Anvendelse af mikroskala termoforese til måling af protein-lipid interaktioner

Summary

Mikroskala termoforese opnår bindingskonstanter hurtigt til lave materialeomkostninger. Enten mærket eller etiketfri mikroskala termoforese er kommercielt tilgængelig; etiketfri termoforese er imidlertid ikke i stand til mangfoldigheden af interaktionsmålinger, der kan udføres ved hjælp af fluorescerende etiketter. Vi leverer en protokol til mærkede termoforesemålinger.

Abstract

Evnen til at bestemme lipidernes bindingsaffinitet til proteiner er en væsentlig del af forståelsen af protein-lipidinteraktioner i membranhandel, signaltransduktion og cytoskeletal ombygning. Klassiske værktøjer til måling af sådanne interaktioner omfatter overfladeplasmonresonans (SPR) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC). Selvom de er kraftfulde værktøjer, har disse tilgange tilbageslag. ITC kræver store mængder oprenset protein samt lipider, som kan være dyre og vanskelige at producere. Desuden er ITC såvel som SPR meget tidskrævende, hvilket kan øge omkostningerne ved at udføre disse eksperimenter betydeligt. En måde at omgå disse begrænsninger på er at bruge den relativt nye teknik til mikroskala termoforese (MST). MST er hurtig og omkostningseffektiv ved hjælp af små mængder prøve for at opnå en mætningskurve for en given bindingshændelse. Der findes i øjeblikket to typer MST-systemer. En type MST kræver mærkning med en fluorofor i det blå eller røde spektrum. Det andet system er afhængigt af den iboende fluorescens af aromatiske aminosyrer i UV-området. Begge systemer registrerer molekylernes bevægelse som reaktion på lokaliseret induktion af varme fra en infrarød laser. Hver tilgang har sine fordele og ulemper. Etiketfri MST kan bruge umærkede indfødte proteiner; imidlertid fluorescerer mange analytter, herunder lægemidler, i UV-området, hvilket kan forstyrre bestemmelsen af nøjagtige _KD-værdier. Til sammenligning giver mærket MST mulighed for en større mangfoldighed af målbare parvise interaktioner ved hjælp af fluorescerende mærkede sonder fastgjort til ligander med målbare absorbanser i det synlige område i modsætning til UV, hvilket begrænser potentialet for interfererende signaler fra analytter.

Introduction

Mikroskala termoforese er en relativt ny teknik til bestemmelse af disassociationskonstanter (KD) samt hæmningskonstanter (_IC50) mellem biokemisk relevante ligander. Den førende kommercielle forhandler af MST (f.eks. NanoTemper) tilbyder to populære MST-teknologier: 1) Etiketfri MST, der kræver et fluorescerende mærke, og 2) mærket termoforese ved hjælp af den iboende fluorescens af proteiner afhængigt af antallet af aromatiske rester, der er til stede i ^{hvert protein1}. En ulempe ved etiketfri termoforese er, at det i de fleste tilfælde ikke tillader måling af protein-protein-interaktioner. Det kan dog være muligt at konstruere proteiner uden aromatiske aminosyrer såsom tryptofan til brug i etiketfri termoforese2.

MST måler partiklernes bevægelse som reaktion på induktion af mikroskopiske temperaturfelter initieret af en infrarød laser i aktuelt tilgængelige ^teknologier1. MST kan bruges til at måle protein-protein-interaktioner, protein-lipid-interaktioner, protein-lille molekyle, konkurrenceeksperimenter og endda interaktioner mellem små molekyler, så længe man kan producere nok signalseparation. Derudover giver MST mulighed for måling af membran-proteinbaserede interaktioner indlejret i enten liposomer eller nanodiscs. Mærket termoforese drager fordel af brugen af fluorescerende mærkede mærker, der muliggør kemisk kontrollerbar adskillelse af signal mellem ligand og analyt. KD-værdier kan opnås ved anvendelse af termoforese til interaktioner, der involverer proteinbinding ved lave nanomolære koncentrationer, hvilket i de fleste tilfælde er en meget lavere koncentration af protein end det, der kræves til isotermisk kalorimetri (ITC)³. Derudover har MST ikke strenge bufferkrav som krævet for overfladeplasmonresonans (SPR)⁴, og mærket termoforese kan endda bruges til at måle bindingskonstanter af proteiner af interesse fra ikke-fuldt oprensede proteinopløsninger5 med genetisk indsatte fluorescerende ^tags6. En ulempe ved MST er, at kinetiske parametre ikke let kan opnås for MST som i ^SPR2.

