Summary
Mikroskala termofores erhåller bindande konstanter snabbt till låg materialkostnad. Antingen märkt eller etikettfri termofores i mikroskala är kommersiellt tillgänglig; Etikettfri termofores kan dock inte mångfald av interaktionsmätningar som kan utföras med fluorescerande etiketter. Vi tillhandahåller ett protokoll för märkta termoforesmätningar.
Abstract
Förmågan att bestämma lipidernas bindningstillhörighet till proteiner är en viktig del av förståelsen av protein-lipidinteraktioner i membranhandel, signaltransduktion och cytoskeletal ombyggnad. Klassiska verktyg för att mäta sådana interaktioner inkluderar ytplasmonresonans (SPR) och isoterm titreringskalkorimetri (ITC). Även om de är kraftfulla verktyg har dessa tillvägagångssätt bakslag. ITC kräver stora mängder renat protein samt lipider, vilket kan vara kostsamt och svårt att producera. Dessutom är ITC och SPR mycket tidskrävande, vilket kan öka kostnaden för att utföra dessa experiment avsevärt. Ett sätt att kringgå dessa begränsningar är att använda den relativt nya tekniken för mikroskala termofores (MST). MST är snabbt och kostnadseffektivt med små mängder prov för att erhålla en mättnadskurva för en given bindningshändelse. Det finns för närvarande två typer av MST-system tillgängliga. En typ av MST kräver märkning med fluorofor i det blå eller röda spektrumet. Det andra systemet förlitar sig på den inneboende fluorescensen hos aromatiska aminosyror i UV-området. Båda systemen detekterar molekylers rörelse som svar på lokaliserad induktion av värme från en infraröd laser. Varje tillvägagångssätt har sina fördelar och nackdelar. Etikettfri MST kan använda otaggade inhemska proteiner; emellertid, många analyter, inklusive läkemedel, fluoresce i UV-området, vilket kan störa bestämning av exakta KD värden. I jämförelse möjliggör märkt MST en större mångfald av mätbara parvis interaktioner med fluorescerande märkta sonder fästa vid ligands med mätbara absorbanser i det synliga intervallet i motsats till UV, vilket begränsar risken för störande signaler från analyter.
Introduction
Mikroskala termofores är en relativt ny teknik för att bestämma disassociation konstanter (KD) samt hämningskonstanter (IC50) mellan biokemiskt relevanta ligands. Den ledande kommersiella återförsäljaren för MST (t.ex. NanoTemper) erbjuder två populära MST-tekniker: 1) Etikettfri MST som kräver en fluorescerande tagg och 2) märkt termofores med hjälp av den inneboende fluorescensen av proteiner beroende på antalet aromatiska rester som finns i varje protein1. En nackdel med etikettfri termofores är att det i de flesta fall inte tillåter mätning av protein-proteininteraktioner. Det kan dock vara möjligt att konstruera proteiner utan aromatiska aminosyror såsom tryptofan för användning i etikettfri termofores2.
MST mäter partiklarnas rörelse som svar på induktion av mikroskopiska temperaturfält som initierats av en infraröd laser i den teknik som för närvarande finns tillgänglig1. MST kan användas för att mäta protein-proteininteraktioner, protein-lipidinteraktioner, protein-liten molekyl, tävlingsexperiment och till och med interaktioner mellan småmolekyler så länge man kan producera tillräckligt med signalseparation. Dessutom möjliggör MST mätning av membran-proteinbaserade interaktioner inbäddade i antingen liposomer eller nanodiscs. Märkt termofores utnyttjar användningen av fluorescerande märkta taggar som möjliggör kemiskt kontrollerbar separation av signal mellan ligand och analyt. KD-värden kan erhållas med termofores för interaktioner som involverar proteinbindning vid låga nanomolära koncentrationer, vilket i de flesta fall är en mycket lägre koncentration av protein än vad som krävs för isotermisk kalorimetri (ITC)3. Mst har inte heller strikta buffringskrav som krävs för ytplasmonresonans (SPR)4 och märkt termofores kan till och med användas för att mäta bindningskonstanter av proteiner av intresse från icke-helt renade proteinlösningar5 med genetiskt insatta fluorescerande taggar6. En nackdel med MST är att kinetiska parametrar inte lätt kan erhållas för MST som i SPR2.
