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Biochemistry

प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को मापने के लिए माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस का उपयोग

Published: February 10, 2022 doi: 10.3791/60607
Automatic Translation
*1, *2, *1,3,4, 1,3,4, 1,3
1Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Chemistry, University of South Florida, 3Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois at Urbana-Champaign
* These authors contributed equally

Summary

माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस कम सामग्री लागत पर जल्दी से बाध्यकारी स्थिरांक प्राप्त करता है। या तो लेबल या लेबल मुक्त माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है; हालांकि, लेबल मुक्त थर्मोफोरेसिस इंटरैक्शन माप की विविधता में सक्षम नहीं है जिसे फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करके किया जा सकता है। हम लेबल थर्मोफोरेसिस माप के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

प्रोटीन के लिए लिपिड की बाध्यकारी आत्मीयता को निर्धारित करने की क्षमता झिल्ली तस्करी, सिग्नल ट्रांसडक्शन और साइटोस्केलेटल रीमॉडलिंग में प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को समझने का एक अनिवार्य हिस्सा है। इस तरह की बातचीत को मापने के लिए क्लासिक उपकरणों में सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर) और समतापी अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) शामिल हैं। जबकि शक्तिशाली उपकरण, इन दृष्टिकोणों में असफलताएं हैं। आईटीसी को बड़ी मात्रा में शुद्ध प्रोटीन के साथ-साथ लिपिड की आवश्यकता होती है, जो महंगा और उत्पादन करने में मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, आईटीसी के साथ-साथ एसपीआर भी बहुत समय लेने वाले हैं, जो इन प्रयोगों को करने की लागत में काफी जोड़ सकते हैं। इन प्रतिबंधों को बायपास करने का एक तरीका माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस (एमएसटी) की अपेक्षाकृत नई तकनीक का उपयोग करना है। एमएसटी किसी दिए गए बाध्यकारी घटना के लिए संतृप्ति वक्र प्राप्त करने के लिए नमूने की छोटी मात्रा का उपयोग करके तेज और लागत प्रभावी है। वर्तमान में दो प्रकार के एमएसटी सिस्टम उपलब्ध हैं। एक प्रकार के एमएसटी को नीले या लाल स्पेक्ट्रम में फ्लोरोफोर के साथ लेबलिंग की आवश्यकता होती है। दूसरी प्रणाली यूवी रेंज में सुगंधित अमीनो एसिड के आंतरिक प्रतिदीप्ति पर निर्भर करती है। दोनों प्रणालियां एक अवरक्त लेजर से गर्मी के स्थानीयकृत प्रेरण के जवाब में अणुओं के आंदोलन का पता लगाती हैं। प्रत्येक दृष्टिकोण के अपने फायदे और नुकसान हैं। लेबल मुक्त एमएसटी untagged देशी प्रोटीन का उपयोग कर सकते हैं; हालांकि, फार्मास्यूटिकल्स सहित कई analytes, यूवी रेंज में fluoresce, जो सटीक केडी मूल्यों के निर्धारण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसकी तुलना में, लेबल किए गए एमएसटी औसत दर्जे के युग्मवार इंटरैक्शन की अधिक विविधता की अनुमति देता है, जो यूवी के विपरीत दृश्यमान सीमा में मापने योग्य अवशोषण के साथ लिगेंड से जुड़े फ्लोरोसेंटली लेबल वाली जांच का उपयोग करता है, जो एनालिस्ट से संकेतों में हस्तक्षेप करने की क्षमता को सीमित करता है।

Introduction

माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस जैव रासायनिक रूप से प्रासंगिक लिगेंड के बीच असंबद्धता स्थिरांक (केडी) के साथ-साथ निषेध स्थिरांक (आईसी 50) को निर्धारित करने में एक अपेक्षाकृत नई तकनीक है। एमएसटी (जैसे, नैनोटेम्पर) के लिए अग्रणी वाणिज्यिक खुदरा विक्रेता दो लोकप्रिय एमएसटी प्रौद्योगिकियां प्रदान करता है: 1) लेबल मुक्त एमएसटी को फ्लोरोसेंट टैग की आवश्यकता होती है, और 2) प्रत्येक प्रोटीन में मौजूद सुगंधित अवशेषों की संख्या पर निर्भर प्रोटीन के अंतर्निहित प्रतिदीप्ति का उपयोग करके थर्मोफोरेसिस लेबल किया जाता है1। लेबल-मुक्त थर्मोफोरेसिस का एक नुकसान यह है कि ज्यादातर मामलों में, यह प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के माप के लिए अनुमति नहीं देता है। हालांकि, लेबल मुक्त थर्मोफोरेसिस 2 में उपयोग के लिए ट्रिप्टोफैन जैसे सुगंधित अमीनो एसिड के बिना प्रोटीन इंजीनियर करना संभव हो सकता है।

