Summary
يحصل الرحلان الحراري المجهري على ثوابت ربط بسرعة بتكلفة مادية منخفضة. إما الرحلان الحراري المجهري المسمى أو الخالي من التسمية متاح تجاريا. ومع ذلك ، فإن الرحلان الحراري الخالي من الملصقات غير قادر على تنوع قياسات التفاعل التي يمكن إجراؤها باستخدام ملصقات الفلورسنت. نحن نقدم بروتوكولا لقياسات الرحلان الحراري الموسومة.
Abstract
تعد القدرة على تحديد التقارب المرتبط للدهون بالبروتينات جزءا أساسيا من فهم التفاعلات بين البروتين والدهون في الاتجار بالأغشية ونقل الإشارات وإعادة تشكيل الهيكل الخلوي. وتشمل الأدوات الكلاسيكية لقياس هذه التفاعلات رنين البلازمون السطحي (SPR) وقياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC). في حين أن هذه الأساليب قوية ، إلا أنها تنطوي على انتكاسات. يتطلب مركز التجارة الدولية كميات كبيرة من البروتين النقي وكذلك الدهون ، والتي يمكن أن تكون مكلفة ويصعب إنتاجها. وعلاوة على ذلك، فإن مركز التجارة الدولية وكذلك SPR يستهلكان وقتا طويلا جدا، مما قد يضيف بشكل كبير إلى تكلفة إجراء هذه التجارب. إحدى الطرق لتجاوز هذه القيود هي استخدام تقنية جديدة نسبيا للرحلان الحراري المجهري (MST). MST سريع وفعال من حيث التكلفة باستخدام كميات صغيرة من العينة للحصول على منحنى تشبع لحدث ربط معين. يوجد حاليا نوعان من أنظمة MST المتاحة. يتطلب نوع واحد من MST وضع العلامات باستخدام الفلوروفور في الطيف الأزرق أو الأحمر. يعتمد النظام الثاني على التألق الجوهري للأحماض الأمينية العطرية في نطاق الأشعة فوق البنفسجية. يكتشف كلا النظامين حركة الجزيئات استجابة للتحريض الموضعي للحرارة من ليزر الأشعة تحت الحمراء. كل نهج له مزاياه وعيوبه. يمكن أن يستخدم MST الخالي من الملصقات بروتينات أصلية غير موسومة ؛ ومع ذلك ، فإن العديد من التحليلات ، بما في ذلك المستحضرات الصيدلانية ، الفلوريس في نطاق الأشعة فوق البنفسجية ، والتي يمكن أن تتداخل مع تحديد قيم KD الدقيقة. وبالمقارنة، يسمح MST المسمى بتنوع أكبر في التفاعلات الزوجية القابلة للقياس باستخدام مجسات تحمل علامات فلورسنت متصلة بالأربطة ذات الامتصاص القابل للقياس في النطاق المرئي بدلا من الأشعة فوق البنفسجية، مما يحد من إمكانية تداخل الإشارات من التحليلات.
Introduction
الرحلان الحراري المجهري هو تقنية جديدة نسبيا في تحديد ثوابت فك الارتباط (KD) وكذلك ثوابت التثبيط (IC50) بين الأربطة ذات الصلة كيميائيا حيويا. تقدم شركة التجزئة التجارية الرائدة في مجال MST (على سبيل المثال ، NanoTemper) تقنيتين شائعتين من تقنيات MST: 1) MST خالية من الملصقات تتطلب علامة فلورسنت ، و 2) الرحلان الحراري المسمى باستخدام التألق المتأصل للبروتينات التي تعتمد على عدد المخلفات العطرية الموجودة في كل بروتين 1. من عيوب الرحلان الحراري الخالي من الملصقات أنه في معظم الحالات ، لا يسمح بقياس تفاعلات البروتين والبروتين. ومع ذلك ، قد يكون من الممكن هندسة البروتينات بدون أحماض أمينية عطرية مثل التربتوفان لاستخدامها في الرحلان الحراري الخالي من الملصقات 2.
