Summary
微尺度热泳以较低的材料成本快速获得结合常数。标记或标记的无微量级热泳是市售的;然而，无标记热泳不能使用荧光标记进行相互作用测量的多样性。我们提供用于标记热泳测量的协议。
Abstract
确定脂质与蛋白质的结合亲和力的能力是了解膜运输，信号转导和细胞骨架重塑中蛋白质 - 脂质相互作用的重要组成部分。测量此类相互作用的经典工具包括表面等离子体共振（SPR）和等温滴定量热法（ITC）。虽然这些工具功能强大，但也有挫折。ITC需要大量的纯化蛋白质和脂质，这可能既昂贵又难以生产。此外，ITC和SPR非常耗时，这可能会大大增加进行这些实验的成本。绕过这些限制的一种方法是使用相对较新的微尺度热泳（MST）技术。MST使用少量样品获得给定结合事件的饱和曲线，快速且经济高效。目前有两种类型的 MST 系统可用。一种类型的MST需要用蓝色或红色光谱中的荧光团标记。第二种系统依赖于紫外范围内芳香族氨基酸的固有荧光。这两个系统都检测分子的运动，以响应红外激光的局部热量感应。每种方法都有其优点和缺点。无标记的MST可以使用未标记的天然蛋白质;然而，许多分析物（包括药物）在紫外线范围内发出荧光，这可能会干扰准确KD值的测定。相比之下，标记的MST允许使用荧光标记的探针连接到配体上，在可见光范围内具有可测量的吸光度而不是紫外线，从而限制了来自分析物的干扰信号的可能性。
Introduction
微尺度热泳是一种相对较新的技术，用于确定生化相关配体之间的解离常数（KD）以及抑制常数（IC50）。MST 的领先商业零售商（例如 NanoTemper）提供两种流行的 MST 技术：1） 需要荧光标签的无标签 MST，以及 2） 使用蛋白质固有的荧光进行标记热泳，具体取决于每种蛋白质中存在的芳香族残基数量1。无标记热泳的缺点是，在大多数情况下，它不允许测量蛋白质 - 蛋白质相互作用。然而，有可能设计不含芳香族氨基酸的蛋白质，如色氨酸，用于无标记的热泳2。
MST测量粒子的运动，以响应红外激光引发的微观温度场的感应，在目前可用的技术中1。MST可用于测量蛋白质 - 蛋白质相互作用，蛋白质 - 脂质相互作用，蛋白质 - 小分子，竞争实验，甚至小分子之间的相互作用，只要可以产生足够的信号分离。此外，MST允许测量嵌入脂质体或纳米盘中的基于膜蛋白的相互作用。标记热泳利用荧光标记标签的使用，允许在配体和分析物之间以化学方式控制信号分离。KD值可以使用热泳获得涉及低纳摩尔浓度的蛋白质结合的相互作用，在大多数情况下，其蛋白质浓度远低于等温量热法（ITC）3。此外，MST 没有表面等离子体共振 （SPR）4 所需的严格缓冲要求，标记的热泳甚至可用于测量来自非完全纯化的蛋白质溶液5的结合常数与遗传插入的荧光标签6。MST 的一个缺点是，像 SPR2 中那样，MST 的动力学参数无法轻易获得。
热泳测量取决于溶液的局部温差。这种热量可以从红外激光器产生。MST设备具有耦合到红外（IR）束的荧光检测器，并且可以从红外激光瞄准点处荧光分子的局部浓度变化中拾取荧光的变化。MST设备利用红外靶向激光直接耦合到荧光检测器，该荧光检测器聚焦在溶液中产生热量的同一点。这允许可靠地检测与红外激光产生的热点处分子消耗相对应的温度变化。测量的荧光通常随着温度的升高而降低到更接近红外激光器的位置。因此测量的差异可能是由于多种因素引起的，包括电荷，大小或溶剂化熵。这些差异被测量为响应于热感应或分子从毛细管的热到冷部分的运动而引起的荧光变化。
当用给定的溶液加载毛细管时，重要的是将空气留在毛细管的两端，而不是将毛细管完全装满。商用毛细管可容纳约10μL溶液。只要将溶液操纵到毛细管的中心，就可以使用5μL溶液实现精确测量，没有气泡（在加载毛细管之前可能脱气），并且小心地加载机架，以免从毛细管中心推挤溶液，红外激光瞄准。如果激光器未与溶液完全接触，则结果很可能是该浓度的三个不可用输出之一：1）无或低荧光检测，2）更高的荧光检测（可能具有锯齿状峰值），或3）在给定滴定的其他值内进行荧光检测，但具有锯齿状和不圆润的峰。
对于标记的热泳，荧光信号最好高于200和低于2000个荧光单位7。MST器件使用从0到100的LED强度范围，可以选择该范围来实现高于200或低于2000的信号。或者，可以使用不同浓度的标记配体将荧光信号修改为最佳水平。在分析数据时，使用给定的 MST 测量值作为参考运行电容扫描非常重要，因为较差的电容扫描通常会导致稍后可能被确定为异常值的点。如果使用电容扫描测量单个MST功率，则每次运行应花费大约30分钟。商用设备允许更改 MST 电源。在较旧的软件版本中，这可以设置为0到100;在更高版本中，可以选择低，中或高MST。为了实现可靠的跟踪，研究人员可能需要尝试其中的每一个，并确定哪个 MST 设置为给定交互组件生成最可靠的数据。
