сродство связывания липидов с белками является неотъемлемой частью понимания белково-липидных взаимодействий в мембранном трафике, сигнальной трансдукции и цитоскелетном ремоделировании. Классические инструменты для измерения таких взаимодействий включают поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и изотермическую титрационную калориметрию (ITC). Несмотря на то, что эти подходы являются мощными инструментами, они имеют недостатки. ITC требует большого количества очищенного белка, а также липидов, которые могут быть дорогостоящими и трудными в производстве. Кроме того, ЦМТ, а также ОСП отнимают очень много времени, что может значительно увеличить стоимость проведения этих экспериментов. Одним из способов обойти эти ограничения является использование относительно новой техники микромасштабного термофореза (MST). MST является быстрым и экономически эффективным с использованием небольших количеств образца для получения кривой насыщения для данного события связывания. В настоящее время существует два типа систем MST. Один тип MST требует маркировки флуорофором в синем или красном спектре. Вторая система опирается на внутреннюю флуоресценцию ароматических аминокислот в УФ-диапазоне. Обе системы обнаруживают движение молекул в ответ на локализованную индукцию тепла от инфракрасного лазера. Каждый подход имеет свои преимущества и недостатки. MST без меток может использовать непомеченные нативные белки; однако многие аналиты, включая фармацевтические препараты, флуоресцируют в УФ-диапазоне, что может мешать определению точных значений КД. Для сравнения, меченый MST обеспечивает большее разнообразие измеримых парных взаимодействий с использованием флуоресцентно меченых зондов, прикрепленных к лигандам с измеримыми поглощениями в видимом диапазоне, в отличие от ультрафиолета, ограничивая потенциал для мешающих сигналов от аналитов.
Introduction
Микромасштабный термофорез является относительно новым методом определения констант диссоциации (KD), а также констант ингибирования (IC50) между биохимически значимыми лигандами. Ведущий коммерческий ритейлер MST (например, NanoTemper) предлагает две популярные технологии MST: 1) MST без маркировки, требующей флуоресцентной метки, и 2) меченый термофорез с использованием присущей флуоресценции белков в зависимости от количества ароматических остатков, присутствующих в каждом белке1. Недостатком термофореза без меток является то, что в большинстве случаев он не позволяет измерить белково-белковые взаимодействия. Тем не менее, может быть возможно спроектировать белки без ароматических аминокислот, таких как триптофан, для использования в термофорезе без меток2.
MST измеряет движение частиц в ответ на индукцию микроскопических температурных полей, инициированных инфракрасным лазером в доступных в настоящее время технологиях1. MST может быть использован для измерения белково-белковых взаимодействий, белково-липидных взаимодействий, белково-малых молекул, экспериментов с конкуренцией и даже взаимодействий между малыми молекулами, если можно произвести достаточное разделение сигналов. Кроме того, MST позволяет измерять взаимодействия на основе мембранных белков, встроенные либо в липосомы, либо в нанодиски. Меченый термофорез использует преимущества использования флуоресцентно меченых меток, позволяющих химически контролируемое разделение сигнала между лигандом и анализируемым веществом. Значения KD могут быть получены с помощью термофореза для взаимодействий, включающих связывание белка при низких наномолярных концентрациях, что в большинстве случаев является гораздо более низкой концентрацией белка, чем то, что требуется для изотермической калориметрии (ITC)3. Кроме того, MST не имеет строгих требований к буферизации, как это требуется для поверхностного плазмонного резонанса (SPR)4, и меченый термофорез может даже использоваться для измерения констант связывания интересующих белков из неполно очищенных белковых растворов5 с генетически вставленными флуоресцентными метками6. Недостатком MST является то, что кинетические параметры не могут быть легко получены для MST, как в SPR2.