يقيس MST حركة الجسيمات استجابة لتحريض حقول درجة الحرارة المجهرية التي بدأها ليزر الأشعة تحت الحمراء في التقنيات المتاحة حاليا1. يمكن استخدام MST لقياس التفاعلات بين البروتين والبروتين ، والتفاعلات بين البروتين والدهون ، وجزيء البروتين الصغير ، وتجارب المنافسة ، وحتى التفاعلات بين الجزيئات الصغيرة طالما يمكن للمرء أن ينتج ما يكفي من فصل الإشارة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح MST بقياس التفاعلات القائمة على البروتين الغشائي المضمنة في الجسيمات الشحمية أو الأقراص النانوية. يستفيد الرحلان الحراري المسمى من استخدام العلامات الموسومة بالفلورسنت مما يسمح بفصل الإشارة الذي يمكن التحكم فيه كيميائيا بين الرباط والتحليل. يمكن الحصول على قيم KD باستخدام الرحلان الحراري للتفاعلات التي تنطوي على ربط البروتين بتركيزات نانومولية منخفضة ، والتي تكون في معظم الحالات تركيزا أقل بكثير من البروتين مما هو مطلوب لقياس السعرات الحرارية المتساوية الحرارة (ITC)3. بالإضافة إلى ذلك ، ليس لدى MST متطلبات تخزين مؤقت صارمة كما هو مطلوب لرنين البلازمون السطحي (SPR)4 ويمكن حتى استخدام الرحلان الحراري المسمى لقياس ثوابت ربط البروتينات ذات الأهمية من محاليل البروتين غير النقية بالكامل 5 مع علامات الفلورسنت المدرجة وراثيا 6. عيب MST هو أنه لا يمكن الحصول على المعلمات الحركية بسهولة ل MST كما هو الحال في SPR2.
تعتمد قياسات الرحلان الحراري على اختلاف درجة الحرارة المحلية للمحلول. يمكن توليد هذه الحرارة من ليزر الأشعة تحت الحمراء. يحتوي جهاز MST على كاشف تألق مقترن بشعاع الأشعة تحت الحمراء (IR) ويمكنه التقاط التغيرات في التألق من تغيرات التركيز المحلي لجزيئات الفلورسنت عند النقطة التي يتم فيها استهداف ليزر الأشعة تحت الحمراء. يستخدم جهاز MST ليزر مستهدف بالأشعة تحت الحمراء مقترنا مباشرة بكاشف التألق الذي يركز على نفس النقطة التي يتم فيها توليد الحرارة في المحلول. وهذا يسمح بالكشف القوي عن التغيرات في درجة الحرارة المقابلة لنضوب الجزيئات عند نقطة الحرارة الناتجة عن ليزر الأشعة تحت الحمراء. يتناقص التألق المقاس بشكل عام بالقرب من ليزر الأشعة تحت الحمراء استجابة لزيادة درجة الحرارة. يمكن أن تكون الاختلافات التي تم قياسها نتيجة لذلك بسبب عوامل متعددة بما في ذلك الشحنة أو الحجم أو إنتروبيا الحل. يتم قياس هذه الاختلافات على أنها تغيرات في التألق استجابة لتحريض الحرارة أو حركة الجزيئات من الأجزاء الساخنة إلى الباردة من الشعيرات الدموية.
