Summary
La thermophorèse à micro-échelle permet d’obtenir rapidement des constantes de liaison à faible coût matériel. La thermophorèse micro-échelle étiquetée ou sans étiquette est disponible dans le commerce; cependant, la thermophorèse sans étiquette n’est pas capable de la diversité des mesures d’interaction qui peuvent être effectuées à l’aide d’étiquettes fluorescentes. Nous fournissons un protocole pour les mesures de thermophorèse marquées.
Abstract
La capacité de déterminer l’affinité de liaison des lipides aux protéines est un élément essentiel de la compréhension des interactions protéine-lipide dans le trafic membranaire, la transduction du signal et le remodelage cytosquelettique. Les outils classiques pour mesurer de telles interactions comprennent la résonance plasmonique de surface (SPR) et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC). Bien qu’elles soient des outils puissants, ces approches présentent des revers. L’ITC nécessite de grandes quantités de protéines purifiées ainsi que des lipides, ce qui peut être coûteux et difficile à produire. De plus, l’ITC ainsi que le SPR prennent beaucoup de temps, ce qui pourrait augmenter considérablement le coût de la réalisation de ces expériences. Une façon de contourner ces restrictions est d’utiliser la technique relativement nouvelle de la thermophorèse à micro-échelle (MST). MST est rapide et rentable en utilisant de petites quantités d’échantillon pour obtenir une courbe de saturation pour un événement de liaison donné. Il existe actuellement deux types de systèmes MST disponibles. Un type de TMS nécessite un étiquetage avec un fluorophore dans le spectre bleu ou rouge. Le second système repose sur la fluorescence intrinsèque des acides aminés aromatiques dans la gamme UV. Les deux systèmes détectent le mouvement des molécules en réponse à l’induction localisée de la chaleur d’un laser infrarouge. Chaque approche a ses avantages et ses inconvénients. MST sans étiquette peut utiliser des protéines natives non marquées; cependant, de nombreux analytes, y compris les produits pharmaceutiques, fluorescent dans la gamme UV, ce qui peut interférer avec la détermination de valeurs KD précises. En comparaison, le MST marqué permet une plus grande diversité d’interactions mesurables par paires en utilisant des sondes marquées par fluorescence attachées à des ligands avec des absorbances mesurables dans la gamme visible par opposition aux UV, limitant le potentiel d’interférence des signaux des analytes.
Introduction
La thermophorèse à micro-échelle est une technique relativement nouvelle pour déterminer les constantes de dissociation (KD) ainsi que les constantes d’inhibition (IC50) entre les ligands biochimiquement pertinents. Le principal détaillant commercial de MST (par exemple, NanoTemper) propose deux technologies MST populaires : 1) MST sans étiquette nécessitant une étiquette fluorescente, et 2) thermophorèse marquée utilisant la fluorescence inhérente des protéines en fonction du nombre de résidus aromatiques présents dans chaque protéine1. Un inconvénient de la thermophorèse sans étiquette est que, dans la plupart des cas, elle ne permet pas de mesurer les interactions protéine-protéine. Cependant, il peut être possible de concevoir des protéines sans acides aminés aromatiques tels que le tryptophane pour une utilisation dans la thermophorèse sans étiquette2.
MST mesure le mouvement des particules en réponse à l’induction de champs de température microscopiques initiés par un laser infrarouge dans les technologies actuellement disponibles1. MST peut être utilisé pour mesurer les interactions protéine-protéine, les interactions protéine-lipide, la protéine-petite molécule, les expériences de compétition et même les interactions entre petites molécules tant que l’on peut produire suffisamment de séparation du signal. De plus, MST permet de mesurer les interactions membrane-protéine intégrées dans les liposomes ou les nanodisques. La thermophorèse marquée tire parti de l’utilisation d’étiquettes marquées par fluorescence permettant une séparation chimiquement contrôlable du signal entre le ligand et l’analyte. Les valeurs de KD peuvent être obtenues par thermophorèse pour les interactions impliquant la liaison aux protéines à de faibles concentrations nanomolaires, ce qui dans la plupart des cas est une concentration de protéines beaucoup plus faible que ce qui est nécessaire pour la calorimétrie isotherme (ITC)3. De plus, MST n’a pas d’exigences strictes en matière de tampon comme requis pour la résonance plasmonique de surface (SPR)4 et la thermophorèse marquée peut même être utilisée pour mesurer les constantes de liaison des protéines d’intérêt à partir de solutions protéiques non entièrement purifiées5 avec des étiquettes fluorescentes génétiquement insérées6. Un inconvénient de MST est que les paramètres cinétiques ne peuvent pas être obtenus facilement pour MST comme dans SPR2.