एमएसटी वर्तमान में उपलब्ध प्रौद्योगिकियों में एक अवरक्त लेजर द्वारा शुरू किए गए सूक्ष्म तापमान क्षेत्रों के प्रेरण के जवाब में कणों के आंदोलन को मापता है1। एमएसटी का उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन, प्रोटीन-छोटे अणु, प्रतियोगिता प्रयोगों और यहां तक कि छोटे अणुओं के बीच बातचीत को मापने के लिए किया जा सकता है जब तक कि कोई पर्याप्त संकेत पृथक्करण का उत्पादन कर सकता है। इसके अतिरिक्त, एमएसटी झिल्ली-प्रोटीन आधारित इंटरैक्शन के माप के लिए अनुमति देता है जो या तो लिपोसोम या नैनोडिस्क में एम्बेडेड होता है। लेबल थर्मोफोरेसिस फ्लोरोसेंटली लेबल वाले टैग के उपयोग का लाभ उठाता है जो लिगैंड और विश्लेषक के बीच सिग्नल के रासायनिक रूप से नियंत्रणीय पृथक्करण के लिए अनुमति देता है। कम नैनोमोलर सांद्रता में प्रोटीन बाइंडिंग से जुड़े इंटरैक्शन के लिए थर्मोफोरेसिस का उपयोग करके केडी मूल्यों को प्राप्त किया जा सकता है, जो ज्यादातर मामलों में समतापीय कैलोरीमेट्री (आईटीसी) 3 के लिए आवश्यक प्रोटीन की तुलना में प्रोटीन की बहुत कम एकाग्रता है। इसके अतिरिक्त, एमएसटी में सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर) 4 के लिए आवश्यक सख्त बफरिंग आवश्यकताएं नहीं हैं और लेबल किए गए थर्मोफोरेसिस का उपयोग आनुवंशिक रूप से डाले गए फ्लोरोसेंट टैग 6 के साथ गैर-पूरी तरह से शुद्ध प्रोटीन समाधान 5 से ब्याज के प्रोटीन के बाध्यकारी स्थिरांक को मापने के लिए भी किया जा सकता है। एमएसटी का एक नुकसान यह है कि एसपीआर 2 के रूप में एमएसटी के लिए गतिज पैरामीटर आसानी से प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं।

थर्मोफोरेसिस माप एक समाधान के स्थानीय तापमान अंतर पर निर्भर करता है। यह गर्मी एक अवरक्त लेजर से उत्पन्न की जा सकती है। एमएसटी डिवाइस में एक इन्फ्रारेड (आईआर) बीम के लिए युग्मित एक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर होता है और उस बिंदु पर फ्लोरोसेंट अणुओं के स्थानीय एकाग्रता परिवर्तनों से प्रतिदीप्ति में परिवर्तन उठा सकता है जहां आईआर लेजर को लक्षित किया जाता है। एमएसटी डिवाइस एक आईआर लक्षित लेजर का उपयोग करता है जो सीधे एक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर पर निर्भर करता है, जो उसी बिंदु पर केंद्रित होता है जिसमें समाधान में गर्मी उत्पन्न होती है। यह आईआर लेजर द्वारा उत्पन्न गर्मी के बिंदु पर अणुओं की कमी के अनुरूप तापमान में परिवर्तन का मजबूत पता लगाने की अनुमति देता है। मापा प्रतिदीप्ति आमतौर पर तापमान में वृद्धि के जवाब में आईआर लेजर के करीब कम हो जाता है। परिणामस्वरूप मापा गया अंतर आवेश, आकार, या सॉल्वेशन एन्ट्रॉपी सहित कई कारकों के कारण हो सकता है। इन अंतरों को केशिका के गर्म से ठंडे हिस्सों तक गर्मी के प्रेरण या अणुओं के आंदोलन के जवाब में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के रूप में मापा जाता है।