Измерения термофореза зависят от локальной разницы температур раствора. Это тепло может генерироваться инфракрасным лазером. Устройство MST имеет флуоресцентный детектор, соединенный с инфракрасным (ИК) лучом, и может улавливать изменения флуоресценции от локальных изменений концентрации флуоресцентных молекул в точке, куда нацелен ИК-лазер. Устройство MST использует ИК-направленный лазер, связанный непосредственно с флуоресцентным детектором, сфокусированным в той же точке, в которой тепло генерируется в растворе. Это позволяет надежно обнаруживать изменения температуры, соответствующие истощению молекул в точке тепла, генерируемого ИК-лазером. Измеренная флуоресценция обычно уменьшается ближе к ИК-лазеру в ответ на повышение температуры. Различия, измеренные в результате, могут быть обусловлены несколькими факторами, включая заряд, размер или энтропию сольватации. Эти различия измеряются как изменения флуоресценции в ответ на индукцию тепла или движение молекул из горячих в более холодные части капилляра.
При загрузке капилляра данным раствором важно оставлять воздух на обоих концах капилляра и не нагружать капилляр полностью. Коммерческий капилляр содержит около 10 мкл раствора. Можно достичь точных измерений с 5 мкл раствора до тех пор, пока раствор манипулируется к центру капилляра, нет пузырьков воздуха (потенциально дегаз перед загрузкой капилляра), и кто-то осторожно загружает стойку, чтобы не толкать раствор из центра капилляра, куда нацелен инфракрасный лазер. Если лазер не вступает в полный контакт с раствором, результатом, скорее всего, будет один из трех непригодных для использования выходов для этой концентрации: 1) обнаружение отсутствия или низкой флуоресценции, 2) обнаружение более высокой флуоресценции (потенциально с зубчатым пиком) или 3) обнаружение флуоресценции в пределах других значений от заданного титрования, но с зубчатым и неокругленным пиком.
Для маркированного термофореза оптимально иметь флуоресцентный сигнал выше 200 и ниже 2000 единиц флуоресценции7. Устройство MST использует диапазон интенсивности светодиодов от 0 до 100, которые могут быть выбраны для достижения сигнала выше 200 или ниже 2000. Альтернативно, можно использовать различные концентрации меченого лиганда для модификации флуоресцентного сигнала до оптимального уровня. При анализе данных важно запускать сканирование колпачка с заданным измерением MST в качестве эталона, так как сканирование плохого колпачка часто может привести к точке, которая впоследствии может быть определена как выброс. Каждый запуск должен занимать около 30 минут при измерении одной мощности MST с помощью сканирования колпачка. Коммерческие устройства позволяют изменять мощность MST. В старых версиях программного обеспечения это может быть установлено от 0 до 100; а в более поздних версиях можно выбрать низкий, средний или высокий MST. Чтобы достичь надежных следов, исследователю может потребоваться попробовать каждый из них и решить, какая настройка MST приводит к наиболее надежным данным для данного взаимодействия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка материалов
- Приготовьте фосфатный буферный физиологический раствор (PBS): 137 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ NaH2PO4 и 2 мМ KH2PO4, рН 7,41.
- Готовят краситель NTA-Atto 647 N. Разбавляйте раствор NTA-Atto 647 N до 100 нМ из 100% раствора ДМСО в PBS без анимации движения.
- Экспресс Vam7-His8 – Белок в виде белка слияния в кишечной палочке и очистки с помощью Ni-NTA и размерно-эксклюзионной хроматографии8.
- Титруйте анализируемый элемент в буфере PBS. Если анализируемый элемент находится в другом буфере, меченый MST не особенно чувствителен к незначительным различиям буфера от молекул, таких как DMSO, если только содержимое буфера аналита не взаимодействует с меченым белком.
2. Подготовка прибора MST
- Включите выключатель питания на задней панели устройства.
- Откройте управляющее программное обеспечение и убедитесь, что ноутбук включен и подключен к компьютеру, подключенному к устройству.
- Введите параметры флуоресценции и MST для этого эксперимента. Установите значение MST Before на 3 с, MST на 30 с и восстановление флуоресценции (Fluo.) через 1 с. Перед измерениями начальная флуоресценция и не требует длительного времени; MST - это фактическое количество времени для достижения равновесия после индукции тепла.