Les mesures de thermophorèse dépendent de la différence de température locale d’une solution. Cette chaleur peut être générée à partir d’un laser infrarouge. Le dispositif MST dispose d’un détecteur de fluorescence couplé à un faisceau infrarouge (IR) et peut détecter les changements de fluorescence à partir des changements de concentration locaux des molécules fluorescentes au point où le laser IR est ciblé. Le dispositif MST utilise un laser ciblé IR couplé directement à un détecteur de fluorescence focalisé au même point que la chaleur générée dans la solution. Cela permet une détection robuste des changements de température correspondant à l’épuisement des molécules au point de chaleur généré par le laser IR. La fluorescence mesurée diminue généralement plus près du laser IR en réponse à l’augmentation de la température. Les différences mesurées en conséquence peuvent être dues à plusieurs facteurs, notamment la charge, la taille ou l’entropie de solvatation. Ces différences sont mesurées comme des changements de fluorescence en réponse à l’induction de chaleur ou au mouvement de molécules des parties chaudes vers les parties plus froides du capillaire.
Lors du chargement d’un capillaire avec une solution donnée, il est important de laisser de l’air à chaque extrémité du capillaire et de ne pas charger complètement le capillaire. Le capillaire commercial contient environ 10 μL de solution. On peut obtenir des mesures précises avec 5 μL de solution tant que la solution est manipulée au centre du capillaire, qu’il n’y a pas de bulles d’air (potentiellement dégazées avant le chargement capillaire), et qu’on charge soigneusement le rack pour ne pas bousculer la solution du centre du capillaire, où le laser infrarouge est ciblé. Si le laser n’entre pas complètement en contact avec la solution, le résultat sera très probablement l’une des trois sorties inutilisables pour cette concentration: 1) détection de fluorescence nulle ou faible, 2) détection de fluorescence plus élevée (potentiellement avec pic déchiqueté), ou 3) détection de fluorescence dans d’autres valeurs à partir d’un titrage donné, mais avec un pic déchiqueté et non arrondi.
Pour la thermophorèse marquée, il est optimal d’avoir un signal de fluorescence supérieur à 200 et inférieur à 2000 unités de fluorescence7. L’appareil MST utilise une gamme d’intensités LED de 0 à 100, qui peuvent être sélectionnées pour obtenir un signal supérieur à 200 ou inférieur à 2000. Alternativement, on peut utiliser différentes concentrations du ligand marqué pour modifier le signal de fluorescence à un niveau optimal. Il est important d’exécuter un scan de capuchon avec une mesure MST donnée comme référence lors de l’analyse des données, car un mauvais scan de capuchon peut souvent entraîner un point qui peut être déterminé plus tard comme une valeur aberrante. Chaque exécution devrait prendre environ 30 minutes si vous mesurez une seule puissance MST avec un scan de capuchon. Les appareils commerciaux permettent des changements dans la puissance MST. Dans les anciennes versions du logiciel, cela pouvait être réglé de 0 à 100; et dans les versions ultérieures, on peut sélectionner un MST faible, moyen ou élevé. Pour obtenir des traces robustes, un chercheur peut avoir besoin d’essayer chacun d’entre eux et de décider quel paramètre MST donne les données les plus robustes pour une interaction donnée.
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Protocol
1. Préparation des matériaux
- Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) : 137 mM naCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 et 2 mM KH2PO4, pH 7,41.
- Préparez le colorant NTA-Atto 647 N. Diluer le colorant NTA-Atto 647 N à 100 nM d’une solution de DMSO à 100% dans du PBS sans interpolation.
- Express Vam7-His8 – Protéine en tant que protéine de fusion dans E. coli et purifier à l’aide de Ni-NTA et de chromatographie d’exclusion de taille8.
- Titrez l’analyte dans le tampon PBS. Si l’analyte se trouve dans un tampon différent, le MST marqué n’est pas particulièrement sensible aux différences de tampon mineures par rapport à des molécules telles que le DMSO, à moins que le contenu du tampon de l’analyte n’interagisse avec la protéine marquée.
2. Préparation du dispositif MST
- Allumez l’interrupteur d’alimentation à l’arrière de l’appareil.
- Ouvrez le logiciel de contrôle et assurez-vous que l’ordinateur portable est allumé et connecté sur l’ordinateur connecté à l’appareil.