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Protocol
1. 准备材料
- 制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）：137 mM NaCl，2.5 mM KCl，10 mM NaH2PO4和2 mM KH2PO4，pH 7.41。
- 制备NTA-Atto 647 N染料。将NTA-Atto 647 N染料从100%DMSO溶液稀释至100 nM，无吐温即可稀释到PBS中。
- Express Vam7-His8 – 蛋白质作为 大肠杆菌 中的融合蛋白，并使用Ni-NTA和尺寸排阻色谱法纯化8。
- 在PBS缓冲液中滴定分析物。如果分析物位于不同的缓冲液中，则标记的MST对与DMSO等分子的微小缓冲液差异不是特别敏感，除非分析物缓冲液的内容与标记的蛋白质相互作用。
2. MST 设备的准备
- 打开设备背面的电源开关。
- 打开控制软件，并确保笔记本电脑在连接到设备的计算机上处于打开和连接状态。
- 输入此实验的荧光和 MST 设置。将 MST 之前 设置为 3 秒， 将 MST 设置为 30 秒， 将荧光恢复（荧光） 设置为 1 秒后。在测量初始荧光之前，不需要很长时间;MST是热感应后达到平衡的实际时间量。
- 毛细管表：对于每个毛细管，输入靶标名称（配体）、配体名称（分析物）、靶标浓度、最高滴定浓度，并使用自动填充滴定比。例如，输入 50 nM 作为目标浓度的 Vam7-His8，输入 Vam7-His8 作为目标名称，输入（1，2-二辛酰基磷脂酸）Di-C8 PA 作为配体名称，以及配体选择 1：1 的最高浓度并向下拖动到自动填充槽 2-16。
- 运行 电容扫描 ，根据目标蛋白的信号选择合适的LED（20%LED（预设）），并在200和2000个荧光单位之间调整标记的MST。 瓶盖扫描 应显示均匀的圆形钟形峰。
- 选择一系列 MST 功效，并为每个功效输入值以测试最强的结合拟合，然后按 “开始电容扫描 + 测量”，扫描不同的值，以确定所测试的给定相互作用的最佳操作条件。
- 使用分析软件和 Tjump 热泳预设确定最佳拟合的 MST 功率。根据最低和最高浓度之间的大多数荧光分离分析拟合，与最佳拟合的MST功率进行比较，并选择MST功率进行重复试验。
- 通过转到分析软件并将分析切换到专家模式，确定在第一次运行和第二次运行之间是否发生了光漂白。接下来，选择荧光而不是热泳进行分析。选择专家模式，然后选择光漂白。
3. 用于标记MST的样品制备
- 将Vam7-His8溶液在PBS中的浓度提高到200 nM，不含吐温。
- 将 NTA-Atto 647 染料在 PBS 中加热至 100 nM，无需补间。
- 以1：1的体积比混合Vam7-His8和NTA-Atto 647染料，并在室温下被光覆盖30分钟。如第2.5节所示，确定目标蛋白的适当浓度（参见 关于Ni-NTA染料KD利用的补充，如视频所示）。
- 使用台式离心机将NTA-Atto 647 N染料和蛋白质混合物在黑暗的房间里以约8，161× g离心10分钟。
- 实验后将混合物储存在4°C或在实验期间储存在冰上，如果需要，可在几个小时内重复使用，以防止蛋白质变性。
- 使用NT浓度查找器确定滴定所需的浓度范围。
- 将 Di-C8 PA 在水中达到适当的最大浓度。
- 根据上一步，在PBS缓冲液中使用1：1连续稀释液滴定16种浓度。与SPR不同，热泳对缓冲液差异不那么敏感。
4. 样品的MST
- 打开设备和连接的笔记本电脑。
- 按机器正面的向上箭头，然后将毛细管机架滑出。
- 在机架中加载毛细管，在位置 1 处具有最高浓度。
- 在控制软件中，选择与 NTA-Atto 647 N 对应的红色通道。
- 在毛细管表中输入每个毛细管 的浓度、位置和名称信息。
- 通过以20%LED（预设） 按开始帽扫描 来运行毛细管扫描，并使用LED强度设置或配体（标记蛋白质）浓度根据200至2000个荧光单位进行调整。
- 选择 MST 电源范围。
- 开始 电容扫描 + MST 测量。
- 使用分析软件进行分析。
5. MST数据分析
注意：Nanotemper提供的分析软件是专有的，并使用M.O.亲和力分析执行。有不同的方法可以基于荧光或热泳测量结合亲和力。该软件的较新版本预设为使用热泳自动评估数据，并预设为使用热泳和Tjump利用这两种测量。或者，可以选择单独跳绳或单独热泳。此外，分析软件允许使用初始荧光估计亲和力测量。这些设置只能在专家模式下访问。