Termoforesmätningar beror på den lokala temperaturskillnaden för en lösning. Denna värme kan genereras från en infraröd laser. MST-enheten har en fluorescensdetektor kopplad till en infraröd (IR) stråle och kan fånga upp förändringar i fluorescens från lokala koncentrationsförändringar av fluorescerande molekyler vid den punkt där IR-lasern är riktad. MST-enheten använder en IR-riktad laser kopplad direkt till en fluorescensdetektor fokuserad vid samma punkt där värmen genereras i lösningen. Detta möjliggör robust detektion av temperaturförändringar som motsvarar utarmningen av molekyler vid värmepunkten som genereras av IR-lasern. Uppmätt fluorescens minskar i allmänhet närmare IR-lasern som svar på temperaturökningar. De skillnader som mäts som ett resultat kan bero på flera faktorer inklusive laddning, storlek eller solvation entropi. Dessa skillnader mäts som förändringar i fluorescens som svar på induktion av värme eller rörelse av molekyler från varma till kallare delar av kapillären.
Vid lastning av en kapillär med en given lösning är det viktigt att lämna luft i vardera änden av kapillären och inte ladda kapillären helt full. Den kommersiella kapillären rymmer ca 10 μL lösning. Man kan uppnå exakta mätningar med 5 μL lösning så länge lösningen manipuleras till mitten av kapillären, det finns inga luftbubblor (potentiellt avgas innan man laddar kapillär), och man är noga med att ladda racket för att inte jostle lösningen från mitten av kapillären, där den infraröda lasern är riktad. Om lasern inte kommer i full kontakt med lösningen kommer resultatet sannolikt att bli en av tre oanvändbara utgångar för den koncentrationen: 1) ingen eller låg fluorescensdetektering, 2) högre fluorescensdetektering (eventuellt med ojämn topp) eller 3) fluorescensdetektering inom andra värden från given titrering, men med en ojämn och oavslutad topp.
För märkt termofores är det optimalt att ha en fluorescenssignal över 200 och under 2000 fluorescensenheter7. MST-enheten använder en rad LED-intensiteter från 0 till 100, som kan väljas för att uppnå en signal över 200 eller under 2000. Alternativt kan man använda olika koncentrationer av den märkta liganden för att modifiera fluorescenssignalen till en optimal nivå. Det är viktigt att köra en cap-skanning med en viss MST-mätning som referens när du analyserar data, eftersom en dålig cap-skanning ofta kan resultera i en punkt som senare kan bestämmas vara en avvikande. Varje körning bör ta cirka 30 min om du mäter en enda MST-effekt med en cap-skanning. De kommersiella enheterna tillåter ändringar i MST-ström. I äldre programvaruversioner kan detta ställas in från 0 till 100; och i senare versioner kan man välja låg, medelhög eller hög MST. För att uppnå robusta spår kan en forskare behöva prova var och en av dessa och bestämma vilken MST-inställning som resulterar i de mest robusta data för en viss interaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av material
- Förbered fosfatbuffrad saltlösning (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 och 2 mM KH2PO4, pH 7,41.
- Förbered NTA-Atto 647 N färgämne. Späd beståndet NTA-Atto 647 N färgämne till 100 nM från en 100% DMSO-lösning till PBS utan interpolering.
- Express Vam7-His8 – Protein som fusionsprotein i E. coli och rena med Ni-NTA och storleksuteslutningskromatografi8.
- Titrera analyten i PBS-bufferten. Om analyten beger sig i en annan buffert är märkt MST inte särskilt känsligt för mindre buffertskillnader från molekyler som DMSO, såvida inte innehållet i analytbufferten interagerar med märkt protein.
2. Förberedelse av MST-enheten
- Slå på strömbrytaren på enhetens baksida.
- Öppna kontrollprogramvaran och se till att den bärbara datorn är på och i ansluten status på datorn som är ansluten till enheten.