عند تحميل الشعيرات الدموية بمحلول معين ، من المهم ترك الهواء في أي من طرفي الشعيرات الدموية وعدم تحميل الشعيرات الدموية بالكامل بالكامل. الشعيرات الدموية التجارية تحمل حوالي 10 ميكرولتر من المحلول. يمكن للمرء تحقيق قياسات دقيقة باستخدام 5 ميكرولتر من المحلول طالما يتم التلاعب بالمحلول إلى مركز الشعيرات الدموية ، ولا توجد فقاعات هواء (يحتمل أن تكون degas قبل تحميل الشعيرات الدموية) ، والمرء حريص على تحميل الرف لعدم تزاحم المحلول من مركز الشعيرات الدموية ، حيث يتم استهداف ليزر الأشعة تحت الحمراء. إذا لم يتلامس الليزر بشكل كامل مع المحلول ، فمن المرجح أن تكون النتيجة واحدة من ثلاثة مخرجات غير قابلة للاستخدام لهذا التركيز: 1) عدم وجود أو اكتشاف تألق منخفض ، 2) اكتشاف تألق أعلى (يحتمل أن يكون مع ذروة خشنة) ، أو 3) اكتشاف التألق ضمن قيم أخرى من المعايرة بالتحليل الحجمي ، ولكن مع ذروة خشنة وغير مستديرة.
بالنسبة للرحلان الحراري المسمى ، من الأفضل أن يكون لديك إشارة تألق أعلى من 200 وحدة تألق وأقل من 2000 وحدة تألق7. يستخدم جهاز MST مجموعة من كثافات LED من 0 إلى 100 ، والتي يمكن اختيارها لتحقيق إشارة أعلى من 200 أو أقل من 2000. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام تركيزات مختلفة من الليغاند المسمى لتعديل إشارة التألق إلى المستوى الأمثل. من المهم إجراء فحص للغطاء باستخدام قياس MST معين كمرجع عند تحليل البيانات ، حيث يمكن أن يؤدي فحص الغطاء الضعيف في كثير من الأحيان إلى نقطة قد يتم تحديدها لاحقا على أنها شاذة. يجب أن يستغرق كل تشغيل حوالي 30 دقيقة إذا تم قياس طاقة MST واحدة باستخدام فحص الغطاء. تسمح الأجهزة التجارية بإجراء تغييرات في طاقة MST. في إصدارات البرامج القديمة ، يمكن تعيين هذا من 0 إلى 100 ؛ وفي الإصدارات الأحدث ، يمكن للمرء تحديد MST منخفض أو متوسط أو مرتفع. لتحقيق آثار قوية ، قد يحتاج الباحث إلى تجربة كل من هذه وتحديد إعداد MST الذي ينتج عنه أقوى البيانات لتفاعل معين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المواد
- تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): 137 mM NaCl ، 2.5 mM KCl ، 10 mM NaH2PO4 ، و 2 mM KH2PO4 ، الرقم الهيدروجيني 7.41.
- تحضير صبغة NTA-Atto 647 N. قم بتخفيف صبغة NTA-Atto 647 N إلى 100 نانومتر من محلول DMSO بنسبة 100٪ إلى PBS بدون Tween.
- Express Vam7-His8 – البروتين كبروتين اندماج في الإشريكية القولونية وتنقيته باستخدام Ni-NTA وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم 8.
- معايرة التحليل في المخزن المؤقت PBS. إذا كان التحليل في مخزن مؤقت مختلف ، فإن MST المسمى ليس حساسا بشكل خاص للاختلافات الطفيفة في المخزن المؤقت من جزيئات مثل DMSO ، ما لم تتفاعل محتويات المخزن المؤقت التحليلي مع البروتين الموسوم.
2. إعداد جهاز MST
- قم بتشغيل مفتاح الطاقة الموجود في الجزء الخلفي من الجهاز.
- افتح برنامج التحكم وتأكد من أن الكمبيوتر المحمول قيد التشغيل وفي حالة اتصال على الكمبيوتر المتصل بالجهاز.
- أدخل إعدادات التألق وMST لهذه التجربة. اضبط MST قبل 3 ثوان ، MST على 30 ثانية ، واستعادة التألق (Fluo.) بعد 1 ثانية. قبل قياس التألق الأولي ولا يتطلب وقتا طويلا ؛ MST هو مقدار الوقت الفعلي للوصول إلى التوازن بعد الحث الحراري.