- 通过单击“数据选择”屏幕中数据集旁边的闪电框，将分析软件中的评估策略设置为专家。分析软件预设为分析到MST分析;但是，研究人员可以选择“创建新分析”并选择“初始荧光分析”，以便根据初始荧光估计结合亲和力。专家模式也可用于初始荧光。在下面描述的分析中，热泳和Tjump用于确定Vam7-His8及其天然底物脂质磷脂酸的KD。
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Representative Results
这是使用亲和力分析的示例输出。标记的MST用于确定Vam7-His8与其天然底物之一的可溶性二辛酰（DiC8）PA的结合常数9。图1显示了一次试验的热泳痕量，该试验从500μM开始对50 nM的Vam7-His8进行1：1滴定DiC8 PA。显示了初始荧光（红外激光打开前的时间）、跳跃（红外激光打开后最初的时间）和热泳（一旦粒子达到与温度的平衡）。人们可以仅从这些测量中的任何一个计算出KD，或者可以结合使用Thummp和热泳的组合来考虑其中两个测量值。
在图2中，显示了具有分析软件的Tjump输出的热泳的饱和曲线。如图2所示，可以从这些结果中绘制饱和曲线;但是，可能很难计算饱和曲线，因为 Fnorm 不是从零开始的。为了解决这个问题，可以手动规范化数据，或者将输出设置为分析软件确定的分数边界。通常，MST 结果使用对数刻度确定，如图 3 所示。分析软件自动计算账户蛋白质浓度，以便通过选择KD模型并输入蛋白质浓度来确定结合亲和力。也可以使用分析软件中的Hill模型，该模型不考虑蛋白质浓度，但可以潜在地给出给定相互作用的合作性度量。从分析软件导出输出并在第三方软件中绘图，可以获得如图3所示的KD测量值。应该注意的是，二辛酰甘油磷脂的临界胶束浓度（CMC）为>3mM，表明这些实验的运行率远低于CMC10。
图 1：Vam7-His8 到 DiC8 PA 的 MST 痕迹。 显示PA分析物到NTA-Atto 647N标记的Vam7-His8配体的痕量，在红色通道中测量。在打开红外激光之前，在室温下测量初始荧光5秒（A）。Tjump （B） 是在从内置红外激光器感应热量后的最初几秒钟内测量的，并测量在被测粒子的热泳运动之前首次打开红外激光时存在的荧光差异。热泳（C）是在分子从红外激光的热量引起的运动中平衡后测量的，由于诸如尺寸，电荷，溶剂化熵或相对于滴定分析物的颗粒的构象变化等因素引起的热泳运动差异。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：使用第三方软件从导出的 MST 结果确定的饱和绑定。 从分析软件导出的归一化荧光结果。使用特定于一个站点的绑定模型导出和绘制数据。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：使用乙状体模型将Vam7-His8与DiC8 PA结合。使用归一化 Fnorm [%] 分析从分析软件导出的图 1 中的导出数据。使用Graphpad Prism v.7使用Sigmoidal，4PL，X is log（浓度）模型绘制的DiC8 PA浓度与Fnorm的对数，允许拟合，导致KD为89±18.0μM，Vam7-His8与DiC8 PA的结合亲和力。请点击此处查看此图的放大版本。
补充文件。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
Vam7-His8结合DiC8-PA的测定为给定的相互作用提供了一个强大的拟合KD，其亲和力略低于Vam7-His8对PA脂质体的测量KD（未发表）。这种差异很可能是由于缺乏膜，这通常导致对膜特异性脂质结合相互作用的亲和力较低，因此证明了脂质体膜支架对这种相互作用的作用11。
为了进一步确定MST数据的强度，研究人员需要检查图1中迹线的形状以及迹线与所选分析方法的分离。从图1中的迹线来看，大多数浓度都产生了清晰的迹线，这是由曲线的热泳部分的趋平确定的。在某些情况下，对应于在荧光测量结束时含有较高浓度分析物的反应的痕量可能是由于样品粘附在样品毛细管上的聚集，这可以通过向缓冲液中添加Pluronic或Tween中的一种或两种来补救12。然而，诸如此类的洗涤剂可能不适合蛋白质 - 脂质相互作用13。为了测试这种类型的蛋白质 - 脂质相互作用的非特异性结合，可以添加BSA，增加盐浓度，或在缓冲液中使用甘油，并测试这是否影响估计的KD14，15。