Termoforesemålinger afhænger af den lokale temperaturforskel i en opløsning. Denne varme kan genereres fra en infrarød laser. MST-enheden har en fluorescensdetektor koblet til en infrarød (IR) stråle og kan opfange ændringer i fluorescens fra lokale koncentrationsændringer af de fluorescerende molekyler på det punkt, hvor IR-laseren er målrettet. MST-enheden anvender en IR-målrettet laser koblet direkte til en fluorescensdetektor fokuseret på samme punkt, hvor varmen genereres i opløsningen. Dette muliggør robust detektion af temperaturændringer svarende til udtømning af molekyler ved det varmepunkt, der genereres af IR-laseren. Målt fluorescens falder generelt tættere på IR-laseren som reaktion på temperaturstigninger. Forskellene målt som følge heraf kan skyldes flere faktorer, herunder ladning, størrelse eller opløsningsentropi. Disse forskelle måles som ændringer i fluorescens som reaktion på induktion af varme eller bevægelse af molekyler fra varme til koldere dele af kapillæren.

Når du lægger en kapillær med en given opløsning, er det vigtigt at forlade luft i hver ende af kapillæren og ikke indlæse kapillæren helt fuld. Den kommercielle kapillær rummer ca. 10 μL opløsning. Man kan opnå nøjagtige målinger med 5 μL opløsning, så længe opløsningen manipuleres til midten af kapillæren, der er ingen luftbobler (potentielt afgasning inden ilægning af kapillær), og man er forsigtig med at indlæse stativet for ikke at skubbe opløsningen fra midten af kapillæren, hvor den infrarøde laser er målrettet. Hvis laseren ikke kommer i fuld kontakt med opløsningen, vil resultatet højst sandsynligt være et af tre ubrugelige udgange for denne koncentration: 1) ingen eller lav fluorescensdetektion, 2) højere fluorescensdetektion (potentielt med hakket top) eller 3) fluorescensdetektion inden for andre værdier fra given titrering, men med en hakket og uafrundet top.

For mærket termoforese er det optimalt at have et fluorescenssignal over 200 og under 2000 fluorescensenheder7. MST-enheden bruger en række LED-intensiteter fra 0 til 100, som kan vælges for at opnå et signal over 200 eller under 2000. Alternativt kan man bruge forskellige koncentrationer af den mærkede ligand til at ændre fluorescenssignalet til et optimalt niveau. Det er vigtigt at køre en cap-scanning med en given MST-måling som reference, når man analyserer data, da en dårlig cap-scanning ofte kan resultere i et punkt, der senere kan bestemmes at være en outlier. Hver kørsel skal tage ca. 30 minutter, hvis man måler en enkelt MST-effekt med en hættescanning. De kommercielle enheder tillader ændringer i MST-strøm. I ældre softwareversioner kan dette indstilles fra 0 til 100; og i senere versioner kan man vælge lav, medium eller høj MST. For at opnå robuste spor kan det være nødvendigt for en forsker at prøve hver af disse og beslutte, hvilken MST-indstilling der resulterer i de mest robuste data for en given interaktion.

Protocol

1. Forberedelse af materialer

1. Forbered fosfatbufret saltvand (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM _NaH2PO4 og 2 mM _KH2PO4, pH 7,41.
2. Forbered NTA-Atto 647 N farvestof. Fortynd lager NTA-Atto 647 N farvestof til 100 nM fra en 100% DMSO-opløsning til PBS uden Tween.
3. Express Vam7-His8 – Protein som fusionsprotein i E. coli og oprens ved hjælp af Ni-NTA og størrelsesudelukkelseskromatografi8.
4. Titrer analytten i PBS-buffer. Hvis analytten er i en anden buffer, er mærket MST ikke særlig følsom over for mindre bufferforskelle fra molekyler som DMSO, medmindre indholdet af analytbuffer interagerer med mærket protein.