- جدول الشعيرات الدموية: لكل أنبوب شعري، أدخل اسم الهدف (الليغاند)، واسم الليكاند (التحليل)، وتركيز الهدف، وأعلى تركيز معايرة بالتحليل الحجمي واستخدم نسبة المعايرة بالتحليل الحجمي التلقائي. على سبيل المثال، أدخل 50 نانومتر للتركيز المستهدف ل Vam7-His8، Vam7-His8 للاسم المستهدف، (1,2-dioctanoyl phosphatidic acid) Di-C8 PA لاسم الليغاند، وأعلى تركيز لليجند الذي يحدد 1:1 ويسحب لأسفل إلى فتحات التعبئة التلقائية 2-16.
- قم بتشغيل Cap Scan لتحديد LED المناسب (20٪ LED (الإعداد المسبق)) استنادا إلى إشارة البروتين المستهدف وضبط ما بين 200 و 2000 وحدة تألق ل MST الملصقة. يجب أن تظهر عمليات مسح الغطاء قمم مستديرة موحدة على شكل جرس.
- حدد نطاقا من قوى MST وأدخل قيما لكل منها لاختبار ملاءمة الربط الأكثر قوة واضغط على Start Cap Scan + Measurement ، ومسح قيم مختلفة لتحديد أفضل ظروف التشغيل لتفاعل معين يتم اختباره.
- حدد طاقة MST بأفضل ملاءمة باستخدام برنامج التحليل والإعداد المسبق للرحلان الحراري باستخدام Tjump. قم بتحليل الملاءمة وفقا لمعظم الفصل الفلوري بين أدنى وأعلى تركيز مقارنة بقوة MST مع أفضل ملاءمة وحدد طاقة MST للتجارب المتماثلة.
- حدد ما إذا كان التبييض الضوئي قد حدث بين التشغيل الأول والثاني من خلال الانتقال إلى برنامج التحليل وتحويل التحليل إلى وضع الخبراء. بعد ذلك ، حدد التألق بدلا من الرحلان الحراري للتحليل. حدد وضع الخبير ثم التبييض الضوئي.
3. إعداد عينات ل MST المسمى
- أحضر محلول Vam7-His8 إلى تركيز 200 نانومتر في PBS بدون Tween.
- اجلب صبغة NTA-Atto 647 إلى 100 نانومتر في PBS بدون Tween.
- امزج صبغة Vam7-His8 و NTA-Atto 647 بنسبة حجمية 1: 1 واتركها تجلس في درجة حرارة الغرفة المغطاة بالضوء لمدة 30 دقيقة. حدد التركيز المناسب للبروتين المستهدف كما هو موضح في القسم 2.5 (انظر الملحق الخاص باستخدام KD من صبغة Ni-NTA كما هو موضح في الفيديو).
- خليط أجهزة الطرد المركزي من صبغة NTA-Atto 647 N والبروتين لمدة 10 دقائق في غرفة مظلمة باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة عند حوالي 8,161 × جم.
- قم بتخزين الخليط على درجة حرارة 4 درجات مئوية بعد التجربة أو على الجليد أثناء التجربة لإعادة استخدامه في غضون ساعات قليلة إذا لزم الأمر من أجل الحفاظ على البروتين من تغيير طبيعة البشرة.
- استخدم مكتشف تركيز NT لتحديد نطاق التركيز اللازم للمعايرة بالتحليل الحجمي.
- اجلب Di-C8 PA إلى الحد الأقصى المناسب من التركيز في الماء.
- معايرة التحليل باستخدام تخفيف تسلسلي 1: 1 في المخزن المؤقت PBS ل 16 تركيزا استنادا إلى الخطوة السابقة. على عكس SPR ، فإن الرحلان الحراري ليس حساسا لاختلافات المخزن المؤقت.