किसी दिए गए समाधान के साथ एक केशिका लोड करते समय, केशिका के दोनों छोर पर हवा छोड़ना और केशिका को पूरी तरह से पूर्ण रूप से लोड नहीं करना महत्वपूर्ण है। वाणिज्यिक केशिका में लगभग 10 μL समाधान होता है। कोई भी समाधान के 5 μL के साथ सटीक माप प्राप्त कर सकता है जब तक कि समाधान को केशिका के केंद्र में हेरफेर किया जाता है, तब तक कोई हवा के बुलबुले नहीं होते हैं (केशिका लोड करने से पहले संभावित रूप से डेगास), और एक सावधानीपूर्वक रैक को लोड करने के लिए केशिका के केंद्र से समाधान को धक्का नहीं देता है, जहां अवरक्त लेजर को लक्षित किया जाता है। यदि लेजर समाधान के साथ पूरी तरह से संपर्क में नहीं आता है, तो परिणाम सबसे अधिक संभावना है कि एकाग्रता के लिए तीन अनुपयोगी आउटपुट में से एक होगा: 1) कोई या कम प्रतिदीप्ति का पता लगाना, 2) उच्च प्रतिदीप्ति का पता लगाना (संभावित रूप से जकड़े हुए शिखर के साथ), या 3) दिए गए अनुमापन से अन्य मूल्यों के भीतर प्रतिदीप्ति का पता लगाना, लेकिन एक झुका हुआ और अनियंत्रित चोटी के साथ।

लेबल किए गए थर्मोफोरेसिस के लिए यह 200 से ऊपर और 2000 से नीचे प्रतिदीप्ति संकेत 7 के लिए इष्टतम है। एमएसटी डिवाइस 0 से 100 तक एलईडी तीव्रता की एक श्रृंखला का उपयोग करता है, जिसे 2000 से ऊपर या 2000 से नीचे के सिग्नल को प्राप्त करने के लिए चुना जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कोई भी इष्टतम स्तर पर प्रतिदीप्ति संकेत को संशोधित करने के लिए लेबल किए गए लिगैंड की विभिन्न सांद्रता का उपयोग कर सकता है। डेटा का विश्लेषण करते समय संदर्भ के रूप में दिए गए एमएसटी माप के साथ एक कैप स्कैन चलाना महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक खराब कैप स्कैन अक्सर एक बिंदु में परिणाम कर सकता है जिसे बाद में एक बाहरी होने के लिए निर्धारित किया जा सकता है। प्रत्येक रन को लगभग 30 मिनट लगना चाहिए यदि कैप स्कैन के साथ एक एकल एमएसटी शक्ति को मापना। वाणिज्यिक उपकरण MST शक्ति में परिवर्तन की अनुमति देते हैं। पुराने सॉफ़्टवेयर संस्करणों में इसे 0 से 100 तक सेट किया जा सकता है; और बाद के संस्करणों में एक कम, मध्यम, या उच्च एमएसटी का चयन कर सकते हैं। मजबूत निशान प्राप्त करने के लिए, एक शोधकर्ता को इनमें से प्रत्येक को आज़माने की आवश्यकता हो सकती है और यह तय करना पड़ सकता है कि किसी दिए गए इंटरैक्शन के लिए सबसे मजबूत डेटा में कौन सा एमएसटी सेटिंग परिणाम है।

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Protocol

1. सामग्री की तैयारी

  1. फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (PBS) तैयार करें: 137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, और 2 mM KH2PO4, pH 7.41.
  2. NTA-Atto 647 N डाई तैयार करें। तनु स्टॉक NTA-Atto 647 एन डाई करने के लिए 100 nM करने के लिए एक 100% DMSO समाधान से PBS में Tween के बिना.
  3. Vam7-His8 व्यक्त करें - ई कोलाई में एक संलयन प्रोटीन के रूप में प्रोटीन और Ni-NTA और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी 8 का उपयोग करके शुद्ध करें।
  4. पीबीएस बफर में विश्लेषक titrate. यदि विश्लेषक एक अलग बफर में है, तो लेबल किया गया एमएसटी विशेष रूप से डीएमएसओ जैसे अणुओं से मामूली बफर अंतर के प्रति संवेदनशील नहीं है, जब तक कि विश्लेषक बफर की सामग्री लेबल प्रोटीन के साथ बातचीत नहीं करती है।