2. Klargøring af MST-udstyret

1. Tænd for afbryderen på bagsiden af enheden.
2. Åbn kontrolsoftwaren, og sørg for, at den bærbare computer er tændt og i tilsluttet status på computeren, der er tilsluttet enheden.
3. Indtast fluorescens- og MST-indstillinger for dette eksperiment. Indstil MST Before til 3 s, MST på 30 s og Fluorescence recovery (Fluo.) efter 1 s. Før måler indledende fluorescens og kræver ikke lange tider; MST er den faktiske tid, hvor ligevægt kan nås efter varmeinduktion.
4. Tabel over kapillærer: For hvert kapillarrør skal du indtaste navnet på målet (ligand), navnet på liganden (analytten), koncentrationen af målet og den højeste titreringskoncentration og anvende autofyldningstitreringsforholdet. Indtast f.eks. 50 nM for målkoncentrationen af Vam7-His8, Vam7-His8 for målnavn, (1,2-dioctanoylphosphatidsyre) Di-C8 PA for ligandnavn og den højeste koncentration liganden, der vælger 1:1 og trækker ned til autofyldningsspor 2-16.
5. Kør en Cap Scan for at vælge den relevante LED (20% LED (forudindstillet)) baseret på signalet fra målproteinet, og juster mellem 200 og 2000 fluorescensenheder for mærket MST. Cap Scans skal vise ensartede afrundede klokkeformede toppe.
6. Vælg en række MST-kræfter, og indtast værdier for hver for at teste for den mest robuste bindingstilpasning, og tryk på Start Cap Scan + Measurement, og scan forskellige værdier for at bestemme de bedste driftsbetingelser for en given interaktion, der testes.
7. Bestem MST-effekten med den bedste pasform ved hjælp af analysesoftwaren og forudindstillingen til termoforese med Tjump. Analysér tilpasninger i henhold til de fleste fluorescensadskillelser mellem laveste og højeste koncentration sammenlignet med MST-effekten med den bedste pasform, og vælg MST-effekten til replikatforsøg.
8. Find ud af, om fotobleaching har fundet sted mellem første og anden kørsel ved at gå til analysesoftwaren og skifte analysen til eksperttilstand. Vælg derefter fluorescens i stedet for termoforese til analyse. Vælg eksperttilstand og derefter fotoblevask.

3. Forberedelse af prøver til mærket MST

1. Vam7-His8-opløsningen bringes til en koncentration på 200 nM i PBS uden Tween.
2. Bring NTA-Atto 647 farvestoffet til 100 nM i PBS uden Tween.
3. Bland Vam7-His8 og NTA-Atto 647 farvestoffet i et volumenforhold på 1:1 og lad det sidde ved stuetemperatur dækket af lys i 30 minutter. Bestem den passende koncentration af målprotein som i pkt. 2.5 (se Supplement om anvendelse af KD af Ni-NTA-farvestof som påvist i video).
4. Centrifugeblanding af NTA-Atto 647 N farvestof og protein i 10 min i et mørkt rum ved hjælp af en bordpladecentrifuge på ca. 8.161 x g.
5. Blandingen opbevares ved 4 °C efter forsøget eller på is under forsøget med henblik på genbrug inden for få timer, hvis det er nødvendigt for at forhindre protein i at denaturere.
6. Brug NT-koncentrationsfinderen til at bestemme det koncentrationsområde, der er nødvendigt for titrering.
7. Di-C8 PA bringes til passende maksimal koncentration i vand.
8. Analytten titreres ved hjælp af en seriel fortynding på 1:1 i PBS-bufferen i 16 koncentrationer baseret på det foregående trin. I modsætning til SPR er termoforese ikke så følsom over for bufferforskelle.

4. MST af prøver

1. Tænd for enheden og den vedhæftede bærbare computer.
2. Tryk på pil op på forsiden af maskinen, og skub kapillærstativet ud.
3. Læg kapillærer i stativet med den højeste koncentration i position 1.
4. I kontrolsoftwaren skal du vælge den røde kanal, der svarer til NTA-Atto 647 N.
5. Angiv koncentrations-, positions- og navneoplysninger for hver kapillær i kapillærertabellen.
6. Kør en kapillær scanning ved at trykke på Start Cap Scan ved 20% LED (forudindstillet) og juster i henhold til mellem 200 og 2000 fluorescensenheder ved hjælp af enten LED-intensitetsindstillinger eller koncentration af ligand (mærket protein).
7. Vælg et område af MST-effekt.
8. Start Cap Scan + MST-måling.
9. Analysér ved hjælp af analysesoftwaren.