- Ange inställningarna fluorescens och MST för det här experimentet. Ställ in MST Före på 3 s, MST på 30 s och Fluorescence recovery (Fluo.) efter 1 s. Före mäter initial fluorescens och kräver inte långa tider; MST är den faktiska tiden för jämvikt efter värmeinduktion.
- Tabell över kapillärer: För varje kapillärrör anger du namnet på målet (ligand), namnet på liganden (analyt), koncentrationen av målet och den högsta titreringskoncentrationen och använder autofyllitreringsförhållandet. Ange till exempel 50 nM för målkoncentrationen av Vam7-His8, Vam7-His8 för målnamn, (1,2-dioctanoylfosfatidsyra) Di-C8 PA för ligandnamn och den högsta koncentrationen liganden väljer 1:1 och drar ner till autofyllplatser 2-16.
- Kör en cap scan för att välja lämplig LED (20% LED (förinställd)) baserat på signalen från målproteinet och justera mellan 200 och 2000 fluorescensenheter för märkta MST. Cap Scans ska visa enhetliga rundade klockformade toppar.
- Välj ett intervall av MST-krafter och ange värden för var och en för att testa för den mest robusta bindningspassningen och tryck på Start Cap Scan + Measurement, skanna olika värden för att bestämma bästa driftsförhållanden för given interaktion som testas.
- Bestäm MST-kraften med en bästa passform med hjälp av analysprogramvaran och förinställningen för termofores med Tjump. Analysera passar enligt de flesta fluorescensseparation mellan lägsta och högsta koncentration jämfört med MST-kraften med bästa passform och välj MST-kraften för replikerade försök.
- Bestäm om fotobleaching har inträffat mellan första och andra körningen genom att gå till analysprogramvaran och byta analysen till expertläge. Välj sedan fluorescens istället för termofores för analys. Välj expertläge och sedan fotobleaching.
3. Beredning av prover för märkt MST
- Ta Vam7-His8-lösningen till en koncentration av 200 nM i PBS utan Interpolering.
- Ta NTA-Atto 647-färgämnet till 100 nM i PBS utan interpolering.
- Blanda färgämnena Vam7-His8 och NTA-Atto 647 med ett volymetriskt förhållande på 1:1 och låt sitta vid rumstemperatur täckt av ljus i 30 min. Bestäm lämplig koncentration av målprotein som i avsnitt 2.5 (se Tillägg vid användning av KD av Ni-NTA färgämne som visas i video).
- Centrifugblandning av NTA-Atto 647 N färgämne och protein i 10 min i ett mörkt rum med en bordscentrifuger på cirka 8 161 x g.
- Förvara blandningen vid 4 °C efter försöket eller på is under försöket för återanvändning inom några timmar om det behövs för att förhindra att proteinet denaturerar.
- Använd NT-koncentrationssökaren för att bestämma det koncentrationsområde som behövs för titrering.
- Föra Di-C8 PA till lämplig maximal koncentration i vatten.
- Titrera analyten med en 1:1 seriell utspädning i PBS-bufferten för 16 koncentrationer baserat på föregående steg. Till skillnad från SPR är termofores inte lika känslig för buffertskillnader.
4. MST för prover
- Slå på enheten och den anslutna bärbara datorn.
- Tryck upp pilen på maskinens framsida och skjut ut kapillärstället.
- Ladda kapillärer i racket med den högsta koncentrationen vid position 1.
- I kontrollprogramvaran väljer du den röda kanalen som motsvarar NTA-Atto 647 N.
- Ange koncentrations-, positions- och namninformation för varje kapillär i kapillärförteckningen.
- Kör en kapillärskanning genom att trycka på Start Cap Scan vid 20% LED (förinställd) och justera enligt mellan 200 och 2000 fluorescensenheter med antingen LED-intensitetsinställningar eller koncentration av ligand (märkt protein).
- Välj ett intervall med MST-ström.
- Start Cap Scan + MST-mätning.
- Analysera med hjälp av analysprogramvaran.