4. MST من العينات
- قم بتشغيل الجهاز والكمبيوتر المحمول المرفق.
- اضغط على السهم لأعلى في الجزء الأمامي من الماكينة وحرك الرف الشعري للخارج.
- قم بتحميل الشعيرات الدموية في الحامل بأعلى تركيز في الموضع 1.
- في برنامج التحكم، حدد القناة الحمراء المقابلة ل NTA-Atto 647 N.
- أدخل معلومات التركيز والموضع والاسم لكل شعيرات دموية في جدول الشعيرات الدموية.
- قم بإجراء فحص شعري عن طريق الضغط على Start Cap Scan بنسبة 20٪ LED (الإعداد المسبق) وضبطه وفقا لما بين 200 و 2000 وحدة تألق باستخدام إعدادات كثافة LED أو تركيز ligand (البروتين المسمى ).
- حدد نطاقا من طاقة MST.
- بدء مسح الغطاء + قياس MST.
- تحليل باستخدام برنامج التحليل.
5. تحليل بيانات MST
ملاحظة: برنامج التحليل الذي توفره Nanotemper هو ملكية خاصة ويتم إجراؤه باستخدام M.O. Affinity Analysis. هناك طرق مختلفة لقياس التقاربات الملزمة بناء على التألق أو الرحلان الحراري. يتم إعداد الإصدارات الأحدث من هذا البرنامج مسبقا لتقييم البيانات تلقائيا باستخدام الرحلان الحراري ويتم إعدادها مسبقا لاستخدام Thermophoresis مع الاستفادة من Tjump من كلا القياسين. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء اختيار إما Tjump وحده أو Thermophoresis وحده. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح برنامج التحليل بقياسات التقارب المقدرة باستخدام التألق الأولي. يمكن الوصول إلى هذه الإعدادات في وضع الخبراء فقط.
- قم بتعيين استراتيجية التقييم في برنامج التحليل إلى خبير عن طريق النقر فوق المربع الخاص بصاعقة البرق بجوار مجموعة بيانات في شاشة اختيار البيانات. تم إعداد برنامج التحليل مسبقا للتحليل إلى تحليل MST ؛ ومع ذلك ، يمكن للباحث تحديد إنشاء تحليل جديد وتحديد تحليل التألق الأولي من أجل تقدير التقاربات الملزمة بناء على التألق الأولي. وضع الخبراء متاح أيضا للتألق الأولي. في التحليل الموضح أدناه ، تم استخدام الرحلان الحراري و Tjump لتحديد KD للعرض المقدم من Vam7-His8 مع ركيزته الطبيعية ، حمض الفوسفاتيديك الدهني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا هو إخراج عينة باستخدام تحليل التقارب. تم استخدام MST المسمى لتحديد ثابت ربط Vam7-His8 إلى ثنائي الأوكتانويل القابل للذوبان (DiC8) PA لإحدى ركائزه الطبيعية9. يعرض الشكل 1 الآثار الحرارية من تجربة واحدة لمعايرة 1: 1 من DiC8 PA بدءا من 500 ميكرومتر مقابل 50 نانومتر من Vam7-His8. يتم عرض التألق الأولي (الوقت قبل تشغيل ليزر الأشعة تحت الحمراء) ، Tjump (الوقت في البداية بعد تشغيل ليزر الأشعة تحت الحمراء) ، والرحلان الحراري (بمجرد وصول الجسيمات إلى التوازن مع درجة الحرارة). يمكن للمرء حساب دينار كويتي من أي من هذه القياسات وحدها أو يمكن استخدام مزيج من Tjump والرحلان الحراري مع الأخذ في الاعتبار اثنين من هذه القياسات.