5. Analyse af MST-data

BEMÆRK: Analysesoftwaren leveret af Nanotemper er proprietær og udføres ved hjælp af M.O. Affinity Analysis. Der er forskellige måder at måle bindingsaffiniteter baseret på enten fluorescens eller termoforese. Nyere versioner af denne software er forudindstillet til automatisk at evaluere data ved hjælp af termoforese og er forudindstillet til at bruge termoforese, hvor Tjump drager fordel af begge målinger. Alternativt kan man vælge enten Tjump alene eller Termoforese alene. Derudover tillader analysesoftwaren estimerede affinitetsmålinger ved hjælp af indledende fluorescens. Disse indstillinger kan kun tilgås i eksperttilstand.

1. Indstil evalueringsstrategien i analysesoftwaren til ekspert ved at klikke på feltet for lynet ved siden af et datasæt på skærmbilledet Datavalg. Analysesoftwaren er forudindstillet til at analysere til MST-analyse; en forsker kan dog vælge Opret ny analyse og vælge Indledende fluorescensanalyse for at estimere bindingsaffiniteter baseret på indledende fluorescens. Eksperttilstand er også tilgængelig til indledende fluorescens. I analysen beskrevet nedenfor blev termoforese og Tjump anvendt til at bestemme KD af den præsenterede Vam7-His8 med dets naturlige substrat, lipidphosphatidsyren.

Representative Results

Dette er et eksempeloutput ved hjælp af affinitetsanalysen. Den mærkede MST blev brugt til at bestemme bindingskonstanten for Vam7-His8 til den opløselige dioctanoyl (DiC8) PA for et af dets naturlige ^substrater9. Figur 1 viser de termoforetiske spor fra et forsøg med en 1:1 titrering af DiC8 PA startende ved 500 μM mod 50 nM Vam7-His8. Indledende fluorescens (tid før infrarød laser tændt), Tjump (tid oprindeligt efter infrarød laser tændt) og termoforese (når partikler når ligevægt med temperaturen) vises. Man kan beregne en KD ud fra en hvilken som helst af disse målinger alene eller kan bruge en kombination af Tjump og termoforese i betragtning af to af disse målinger.

I figur 2 vises en mætningskurve for termoforesen med Tjump-output fra analysesoftwaren. Som vist i figur 2 kan mætningskurven afbildes ud fra disse resultater; Det kan dog være svært at beregne en mætningskurve, da Fnorm ikke starter fra nul. For at omgå dette problem kan dataene normaliseres manuelt, eller outputtet kan indstilles til den brøkbundne bestemt af analysesoftwaren. Generelt bestemmes MST-resultaterne ved hjælp af en logskala som vist i figur 3. Analysesoftwaren tager automatisk højde for proteinkoncentration for at bestemme bindingsaffinitet ved at vælge _KD-modellen og indtaste proteinkoncentrationen. Hill-modellen i analysesoftwaren kan også bruges, som ikke tager højde for proteinkoncentration, men potentielt kan give et mål for cooperativitet for en given interaktion. Ved at eksportere enten output fra analysesoftwaren og plotte i tredjepartssoftware kan man opnå en _KD-måling som vist i figur 3. Det skal bemærkes, at den kritiske micellekoncentration (CMC) af dioctanoylglycerophospholipider er >3 mM, hvilket indikerer, at disse eksperimenter fungerer langt under ^CMC10.