5. Analys av MST-data
OBS: Analysprogramvaran från Nanotemper är proprietär och utförs med hjälp av M.O. Affinity Analysis. Det finns olika sätt att mäta bindningstillhörigheter baserade på antingen fluorescens eller termofores. Nyare versioner av denna programvara är förinställda för att automatiskt utvärdera data med termofores och är förinställda för att använda Thermophoresis med Tjump dra nytta av båda mätningarna. Alternativt kan man välja antingen Tjump ensam eller Thermophoresis ensam. Dessutom tillåter analysprogramvaran uppskattade affinitetsmätningar med hjälp av initial fluorescens. Dessa inställningar kan endast nås i expertläge.
- Ställ in utvärderingsstrategin i analysprogramvaran på expert genom att klicka på rutan för blixten bredvid en datauppsättning på skärmen Dataval. Analysprogramvaran är förinställd för att analysera mst-analys; En forskare kan dock välja Skapa ny analys och välja Initial Fluorescence Analysis för att uppskatta bindningstillhörigheter baserat på initial fluorescens. Expertläge är också tillgängligt för initial fluorescens. I analysen som beskrivs nedan användes termofores och Tjump för att bestämma KD av presenteras av Vam7-His8 med dess naturliga substrat, lipid fosfatidsyra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det här är ett exempelutdata som använder tillhörighetsanalysen. Den märkta MST användes för att bestämma bindkonstanten av Vam7-His8 till den lösliga dioctanoyl (DiC8) PA för ett av dess naturliga substrat9. Figur 1 presenterar de termofetiska spåren från en studie av en 1:1 titrering av DiC8 PA från 500 μM mot 50 nM Vam7-His8. Initial fluorescens (tid innan infraröd laser slogs på), Tjump (tid initialt efter infraröd laser påslagen) och termofores (när partiklarna når jämvikt med temperaturen) visas. Man kan beräkna en KD från någon av dessa mätningar ensam eller kan använda en kombination av Tjump och termofores med tanke på två av dessa mätningar.
I figur 2 visas en mättnadskurva för termoforesen med Tjump-utdata från analysprogramvaran. Som visas i figur 2 kan mättnadskurvan ritas utifrån dessa resultat. Det kan dock vara svårt att beräkna en mättnadskurva eftersom Fnorm inte börjar från noll. För att komma runt det här problemet kan data normaliseras manuellt eller utdata kan ställas in på den fraktionsbundna som bestäms av analysprogramvaran. I allmänhet bestäms MST-resultaten med hjälp av en loggskala som visas i figur 3. Analysprogramvaran redovisar automatiskt kontoproteinkoncentrationen för att bestämma bindningstillhörighet genom att välja KD-modell och mata in proteinkoncentrationen. Hill-modellen i analysprogramvaran kan också användas, som inte tar hänsyn till proteinkoncentration, men kan potentiellt ge ett mått av samarbetsförmåga för en given interaktion. Exportera antingen utdata från analysprogramvaran och plotta i programvara från tredje part, man kan få en KD-mätning som visas i figur 3. Det bör noteras att den kritiska micellekoncentrationen (CMC) av dioctanoylglycerophospholipider är >3 mM, vilket indikerar att dessa experiment fungerar långt under CMC10.