- Entrez les paramètres de fluorescence et de MST pour cette expérience. Réglez MST Before sur 3 s, MST sur 30 s et Fluorescence recovery (Fluo.) après 1 s. Avant mesure la fluorescence initiale et ne nécessite pas de longs temps; MST est la durée réelle d’équilibre à atteindre après l’induction de la chaleur.
- Tableau des capillaires : Pour chaque tube capillaire, entrez le nom de la cible (ligand), le nom du ligand (analyte), la concentration de la cible et la concentration de titrage la plus élevée et utilisez le rapport de titrage automatique. Par exemple, entrez 50 nM pour la concentration cible de Vam7-His8, Vam7-His8 pour le nom de la cible, (acide phosphatidique 1,2-dioctanoïque) Di-C8 PA pour le nom du ligand, et la concentration la plus élevée le ligand sélectionnant 1:1 et faisant glisser vers le bas jusqu’aux emplacements de remplissage automatique 2-16.
- Exécutez un Cap Scan pour sélectionner la LED appropriée (LED à 20 % (préréglage)) en fonction du signal de la protéine cible et ajustez entre 200 et 2000 unités de fluorescence pour le MST marqué. Les scans de capuchon doivent montrer des pics arrondis uniformes en forme de cloche.
- Sélectionnez une plage de puissances MST et entrez des valeurs pour chacune d’elles afin de tester l’ajustement de liaison le plus robuste et appuyez sur Start Cap Scan + Measurement, en scannant différentes valeurs pour déterminer les meilleures conditions de fonctionnement pour une interaction donnée testée.
- Déterminez la puissance MST avec le meilleur ajustement à l’aide du logiciel d’analyse et du préréglage pour la thermophorèse avec Tjump. Analysez les ajustements en fonction de la plupart des séparations de fluorescence entre la concentration la plus faible et la plus élevée par rapport à la puissance MST avec le meilleur ajustement et sélectionnez la puissance MST pour les essais répliqués.
- Déterminez si le photoblanchiment s’est produit entre la première et la deuxième exécution en accédant au logiciel d’analyse et en passant l’analyse en mode expert. Ensuite, sélectionnez la fluorescence au lieu de la thermophorèse pour l’analyse. Sélectionnez le mode expert, puis le photoblanchiment.
3. Préparation des échantillons pour le MST étiqueté
- Amener la solution Vam7-His8 à une concentration de 200 nM dans PBS sans interpolation.
- Porter le colorant NTA-Atto 647 à 100 nM en PBS sans interpolation.
- Mélanger le colorant Vam7-His8 et NTA-Atto 647 à un rapport volumétrique de 1:1 et laisser reposer à température ambiante à couvert de lumière pendant 30 min. Déterminer la concentration appropriée de protéine cible comme indiqué à la rubrique 2.5 (voir supplément sur l’utilisation de KD du colorant Ni-NTA comme illustré dans la vidéo).
- Mélange centrifuge de colorant NTA-Atto 647 N et de protéines pendant 10 min dans une pièce sombre à l’aide d’une centrifugeuse de table à environ 8 161 x g.
- Conserver le mélange à 4 °C après l’expérience ou sur de la glace pendant l’expérience pour le réutiliser en quelques heures si nécessaire afin d’empêcher la dénaturation des protéines.
- Utilisez le détecteur de concentration NT pour déterminer la plage de concentration nécessaire au titrage.
- Amener di-C8 PA à une concentration maximale appropriée dans l’eau.
- Titrer l’analyte à l’aide d’une dilution en série de 1:1 dans un tampon PBS pour 16 concentrations en fonction de l’étape précédente. Contrairement à la SPR, la thermophorèse n’est pas aussi sensible aux différences de tampon.
4. TMS des échantillons
- Allumez l’appareil et l’ordinateur portable connecté.
- Appuyez sur la flèche vers le haut à l’avant de la machine et faites glisser le rack capillaire vers l’extérieur.
- Charger les capillaires dans le rack avec la concentration la plus élevée à la position 1.
- Dans le logiciel de contrôle, sélectionnez le canal rouge correspondant à NTA-Atto 647 N.
- Entrez les informations de concentration, de position et de nom pour chaque capillaire dans le tableau des capillaires.
- Exécutez un balayage capillaire en appuyant sur Démarrer le scan du capuchon à 20% de LED (préréglé) et ajustez en fonction de 200 à 2000 unités de fluorescence en utilisant les paramètres d’intensité de la LED ou la concentration de ligand (protéine étiquetée).