2. एमएसटी डिवाइस की तैयारी

  1. डिवाइस के पीछे पावर स्विच चालू करें।
  2. नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें और सुनिश्चित करें कि लैपटॉप डिवाइस से जुड़े कंप्यूटर पर और कनेक्टेड स्थिति में है।
  3. इस प्रयोग के लिए प्रतिदीप्ति और एमएसटी सेटिंग्स दर्ज करें। 3 s से पहले एमएसटी सेट करें, 30 s पर MST, और 1 s के बाद प्रतिदीप्ति वसूली (Fluo.) प्रारंभिक प्रतिदीप्ति को मापने से पहले और लंबे समय तक आवश्यकता नहीं होती है; एमएसटी गर्मी प्रेरण के बाद संतुलन तक पहुंचने के लिए समय की वास्तविक मात्रा है।
  4. केशिकाओं की तालिका: प्रत्येक केशिका ट्यूब के लिए, लक्ष्य (लिगैंड), लिगैंड (विश्लेषक) का नाम, लक्ष्य की एकाग्रता, और उच्चतम अनुमापन एकाग्रता का नाम दर्ज करें और ऑटोफिल अनुमापन अनुपात का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, Vam7-His8 के लक्ष्य एकाग्रता के लिए 50 nM दर्ज करें, लक्ष्य नाम के लिए Vam7-His8, (1,2-dioctanoyl फॉस्फेटिडिक एसिड) लिगैंड नाम के लिए Di-C8 PA, और उच्चतम एकाग्रता लिगैंड 1: 1 का चयन करता है और ऑटोफिल स्लॉट 2-16 तक नीचे खींचता है।
  5. लक्ष्य प्रोटीन के संकेत के आधार पर उपयुक्त एलईडी (20% एलईडी (प्रीसेट)) का चयन करने के लिए एक कैप स्कैन चलाएं और लेबल किए गए एमएसटी के लिए 200 और 2000 प्रतिदीप्ति इकाइयों के बीच समायोजित करें। कैप स्कैन को एक समान गोल घंटी के आकार की चोटियों को दिखाना चाहिए।
  6. एमएसटी शक्तियों की एक श्रृंखला का चयन करें और सबसे मजबूत बाध्यकारी फिट के लिए परीक्षण करने के लिए प्रत्येक के लिए मान दर्ज करें और स्टार्ट कैप स्कैन + मापन को हिट करें, परीक्षण किए जा रहे इंटरैक्शन के लिए सर्वोत्तम ऑपरेटिंग स्थितियों को निर्धारित करने के लिए विभिन्न मूल्यों को स्कैन करें।
  7. विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सबसे अच्छा फिट के साथ एमएसटी शक्ति निर्धारित करें और Tjump के साथ थर्मोफोरेसिस के लिए पूर्व निर्धारित करें। विश्लेषण सबसे अच्छा फिट के साथ एमएसटी शक्ति की तुलना में सबसे कम और उच्चतम एकाग्रता के बीच सबसे अधिक प्रतिदीप्ति अलगाव के अनुसार फिट बैठता है और परीक्षणों को दोहराने के लिए एमएसटी शक्ति का चयन करें।
  8. निर्धारित करें कि क्या विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पर जाकर और विश्लेषण को विशेषज्ञ मोड में स्विच करके पहले और दूसरे रन के बीच फोटोब्लीचिंग हुई है। अगला, विश्लेषण के लिए थर्मोफोरेसिस के बजाय प्रतिदीप्ति का चयन करें। विशेषज्ञ मोड का चयन करें और फिर photobleaching.