في الشكل 2 ، يظهر منحنى تشبع للرحلان الحراري مع إخراج Tjump من برنامج التحليل. كما هو موضح في الشكل 2 ، يمكن رسم منحنى التشبع من هذه النتائج ؛ ومع ذلك ، قد يكون من الصعب حساب منحنى التشبع لأن Fnorm لا يبدأ من الصفر. من أجل التغلب على هذه المشكلة ، يمكن تطبيع البيانات يدويا ، أو يمكن تعيين الإخراج إلى الكسر المرتبط الذي يحدده برنامج التحليل. بشكل عام ، يتم تحديد نتائج MST باستخدام مقياس سجل كما هو موضح في الشكل 3. يقوم برنامج التحليل تلقائيا بحساب تركيز البروتين من أجل تحديد تقارب الارتباط عن طريق اختيار نموذج KD وإدخال تركيز البروتين. يمكن أيضا استخدام نموذج هيل في برنامج التحليل ، والذي لا يأخذ في الاعتبار تركيز البروتين ، ولكن يمكن أن يعطي مقياسا للتعاون لتفاعل معين. تصدير إما المخرجات من برنامج التحليل والتخطيط في برامج الطرف الثالث ، يمكن للمرء الحصول على قياس KD كما هو موضح في الشكل 3. تجدر الإشارة إلى أن تركيز المسيلات الحرجة (CMC) للدهون الفوسفورية الديوكتانويل يبلغ >3 مللي متر ، مما يشير إلى أن هذه التجارب تعمل أقل بكثير من CMC10.
الشكل 1: آثار MST من Vam7-His8 إلى DiC8 PA. يتم عرض آثار لتحليل PA إلى NTA-Atto 647N المسمى Vam7-His8 ligand المقاسة في القناة الحمراء. تم قياس التألق الأولي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 ثوان (A) قبل تشغيل ليزر الأشعة تحت الحمراء. يتم قياس Tjump (B) في الثواني الأولى بعد تحريض الحرارة من ليزر الأشعة تحت الحمراء المدمج ويقيس اختلافات التألق الموجودة عند تشغيل ليزر الأشعة تحت الحمراء لأول مرة قبل الحركة الحرارية للجسيمات التي يتم قياسها. يتم قياس الرحلان الحراري (C) بعد توازن الجزيئات من الحركة التي تسببها الحرارة من ليزر الأشعة تحت الحمراء بسبب اختلافات الحركة الحرارية بسبب عوامل مثل الحجم أو الشحنة أو إنتروبيا الذوبان أو التغير التوافقي للجسيمات التي يتم قياسها فيما يتعلق بالتحليل المعاير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ربط التشبع المحدد من نتائج MST المصدرة باستخدام برنامج تابع لجهة خارجية. نتائج التألق العادية المصدرة من برنامج التحليل. تم تصدير البيانات ورسمها باستخدام نموذج ربط محدد لموقع واحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقارب ربط Vam7-His8 إلى DiC8 PA باستخدام نموذج سيني. تحليل البيانات المصدرة من الشكل 1 المصدرة من برنامج التحليل باستخدام Fnorm التطبيع [٪]. أخذ سجل تركيزات DiC8 PA المرسومة ضد Fnorm باستخدام Graphpad Prism v.7 باستخدام Sigmoidal ، 4PL ، X هو نموذج log (focus) يسمح بملاءمة تؤدي إلى KD من 89 ± 18.0 μM لتقارب ربط Vam7-His8 إلى DiC8 PA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملف تكميلي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وفر تحديد Vam7-His8binding إلى DiC8-PA KD مناسبا قويا للتفاعل المعطى ، وهو تقارب أقل قليلا من KD المقاس من Vam7-His8 إلى الجسيمات الشحمية PA (غير المنشورة). ويرجع هذا الاختلاف على الأرجح إلى عدم وجود غشاء، مما يؤدي عموما إلى انخفاض التقارب مع تفاعلات ربط الدهون الخاصة بالغشاء، وبالتالي يوضح دور سقالة الغشاء الشحمي في هذا التفاعل11.