- Sélectionnez une plage de puissance MST.
- Démarrez Cap Scan + MST Measurement.
- Analysez à l’aide du logiciel d’analyse.
5. Analyse des données MST
REMARQUE: Le logiciel d’analyse fourni par Nanotemper est propriétaire et est effectué à l’aide de M.O. Affinity Analysis. Il existe différentes façons de mesurer les affinités de liaison en fonction de la fluorescence ou de la thermophorèse. Les versions plus récentes de ce logiciel sont préréglées pour évaluer automatiquement les données à l’aide de la thermophorèse et sont préréglées pour utiliser la thermophorèse avec Tjump en tirant parti des deux mesures. Alternativement, on peut sélectionner soit Tjump seul ou Thermophorèse seul. De plus, le logiciel d’analyse permet d’estimer les mesures d’affinité à l’aide de la fluorescence initiale. Ces paramètres ne sont accessibles qu’en mode expert.
- Définissez la stratégie d’évaluation dans le logiciel d’analyse sur expert en cliquant sur la case correspondant à l’éclair à côté d’un ensemble de données dans l’écran Sélection des données. Le logiciel d’analyse est préréglé pour analyser à mST Analysis; cependant, un chercheur peut sélectionner Créer une nouvelle analyse et sélectionner Analyse de fluorescence initiale afin d’estimer les affinités de liaison en fonction de la fluorescence initiale. Le mode Expert est également disponible pour la fluorescence initiale. Dans l’analyse décrite ci-dessous, la thermophorèse et le Tjump ont été utilisés pour déterminer la KD de la présentation de Vam7-His8 avec son substrat naturel, l’acide phosphatidique lipidique.
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Representative Results
Il s’agit d’un exemple de sortie utilisant l’analyse d’affinité. Le MST marqué a été utilisé pour déterminer la constante de liaison du Vam7-His8 au dioctanoyle soluble (DiC8) PA de l’un de ses substrats naturels9. La figure 1 présente les traces thermophorétiques d’un essai d’un titrage 1:1 de DiC8 PA à partir de 500 μM contre 50 nM de Vam7-His8. La fluorescence initiale (temps avant l’allumage du laser infrarouge), Tjump (temps initialement après l’allumage du laser infrarouge) et la thermophorèse (une fois que les particules atteignent l’équilibre avec la température) sont affichées. On peut calculer un KD à partir de l’une de ces mesures seules ou utiliser une combinaison de Tjump et de thermophorèse en tenant compte de deux de ces mesures.
Dans la figure 2, une courbe de saturation est montrée pour la thermophorèse avec sortie Tjump du logiciel d’analyse. Comme le montre la figure 2, la courbe de saturation peut être tracée à partir de ces résultats; cependant, il peut être difficile de calculer une courbe de saturation car Fnorm ne part pas de zéro. Afin de contourner ce problème, les données peuvent être normalisées manuellement ou la sortie peut être définie sur la limite de fraction déterminée par le logiciel d’analyse. En règle générale, les résultats MST sont déterminés à l’aide d’une échelle logarithmique, comme illustré à la figure 3. Le logiciel d’analyse prend automatiquement en compte la concentration en protéines afin de déterminer l’affinité de liaison en sélectionnant le modèle KD et en entrant la concentration en protéines. Le modèle de Hill dans le logiciel d’analyse peut également être utilisé, ce qui ne tient pas compte de la concentration en protéines, mais peut potentiellement donner une mesure de la coopérativité pour une interaction donnée. En exportant l’une ou l’autre sortie du logiciel d’analyse et en traçant dans un logiciel tiers, on peut obtenir une mesure KD comme illustré à la figure 3. Il convient de noter que la concentration micellaire critique (CMC) de glycérophospholipides de dioctanoyle est de >3 mM, ce qui indique que ces expériences fonctionnent bien en dessous du CMC10.