3. लेबल एमएसटी के लिए नमूनों की तैयारी

  1. Tween के बिना PBS में 200 nM की एकाग्रता के लिए Vam7-His8 समाधान लाओ।
  2. NTA-Atto 647 डाई को Tween के बिना PBS में 100 nM पर लाएं।
  3. Vam7-His8 और NTA-Atto 647 डाई को 1: 1 वॉल्यूमेट्रिक अनुपात में मिलाएं और 30 मिनट के लिए प्रकाश से कवर किए गए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति दें। अनुभाग 2.5 के रूप में लक्ष्य प्रोटीन की उपयुक्त एकाग्रता निर्धारित करें (वीडियो में प्रदर्शित के रूप में Ni-NTA डाई के केडी के उपयोग पर पूरक देखें )।
  4. लगभग 8,161 x g पर एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके एक अंधेरे कमरे में 10 मिनट के लिए NTA-Atto 647 N डाई और प्रोटीन का सेंट्रीफ्यूज मिश्रण।
  5. प्रयोग के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर या प्रयोग के दौरान बर्फ पर मिश्रण को स्टोर करें, यदि आवश्यक हो तो कुछ घंटों के भीतर पुन: उपयोग के लिए प्रोटीन को विकृत करने से रोकने के लिए।
  6. अनुमापन के लिए आवश्यक एकाग्रता श्रेणी निर्धारित करने के लिए NT एकाग्रता खोजक का उपयोग करें।
  7. पानी में उपयुक्त अधिकतम एकाग्रता के लिए Di-C8 PA लाओ।
  8. पिछले चरण के आधार पर 16 सांद्रता के लिए पीबीएस बफर में 1: 1 सीरियल कमजोर पड़ने का उपयोग करके विश्लेषक को टाइटरेट करें। एसपीआर के विपरीत, थर्मोफोरेसिस बफर मतभेदों के प्रति संवेदनशील नहीं है।

4. नमूनों के एमएसटी

  1. डिवाइस और संलग्न लैपटॉप को चालू करें।
  2. मशीन के सामने पर ऊपर तीर दबाएँ और केशिका रैक बाहर स्लाइड.
  3. स्थिति 1 पर उच्चतम एकाग्रता के साथ रैक में केशिकाओं को लोड करें।
  4. नियंत्रण सॉफ़्टवेयर में, NTA-Atto 647 N के अनुरूप लाल चैनल का चयन करें.
  5. केशिकाओं की तालिका में प्रत्येक केशिका के लिए एकाग्रता, स्थिति और नाम जानकारी दर्ज करें.
  6. 20% एलईडी (प्रीसेट) पर स्टार्ट कैप स्कैन को मारकर एक केशिका स्कैन चलाएं और एलईडी तीव्रता सेटिंग्स या लिगैंड (लेबल प्रोटीन) की एकाग्रता का उपयोग करके 200 और 2000 प्रतिदीप्ति इकाइयों के बीच समायोजित करें।
  7. MST पावर की श्रेणी का चयन करें.
  8. कैप स्कैन + एमएसटी माप प्रारंभ करें।
  9. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण करें।

5. एमएसटी डेटा का विश्लेषण

नोट:: Nanotemper द्वारा प्रदान किए गए विश्लेषण सॉफ़्टवेयर मालिकाना है और M.O. Affinity Analysis का उपयोग कर किया जाता है। या तो प्रतिदीप्ति या थर्मोफोरेसिस के आधार पर बाध्यकारी संबंधों को मापने के विभिन्न तरीके हैं। इस सॉफ़्टवेयर के नए संस्करणों को स्वचालित रूप से थर्मोफोरेसिस का उपयोग करके डेटा का मूल्यांकन करने के लिए पूर्व निर्धारित किया गया है और दोनों मापों का लाभ उठाते हुए Tjump के साथ थर्मोफोरेसिस का उपयोग करने के लिए पूर्व निर्धारित किया गया है। वैकल्पिक रूप से, कोई भी अकेले Tjump या अकेले थर्मोफोरेसिस का चयन कर सकता है। इसके अतिरिक्त, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर प्रारंभिक प्रतिदीप्ति का उपयोग करके अनुमानित आत्मीयता माप की अनुमति देता है। इन सेटिंग्स को केवल विशेषज्ञ मोड में एक्सेस किया जा सकता है।