- Таблица капилляров: Для каждой капиллярной трубки введите название мишени (лиганда), название лиганда (анализируемого вещества), концентрацию мишени и самую высокую концентрацию титрования и используйте коэффициент титрования автозаполнения. Например, введите 50 нМ для целевой концентрации Vam7-His8, Vam7-His8 для целевого названия, (1,2-диоктаноилфосфатидная кислота) Di-C8 PA для названия лиганда, а самую высокую концентрацию лиганд выбирает 1:1 и перетаскивает вниз к автозаполнению щелей 2-16.
- Запустите Сканирование колпачка , чтобы выбрать подходящий светодиод (20% светодиод (предустановленный)) на основе сигнала целевого белка и настроить от 200 до 2000 флуоресцентных блоков для меченого MST. Сканирование колпачков должно показывать однородные округлые колоколообразные пики.
- Выберите диапазон мощностей MST и введите значения для каждого из них, чтобы проверить наиболее прочную посадку привязки, и нажмите Start Cap Scan + Measurement, сканируя различные значения, чтобы определить наилучшие условия работы для данного тестируемого взаимодействия.
- Определите мощность MST с наилучшим соответствием с помощью программного обеспечения для анализа и предустановки для термофореза с помощью Tjump. Анализируйте соответствия в соответствии с большинством флуоресцентных разделений между самой низкой и самой высокой концентрацией по сравнению с мощностью MST с наилучшим соответствием и выберите мощность MST для повторных испытаний.
- Определите, произошло ли фотоотбеливание между первым и вторым запуском, перейдя к программному обеспечению для анализа и переключив анализ в экспертный режим. Затем выберите флуоресценцию вместо термофореза для анализа. Выберите экспертный режим, а затем фотоотбеливание.
3. Подготовка образцов для маркированного MST
- Доведите раствор Vam7-His8 до концентрации 200 нМ в PBS без анимации движения.
- Доведите краситель NTA-Atto 647 до 100 нМ в PBS без анимации движения.
- Смешайте краситель Vam7-His8 и NTA-Atto 647 в объемном соотношении 1:1 и дайте постоять при комнатной температуре, закрытой от света в течение 30 минут. Определить соответствующую концентрацию белка-мишени, как показано в разделе 2.5 (см. Дополнение об использовании КД красителя Ni-NTA, как показано на видео).
- Центрифужная смесь красителя NTA-Atto 647 N и белка в течение 10 мин в темном помещении с использованием настольной центрифуги весом приблизительно 8,161 х г.
- Храните смесь при 4 °C после эксперимента или на льду во время эксперимента для повторного использования в течение нескольких часов, если это необходимо, чтобы сохранить белок от денатурации.
- Используйте искатель концентраций NT для определения диапазона концентраций, необходимых для титрования.
- Доведите Di-C8 PA до соответствующей максимальной концентрации в воде.
- Титруйте анализируемый материал, используя последовательное разбавление 1:1 в буфере PBS для 16 концентраций на основе предыдущей стадии. В отличие от SPR, термофорез не так чувствителен к буферным различиям.
4. MST образцов
- Включите устройство и подключенный ноутбук.
- Нажмите стрелку вверх на передней панели машины и выдвиньте капиллярную стойку.
- Нагружайте капилляры в стойку с наибольшей концентрацией в положении 1.
- В управляющем программном обеспечении выберите Красный канал, соответствующий NTA-Atto 647 N.
- Введите информацию о концентрации, положении и названии каждого капилляра в Таблицу капилляров.
- Запустите сканирование капилляров, нажав Start Cap Scan на 20% светодиода (предустановленный) и настройте в соответствии с 200-2000 флуоресцентными единицами, используя либо настройки интенсивности светодиодов, либо концентрацию лиганда (меченого белка).
- Выберите диапазон мощности MST.
- Запустите сканирование колпачка + измерение MST.
- Анализ с помощью аналитического программного обеспечения.