分离由给定相互作用的最高和最低浓度测量值之间的Fnorm差确定。如图2所示，这种相互作用的分离大约为75个荧光单元。一般来说，应该实现至少5个荧光单元的分离，以自信地依赖未知化学亲和力测量的MST数据。如果在略低的分离度下实现了稳健的KD拟合，那么如果它与通过另一种技术（如SPR或ITC）使用的亲和力测量相对应，人们仍然可以考虑这些数据。
由于一些热泳迹线在样品中显示出一些粘性，因此为 图3 选择的输出是热泳与Tjump的组合。此设置是大多数更高版本的分析软件中的预选设置。 图3 显示了与Sigmoid结合亲和力模型的鲁棒拟合，因为12点1：1滴定法具有明显的饱和度。该器件允许在给定运行中获取16个点，并且许多交互需要所有这些点来实现强大的结合亲和力测量。为了获得更大的信心，该试验应用新的毛细管重复两次或更多次，该实验总共需要36个毛细管。此外，可以尝试另一种技术（如 SPR）来证实这些数据，以确保像我们之前所做的那样可靠地报告亲和常数8，16。
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Disclosures
作者声明没有潜在的利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了美国国家科学基金会（MCB 1818310）对英国皇家空军的资助。这项工作得到了H. Lee Moffitt癌症中心化学生物学核心设施/蛋白质晶体学部门（NIH / NCI：P30-CA076292）的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
| Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |
References
- Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
- Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, nP. Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains. Gene. 163 (1), 1-11 (1995).
- Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100 (2010).
- Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).
- Starr, M. L., et al. Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).
- Miner, G. L., et al. The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain. Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models. Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).
- Zhao, H., Lappalainen, P. A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions. Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).
- Kaufmann, S. H. Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents. Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).
- le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
- Corradi, V., et al.
- Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective. SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).
- Sparks, R. P., et al. A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion. Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).