Figur 1: MST spår av Vam7-His8 till DiC8 PA. Spår visas för PA analyte till NTA-Atto 647N märkt Vam7-His8 ligand mätt i den röda kanalen. Initial fluorescens mättes vid rumstemperatur i 5 s (A) innan infraröd laser sattes på. Tjump (B) mäts under de första sekunderna efter induktion av värme från den inbyggda infraröda lasern och mäter fluorescensskillnader som finns när IR-laser först slås på innan termoforisk rörelse av partiklar mäts. Termofores (C) mäts efter att molekyler balanserat från rörelsen som induceras av värme från den infraröda lasern på grund av termofetiska rörelseskillnader på grund av faktorer som storlek, laddning, solvation entropi eller konformationell förändring av partikel som mäts med avseende på titrerad analyt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Mättnadsbindning som bestäms från exporterade MST-resultat med hjälp av programvara från tredje part. Normaliserade fluorescensresultat som exporteras från analysprogramvaran. Data exporterades och ritades med hjälp av en platsspecifik bindningsmodell. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Bindning av Vam7-His8 till DiC8 PA med hjälp av en sigmoidal modell. Analys av exporterade data från figur 1 som exporteras från analysprogramvaran med hjälp av normaliseringen Fnorm [%]. Genom att ta loggen över koncentrationerna av DiC8 PA plottade mot Fnorm med Graphpad Prism v.7 med Sigmoidal, 4PL, X är log(concentration) modell möjliggör en passform som resulterar i en KD på 89 ± 18,0 μM för Vam7-His8 bindande affinitet till DiC8 PA. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestämningen av Vam7-His8binding till DiC8-PA gav en robust monterad KD för den givna interaktionen, vilket är något lägre affinitet än den uppmätta KD av Vam7-His8 till PA liposomer (opublicerade). Denna skillnad beror sannolikt på bristen på ett membran, vilket i allmänhet resulterar i lägre affinitet för membranspecifika lipidbindningsinteraktioner och visar därför rollen för liposommembranställningen till denna interaktion11.
För att ytterligare fastställa styrkan hos MST-data behöver en forskare undersöka både formen på spåren från figur 1 och separationen av spåren från den valda analysmetoden. Om man tittar på spåren från figur 1 resulterade de flesta koncentrationer i ett tydligt spår som bestämdes av utjämningen av termoforesdelen av kurvan. I vissa fall kan spår som motsvarar reaktioner som innehåller högre koncentrationer av analyt mot slutet av den fluorescerande mätningen bero på aggregering i stickprovsefterlevnaderna, vilket kan avhjälpas genom tillsats av antingen eller både Pluronic eller Tween till buffert12. Tvättmedel som dessa kanske dock inte är lämpliga för protein-lipidinteraktioner13. För att testa för icke-specifik bindning för denna typ av protein-lipid interaktion kan man lägga till i BSA, öka saltkoncentrationen eller använda glycerol i bufferten och testa om detta påverkar den uppskattade KD14,15.
Separationen bestäms av skillnaden i Fnorm mellan den högsta och lägsta koncentrationsmätningen för den givna interaktionen. Som visas i figur 2 var separationen för denna interaktion cirka 75 fluorescensenheter. Generellt sett bör en separation av minst 5 fluorescensenheter uppnås för att med säkerhet förlita sig på MST-data från okända kemiska affinitetsmätningar. Om en robust KD-passform uppnås vid något lägre separation kan man fortfarande överväga sådana data om de motsvarade affinitetsmätningar som används via en annan teknik som SPR eller ITC.
Eftersom några av de termofetiska spåren visade viss klibbighet i provet, var den utmatning som valdes för figur 3 en kombination av termofores med Tjump. Den här inställningen är den förvalda inställningen i de flesta senare versioner av analysprogramvaran. Figur 3 indikerar en robust passform till en sigmoidal bindningstillhörighetsmodell eftersom det fanns tydlig mättnad med en 12 punkt 1:1 titrering. Enheten tillåter 16 punkter att tas i en viss körning, och många interaktioner kräver alla dessa punkter för att uppnå en stark bindningstillhörighetsmätning. För att uppnå större förtroende bör denna studie upprepas med nya kapillärer två eller flera gånger som kräver totalt 36 kapillärrör för detta experiment. Dessutom kan man prova en annan teknik som SPR för att bekräfta dessa data för att säkerställa tillförlitlig rapportering av affinitetskonstanter som vi tidigare har gjort8,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av ett bidrag från National Science Foundation (MCB 1818310) till RAF. Detta arbete stöddes delvis av Chemical Biology Core Facility/Protein Crystallography Unit vid H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
| Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |
References
- Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
- Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, nP. Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains. Gene. 163 (1), 1-11 (1995).
- Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100 (2010).
- Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).
- Starr, M. L., et al. Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).
- Miner, G. L., et al. The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain. Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models. Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).
- Zhao, H., Lappalainen, P. A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions. Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).
- Kaufmann, S. H. Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents. Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).
- le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
- Corradi, V., et al.
- Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective. SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).
- Sparks, R. P., et al. A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion. Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).