5. Анализ данных MST
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа, предоставляемое Nanotemper, является проприетарным и выполняется с использованием M.O. Affinity Analysis. Существуют различные способы измерения сродства связывания на основе флуоресценции или термофореза. Новые версии этого программного обеспечения предустановлены для автоматической оценки данных с помощью термофореза и предустановлены для использования термофореза с Tjump, использующим преимущества обоих измерений. В качестве альтернативы можно выбрать либо только Tjump, либо только термофорез. Кроме того, аналитическое программное обеспечение позволяет проводить оценочные измерения аффинности с использованием начальной флуоресценции. Доступ к этим настройкам можно получить только в экспертном режиме.
- Установите стратегию оценки в аналитическом программном обеспечении expert, щелкнув поле молнии рядом с набором данных на экране Выбор данных. Программное обеспечение для анализа предустановлено для анализа в MST Analysis; однако исследователь может выбрать «Создать новый анализ» и выбрать «Начальный флуоресцентный анализ», чтобы оценить сродство связывания на основе начальной флуоресценции. Экспертный режим также доступен для начальной флуоресценции. В анализе, описанном ниже, термофорез и Tjump были использованы для определения KD представленного Vam7-His8 с его естественным субстратом, липидной фосфатидной кислотой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Это пример выходных данных с использованием аффинити-анализа. Меченый MST использовался для определения константы связывания Vam7-His8 с растворимым диоктаноилом (DiC8) PA одного из его природных субстратов9. На рисунке 1 представлены термофоретические следы одного испытания титрования DiC8 PA 1:1, начиная с 500 мкМ против 50 нМ Vam7-His8. Показаны начальная флуоресценция (время до включения инфракрасного лазера), Tjump (время первоначально после включения инфракрасного лазера) и термофорез (как только частицы достигают равновесия с температурой). Можно вычислить KD только из любого из этих измерений или использовать комбинацию Tjump и термофореза, учитывая два из этих измерений.
На рисунке 2 показана кривая насыщения для термофореза с выходом Tjump из аналитического программного обеспечения. Как показано на рисунке 2, кривая насыщения может быть построена на основе этих результатов; однако может быть трудно вычислить кривую насыщения, так как Fnorm не начинается с нуля. Чтобы обойти эту проблему, данные могут быть нормализованы вручную, или выходные данные могут быть установлены на дробную границу, определенную программным обеспечением для анализа. Как правило, результаты MST определяются с помощью логарифмической шкалы, как показано на рисунке 3. Аналитическое программное обеспечение автоматически учитывает концентрацию белка для определения сродства связывания путем выбора модели KD и ввода концентрации белка. Модель Хилла в аналитическом программном обеспечении также может быть использована, которая не учитывает концентрацию белка, но потенциально может дать меру кооперативности для данного взаимодействия. Экспортируя либо выходные данные из аналитического программного обеспечения, и создавая графики в стороннем программном обеспечении, можно получить измерение KD, как показано на рисунке 3. Следует отметить, что критическая концентрация мицелл (CMC) диоктаноилглицерофосфолипидов составляет >3 мМ, что указывает на то, что эти эксперименты работают намного ниже CMC10.
Рисунок 1: MST следы от Vam7-His8 до DiC8 PA. Показаны следы анализируемого ПА к NTA-Atto 647N меченому лиганду Vam7-His8, измеренному в красном канале. Первоначальную флуоресценцию измеряли при комнатной температуре в течение 5 с (А) до включения инфракрасного лазера. Tjump (B) измеряется в первые секунды после индукции тепла от встроенного инфракрасного лазера и измеряет различия флуоресценции, присутствующие при первом включении ИК-лазера перед измерением термофоретического движения частиц. Термофорез (C) измеряется после того, как молекулы уравновешиваются от движения, индуцированного теплом от инфракрасного лазера из-за термофоретических различий движения из-за таких факторов, как размер, заряд, энтропия сольватации или конформационное изменение частицы, измеряемое по отношению к титруемому анализируемому анализируемому веществу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Привязка насыщения, определяемая по экспортированным результатам MST с помощью стороннего программного обеспечения. Нормализованные результаты флуоресценции экспортируются из аналитического программного обеспечения. Данные были экспортированы и построены с использованием модели привязки, специфичной для одного сайта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Связывание сходства Vam7-His8 с DiC8 PA с помощью сигмоидальной модели. Анализ экспортированных данных с рисунка 1, экспортированных из аналитического программного обеспечения с использованием нормализации Fnorm [%]. Взятие журнала концентраций DiC8 PA, построенных против Fnorm с использованием Graphpad Prism v.7 с использованием модели Sigmoidal, 4PL, X is log(концентрация), позволяет получить соответствие, которое приводит к KD 89 ± 18,0 мкМ для сродства связывания Vam7-His8 к DiC8 PA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Определение привязки Vam7-His8 к DiC8-PA обеспечило надежный установленный KD для данного взаимодействия, который несколько ниже сродства, чем измеренный KD липосом Vam7-His8 к PA (неопубликованный). Это различие, скорее всего, связано с отсутствием мембраны, что обычно приводит к более низкому сродству к мембранно-специфическим липидсвязывающим взаимодействиям и, следовательно, демонстрирует роль каркаса мембранной липосомы к этому взаимодействию11.