  1. डेटा चयन स्क्रीन में डेटा सेट के आगे बिजली बोल्ट के लिए बॉक्स पर क्लिक करके विशेषज्ञ के लिए विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में मूल्यांकन रणनीति सेट करें। विश्लेषण सॉफ़्टवेयर MST विश्लेषण करने के लिए विश्लेषण करने के लिए पूर्व निर्धारित है; हालांकि, एक शोधकर्ता नया विश्लेषण बनाएँ का चयन कर सकता है और प्रारंभिक प्रतिदीप्ति के आधार पर बाध्यकारी संबंधों का अनुमान लगाने के लिए प्रारंभिक प्रतिदीप्ति विश्लेषण का चयन कर सकता है। विशेषज्ञ मोड भी प्रारंभिक प्रतिदीप्ति के लिए उपलब्ध है। नीचे वर्णित विश्लेषण में, थर्मोफोरेसिस और टजुम्प का उपयोग अपने प्राकृतिक सब्सट्रेट, लिपिड फॉस्फेटिडिक एसिड के साथ Vam7-His8 के प्रस्तुत केडी को निर्धारित करने के लिए किया गया था।

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Representative Results

यह आत्मीयता विश्लेषण का उपयोग करके एक नमूना आउटपुट है। लेबल किए गए एमएसटी का उपयोग Vam7-His8 के बाध्यकारी स्थिरांक को इसके प्राकृतिक सब्सट्रेट्स 9 में से एक के घुलनशील डायोक्टानोयल (DiC8) पीए के लिए निर्धारित करने के लिए किया गया था। चित्रा 1 एक 1: 1 DiC8 PA के अनुमापन के एक परीक्षण से thermophoretic निशान प्रस्तुत करता है 500 μM पर Vam7-His8 के 50 nM के खिलाफ शुरू. प्रारंभिक प्रतिदीप्ति (अवरक्त लेजर चालू होने से पहले का समय), Tjump (शुरू में अवरक्त लेजर चालू होने के बाद का समय), और थर्मोफोरेसिस (एक बार कण तापमान के साथ संतुलन तक पहुंचने के बाद) दिखाए जाते हैं। कोई अकेले इन मापों में से किसी एक से केडी की गणना कर सकता है या इनमें से दो मापों पर विचार करते हुए टजुम्प और थर्मोफोरेसिस के संयोजन का उपयोग कर सकता है।

चित्रा 2 में, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से Tjump आउटपुट के साथ थर्मोफोरेसिस के लिए एक संतृप्ति वक्र दिखाया गया है। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, संतृप्ति वक्र को इन परिणामों से प्लॉट किया जा सकता है; हालांकि, संतृप्ति वक्र की गणना करना मुश्किल हो सकता है क्योंकि Fnorm शून्य से शुरू नहीं होता है। इस समस्या को हल करने के लिए, डेटा मैन्युअल रूप से सामान्यीकृत किया जा सकता है, या आउटपुट विश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्धारित अंश-बाउंड पर सेट किया जा सकता है। आम तौर पर, MST परिणाम एक लॉग-स्केल का उपयोग करके निर्धारित किए जाते हैं जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है। विश्लेषण सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से केडी मॉडल का चयन करके और प्रोटीन एकाग्रता को इनपुट करके बाध्यकारी आत्मीयता निर्धारित करने के लिए खाता प्रोटीन एकाग्रता के लिए खाता है। विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में हिल मॉडल का भी उपयोग किया जा सकता है, जो प्रोटीन एकाग्रता पर विचार नहीं करता है, लेकिन संभावित रूप से किसी दिए गए इंटरैक्शन के लिए कूपरेटिविटी का एक उपाय दे सकता है। विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से या तो आउटपुट निर्यात करना और तीसरे पक्ष के सॉफ़्टवेयर में प्लॉट करना, कोई भी केडी माप प्राप्त कर सकता है जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि डायोक्टानोयल ग्लिसरोफॉस्फोलिपिड्स की महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) >3 एमएम है, यह दर्शाता है कि ये प्रयोग सीएमसी 10 से बहुत नीचे काम कर रहे हैं।