من أجل زيادة تحديد قوة بيانات MST ، يحتاج الباحث إلى فحص كل من شكل الآثار من الشكل 1 وفصل الآثار عن طريقة التحليل المختارة. بالنظر إلى الآثار من الشكل 1 ، أدت معظم التركيزات إلى أثر واضح كما هو محدد من خلال تسوية جزء الرحلان الحراري من المنحنى. وفي بعض الحالات، يمكن أن تكون الآثار المقابلة للتفاعلات التي تحتوي على تركيزات أعلى من التحليل قرب نهاية قياس الفلورسنت ناتجة عن التجميع في التصاق العينة بالعينة الشعرية، والتي يمكن علاجها عن طريق إضافة أي من البلوروني أو التوين أو كليهما إلى المخزن المؤقت12. ومع ذلك، قد لا تكون المنظفات مثل هذه مناسبة للتفاعلات بين البروتين والدهون13. لاختبار الارتباط غير المحدد لهذا النوع من التفاعل بين البروتين والدهون ، يمكن للمرء إضافة BSA ، أو زيادة تركيز الملح ، أو استخدام الجلسرين في المخزن المؤقت واختبار ما إذا كان هذا يؤثر على KD14,15 المقدر.
يتم تحديد الفصل من خلال الفرق في Fnorm بين أعلى وأدنى قياس تركيز للتفاعل المحدد. كما هو موضح في الشكل 2 ، كان الفصل لهذا التفاعل حوالي 75 وحدة تألق. بشكل عام ، بالمعنى الدقيق ، يجب تحقيق فصل ما لا يقل عن 5 وحدات تألق للاعتماد بثقة على بيانات MST لقياسات التقارب الكيميائي غير المعروفة. إذا تم تحقيق ملاءمة KD قوية عند فصل أقل قليلا ، فقد يتمكن المرء من الاستمرار في النظر في هذه البيانات إذا كانت تتوافق مع قياسات التقارب المستخدمة عبر تقنية أخرى مثل SPR أو ITC.
نظرا لأن بعض الآثار الحرارية أظهرت بعض الالتصاق في العينة ، فإن الناتج المختار للشكل 3 كان مزيجا من الرحلان الحراري مع Tjump. هذا الإعداد هو الإعداد المحدد مسبقا في معظم الإصدارات الأحدث من برنامج التحليل. يشير الشكل 3 إلى ملاءمة قوية لنموذج تقارب الارتباط السيني حيث كان هناك تشبع واضح مع معايرة 12 نقطة 1: 1. يسمح الجهاز بأخذ 16 نقطة في تشغيل معين ، وتتطلب العديد من التفاعلات كل هذه النقاط لتحقيق قياس تقارب ملزم قوي. من أجل تحقيق ثقة أكبر ، يجب تكرار هذه التجربة مع الشعيرات الدموية الجديدة مرتين أو أكثر مما يتطلب ما مجموعه 36 أنبوبا شعريا لهذه التجربة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يجرب المرء تقنية أخرى مثل SPR لتأكيد هذه البيانات من أجل ضمان الإبلاغ الموثوق به عن ثوابت التقارب كما فعلنا سابقا8,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من خلال منحة من المؤسسة الوطنية للعلوم (MCB 1818310) إلى سلاح الجو الملكي البريطاني. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المرفق الأساسي للبيولوجيا الكيميائية / وحدة علم البلورات البروتينية في مركز H. Lee Moffitt للسرطان (NIH / NCI: P30-CA076292).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
| Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |
References
- Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
- Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, nP. Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains. Gene. 163 (1), 1-11 (1995).
- Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100 (2010).
- Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).
- Starr, M. L., et al. Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).
- Miner, G. L., et al. The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain. Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models. Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).
- Zhao, H., Lappalainen, P. A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions. Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).
- Kaufmann, S. H. Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents. Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).
- le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
- Corradi, V., et al.
- Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective. SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).
- Sparks, R. P., et al. A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion. Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).