Figur 1: MST-spor af Vam7-His8 til DiC8 PA. Der vises spor for PA-analyt til NTA-Atto 647N mærket Vam7-His8 ligand målt i den røde kanal. Indledende fluorescens blev målt ved stuetemperatur i 5 s (A), før infrarød laser blev tændt. Tjump (B) måles i de første sekunder efter induktion af varme fra den indbyggede infrarøde laser og måler fluorescensforskelle, der er til stede, når IR-laseren først tændes, før termoforetisk bevægelse af partikler måles. Termoforese (C) måles, efter at molekyler er ligestillede med bevægelsen induceret af varme fra den infrarøde laser på grund af termoforetiske bevægelsesforskelle på grund af faktorer som størrelse, ladning, opløsningsentropi eller konformationsændring af partikel, der måles med hensyn til titreret analyt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Mætningsbinding bestemt ud fra eksporterede MST-resultater ved hjælp af tredjepartssoftware. Normaliserede fluorescensresultater eksporteret fra analysesoftwaren. Dataene blev eksporteret og plottet ved hjælp af en specifik bindingsmodel på ét sted. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Bindingsaffinitet af Vam7-His8 til DiC8 PA ved hjælp af en sigmoidal model. Analyse af eksporterede data fra figur 1 eksporteret fra analysesoftwaren ved hjælp af normaliseringen Fnorm [%]. Ved at tage loggen over koncentrationerne af DiC8 PA plottet mod Fnorm ved hjælp af Graphpad Prism v.7 ved hjælp af Sigmoidal, 4PL, X is log (koncentration) model tillader en pasform, der resulterer i en KD på 89 ± 18,0 μM for Vam7-His8 bindingsaffinitet til DiC8 PA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil. 

Discussion

Bestemmelsen af Vam7-His8binding til DiC8-PA gav en robust monteret KD for den givne interaktion, som er lidt lavere affinitet end den målte KD for Vam7-His8 til PA-liposomer (ikke offentliggjort). Denne forskel skyldes sandsynligvis manglen på en membran, hvilket generelt resulterer i lavere affinitet for membranspecifikke lipidbindingsinteraktioner og derfor demonstrerer liposommembranstilladsets rolle for denne ^{interaktion11}.

For yderligere at bestemme styrken af MST-data skal en forsker undersøge både formen på sporene fra figur 1 og adskillelsen af sporene fra den valgte analysemetode. Ser man på sporene fra figur 1, resulterede de fleste koncentrationer i et klart spor som bestemt ved udjævning af termoforesedelen af kurven. I nogle tilfælde kan spor svarende til reaktioner, der indeholder højere koncentrationer af analyt mod slutningen af den fluorescerende måling, skyldes aggregering i prøvens vedhæftning til prøvekapillærerne, som kan afhjælpes ved tilsætning af en eller begge Pluronic eller Tween til ^bufferen12. Imidlertid er vaskemidler som disse muligvis ikke egnede til protein-lipid-interaktioner13. For at teste for ikke-specifik binding for denne type protein-lipidinteraktion kan man tilføje BSA, øge saltkoncentrationen eller bruge glycerol i bufferen og teste, om dette påvirker den estimerede ^KD14,15.

Adskillelse bestemmes af forskellen i Fnorm mellem den højeste og laveste koncentrationsmåling for den givne interaktion. Som vist i figur 2 var adskillelsen for denne interaktion ca. 75 fluorescensenheder. Generelt bør der opnås en adskillelse af mindst 5 fluorescensenheder for med sikkerhed at kunne stole på MST-data fra ukendte kemiske affinitetsmålinger. Hvis der opnås en robust _KD-pasform ved lidt lavere adskillelse, kan man muligvis stadig overveje sådanne data, hvis de svarede til affinitetsmålinger, der blev anvendt via en anden teknik som SPR eller ITC.

Fordi nogle af de termoforetiske spor viste en vis klæbrighed i prøven, var det output, der blev valgt til figur 3, en kombination af termoforese med Tjump. Denne indstilling er den forudvalgte indstilling i de fleste nyere versioner af analysesoftwaren. Figur 3 angiver en robust tilpasning til en sigmoidal bindingsaffinitetsmodel, da der var klar mætning med en 12 punkt 1: 1 titrering. Enheden gør det muligt at tage 16 punkter i et givet løb, og mange interaktioner kræver alle disse punkter for at opnå en stærk bindende affinitetsmåling. For at opnå større tillid bør dette forsøg gentages med nye kapillærer to eller flere gange, der kræver i alt 36 kapillærrør til dette forsøg. Derudover kan man prøve en anden teknik som SPR for at bekræfte disse data for at sikre pålidelig rapportering af affinitetskonstanter, som vi tidligere har ^gjort8,16.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye	GE Healthcare	PA23031	For protein labeleing
Graphpad Prsim	Graphpad software
Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)	Nanotemper	MO-K022	Capillaries for MST
Monolith NT.115 machine	Nanotemper		University equipment
NTA-Atto 647 N	Sigma	2175	label for His tags
Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Lipid for binding experiments