Чтобы дополнительно определить силу данных MST, исследователю необходимо изучить как форму следов на рисунке 1, так и отделение следов от выбранного метода анализа. Глядя на следы из рисунка 1, большинство концентраций привели к четкому следу, определяемому выравниванием термофорезной части кривой. В некоторых случаях следы, соответствующие реакциям, содержащим более высокие концентрации анализируемого вещества к концу флуоресцентного измерения, могут быть обусловлены агрегацией в прилипании образца к капиллярам образца, которая может быть устранена путем добавления одного или обоих Pluronic или Tween к буферу12. Однако моющие средства, подобные этим, могут не подходить для белково-липидных взаимодействий13. Чтобы проверить неспецифическое связывание для этого типа белково-липидного взаимодействия, можно добавить BSA, увеличить концентрацию соли или использовать глицерин в буфере и проверить, влияет ли это на расчетный KD14,15.
Разделение определяется разницей во Фнорме между самым высоким и самым низким измерением концентрации для данного взаимодействия. Как показано на фиг.2, разделение для этого взаимодействия составляло приблизительно 75 единиц флуоресценции. Вообще говоря, разделение не менее 5 единиц флуоресценции должно быть достигнуто, чтобы уверенно полагаться на данные MST неизвестных измерений химического сродства. Если надежное соответствие KD достигается при несколько более низком разделении, можно было бы по-прежнему рассматривать такие данные, если бы они соответствовали измерениям сродства, используемым с помощью другого метода, такого как SPR или ITC.
Поскольку некоторые из термофоретических следов показали некоторую липкость в образце, выход, выбранный для рисунка 3, представлял собой комбинацию термофореза с Tjump. Этот параметр является предварительно выбранным параметром в большинстве более поздних версий аналитического программного обеспечения. Рисунок 3 указывает на надежное соответствие модели сродства сигмоидального связывания, поскольку наблюдалось четкое насыщение при титровании 12 точек 1:1. Устройство позволяет брать 16 точек в заданном прогоне, и многие взаимодействия требуют всех этих точек для достижения сильного измерения сродства связывания. Чтобы достичь большей уверенности, это испытание должно быть повторено с новыми капиллярами два или более раз, требующих в общей сложности 36 капиллярных трубок для этого эксперимента. Кроме того, можно попробовать другой метод, такой как SPR, чтобы подтвердить эти данные, чтобы обеспечить надежную отчетность констант аффинности, как мы делали ранее8,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом Национального научного фонда (MCB 1818310) RAF. Эта работа была частично поддержана Центром химической биологии ядра / Отделом кристаллографии белка в Онкологическом центре Х. Ли Моффитта (NIH / NCI: P30-CA076292).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
| Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |
References
- Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
- Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, nP. Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains. Gene. 163 (1), 1-11 (1995).
- Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100 (2010).
- Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).
- Starr, M. L., et al. Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).
- Miner, G. L., et al. The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain. Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models. Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).
- Zhao, H., Lappalainen, P. A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions. Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).
- Kaufmann, S. H. Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents. Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).
- le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
- Corradi, V., et al.
- Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective. SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).
- Sparks, R. P., et al. A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion. Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).