Figure 1 : Traces MST de Vam7-His8 à DiC8 PA. Des traces sont montrées pour l’analyte PA au ligand Vam7-His8 marqué NTA-Atto 647N mesuré dans le canal rouge. La fluorescence initiale a été mesurée à température ambiante pendant 5 s (A) avant d’allumer le laser infrarouge. Tjump (B) est mesuré dans les premières secondes suivant l’induction de la chaleur du laser infrarouge intégré et mesure les différences de fluorescence présentes lorsque le laser IR est allumé pour la première fois avant le mouvement thermophorétique des particules mesurées. La thermophorèse (C) est mesurée après que les molécules s’équilibrent à partir du mouvement induit par la chaleur du laser infrarouge en raison des différences de mouvement thermophorétique dues à des facteurs tels que la taille, la charge, l’entropie de solvatation ou le changement conformationnel des particules mesurées par rapport à l’analyte titré. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Liaison de saturation déterminée à partir des résultats MST exportés à l’aide d’un logiciel tiers. Résultats de fluorescence normalisés exportés à partir du logiciel d’analyse. Les données ont été exportées et tracées à l’aide d’un modèle de liaison spécifique à un site. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Affinité de liaison de Vam7-His8 à DiC8 PA à l’aide d’un modèle sigmoïdal. Analyse des données exportées de la figure 1 exportées à partir du logiciel d’analyse à l’aide de la norme de normalisation [%]. La prise du logarithme des concentrations de DiC8 PA tracées par rapport à Fnorm à l’aide de Graphpad Prism v.7 en utilisant le modèle Sigmoidal, 4PL, X is log(concentration) permet un ajustement qui se traduit par un KD de 89 ± 18,0 μM pour l’affinité de liaison Vam7-His8 à DiC8 PA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La détermination de Vam7-His8binding à DiC8-PA a fourni un KD ajusté robuste pour l’interaction donnée, qui est légèrement inférieure à la KD mesurée de Vam7-His8 aux liposomes PA (non publié). Cette différence est très probablement due à l’absence de membrane, ce qui entraîne généralement une affinité plus faible pour les interactions de liaison lipidique spécifiques à la membrane et démontre donc le rôle de l’échafaudage membranaire des liposomes dans cette interaction11.
Afin de déterminer davantage la force des données MST, un chercheur doit examiner à la fois la forme des traces de la figure 1 et la séparation des traces de la méthode d’analyse choisie. En regardant les traces de la figure 1, la plupart des concentrations ont abouti à une trace claire déterminée par le nivellement de la partie thermophorèse de la courbe. Dans certains cas, des traces correspondant à des réactions contenant des concentrations plus élevées d’analyte vers la fin de la mesure fluorescente pourraient être dues à l’agrégation dans l’adhérence de l’échantillon aux capillaires de l’échantillon, ce qui peut être corrigé par l’ajout de l’un ou l’autre ou des deux Pluronic ou Tween au tampon12. Cependant, de tels détergents peuvent ne pas convenir aux interactions protéine-lipide13. Pour tester la liaison non spécifique pour ce type d’interaction protéine-lipide, on peut ajouter du BSA, augmenter la concentration en sel ou utiliser du glycérol dans le tampon et tester si cela affecte le KD14,15 estimé.
La séparation est déterminée par la différence de Fnorm entre la mesure de concentration la plus élevée et la plus faible pour l’interaction donnée. Comme le montre la figure 2, la séparation pour cette interaction était d’environ 75 unités de fluorescence. D’une manière générale, une séparation d’au moins 5 unités de fluorescence doit être réalisée pour s’appuyer en toute confiance sur les données MST de mesures d’affinité chimique inconnues. Si un ajustement KD robuste est obtenu à une séparation légèrement inférieure, on pourrait être en mesure de toujours considérer ces données si elles correspondaient à des mesures d’affinité utilisées via une autre technique telle que SPR ou ITC.
Étant donné que certaines des traces thermophorétiques montraient une certaine adhérence dans l’échantillon, la sortie choisie pour la figure 3 était une combinaison de thermophorèse avec Tjump. Ce paramètre est le paramètre présélectionné dans la plupart des versions ultérieures du logiciel d’analyse. La figure 3 indique un ajustement robuste à un modèle d’affinité de liaison sigmoïdale car il y avait une saturation claire avec un titrage de 12 points 1:1. L’appareil permet de prendre 16 points dans une course donnée, et de nombreuses interactions nécessitent tous ces points pour obtenir une forte mesure d’affinité de liaison. Afin d’obtenir une plus grande confiance, cet essai doit être répété avec de nouveaux capillaires deux fois ou plus nécessitant un total de 36 tubes capillaires pour cette expérience. De plus, on pourrait essayer une autre technique telle que SPR pour corroborer ces données afin d’assurer un rapport fiable des constantes d’affinité comme nous l’avons fait précédemment8,16.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par une subvention de la National Science Foundation (MCB 1818310) à la RAF. Ce travail a été soutenu en partie par l’installation centrale de biologie chimique / unité de cristallographie des protéines du H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH / NCI: P30-CA076292).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
| Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |
References
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