Figure 1
चित्रा 1: Vam7-His8 के एमएसटी निशान DiC8 PA करने के लिए. निशान NTA-Atto 647N लेबल Vam7-His8 लिगैंड लाल चैनल में मापा करने के लिए पीए विश्लेषक के लिए दिखाया गया है। प्रारंभिक प्रतिदीप्ति को अवरक्त लेजर को चालू करने से पहले 5 एस (ए) के लिए कमरे के तापमान पर मापा गया था। Tjump (बी) को अंतर्निहित अवरक्त लेजर से गर्मी के प्रेरण के बाद प्रारंभिक सेकंड में मापा जाता है और जब आईआर लेजर को पहली बार मापा जा रहा है तो आईआर लेजर को मापा जा रहा है, तो कणों के थर्मोफोरेटिक आंदोलन से पहले प्रतिदीप्ति अंतर को चालू किया जाता है। थर्मोफोरेसिस (सी) को मापा जाता है जब अणुओं को अवरक्त लेजर से गर्मी से प्रेरित आंदोलन से संतुलित किया जाता है, जो आकार, चार्ज, सॉल्वेशन एन्ट्रॉपी, या कण के संरचनात्मक परिवर्तन जैसे कारकों के कारण थर्मोफोरेटिक गति अंतर के कारण होता है, जिसे टिट्रेड विश्लेषक के संबंध में मापा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: संतृप्ति बाइंडिंग तृतीय पक्ष सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर निर्यात किए गए MST परिणामों से निर्धारित किया गया है। विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से निर्यात किए गए सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति परिणाम. डेटा को निर्यात किया गया था और एक-साइट विशिष्ट बाइंडिंग मॉडल का उपयोग करके प्लॉट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक अवग्रह मॉडल का उपयोग कर DiC8 PA के लिए Vam7-His8 की बाध्यकारी आत्मीयता। सामान्यीकरण Fnorm [%] का उपयोग करके विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से निर्यात किए गए चित्र1 से निर्यात किए गए डेटा का विश्लेषण। DiC8 PA की सांद्रता के लॉग को लेते हुए Graphpad प्रिज्म v.7 का उपयोग करके Fnorm के खिलाफ प्लॉट किया गया है, जो सिग्मोइडल, 4PL का उपयोग करके, X लॉग (एकाग्रता) मॉडल है जो 89 ± 18.0 μM के KD में परिणाम देता है Vam7-His8 बाध्यकारी आत्मीयता के लिए DiC8 PA के लिए बाध्यकारी आत्मीयता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें. 

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Discussion

DiC8-PA के लिए Vam7-His8binding के निर्धारण ने दिए गए इंटरैक्शन के लिए एक मजबूत फिट केडी प्रदान किया, जो पीए लिपोसोम (अप्रकाशित) के लिए Vam7-His8 के मापा केडी की तुलना में थोड़ा कम आत्मीयता है। यह अंतर एक झिल्ली की कमी के कारण सबसे अधिक संभावना है, जिसके परिणामस्वरूप आमतौर पर झिल्ली विशिष्ट लिपिड बाइंडिंग इंटरैक्शन के लिए कम आत्मीयता होती है और इसलिए इस इंटरैक्शन 11 के लिए लिपोसोम झिल्ली पाड़ के लिए भूमिका को दर्शाता है।

एमएसटी डेटा की ताकत को और निर्धारित करने के लिए, एक शोधकर्ता को चित्रा 1 से निशान के आकार और चुनी गई विश्लेषण विधि से निशान के अलगाव दोनों की जांच करने की आवश्यकता होती है। चित्रा 1 से निशान को देखते हुए, अधिकांश सांद्रता के परिणामस्वरूप वक्र के थर्मोफोरेसिस भाग के समतलीकरण द्वारा निर्धारित एक स्पष्ट ट्रेस हुआ। कुछ उदाहरणों में फ्लोरोसेंट माप के अंत की ओर विश्लेषक की उच्च सांद्रता वाली प्रतिक्रियाओं के अनुरूप निशान नमूना केशिकाओं के लिए नमूना पालन में एकत्रीकरण के कारण हो सकते हैं, जिसे बफर 12 के लिए प्लुरोनिक या ट्वीन दोनों के परिवर्धन द्वारा ठीक किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह के डिटर्जेंट प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन 13 के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं। इस प्रकार के प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन के लिए गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के लिए परीक्षण करने के लिए कोई बीएसए में जोड़ सकता है, नमक एकाग्रता बढ़ा सकता है, या बफर में ग्लिसरॉल का उपयोग कर सकता है और परीक्षण कर सकता है कि क्या यह अनुमानित केडी 14,15 को प्रभावित करता है।

पृथक्करण दिए गए इंटरैक्शन के लिए उच्चतम और सबसे कम एकाग्रता माप के बीच Fnorm में अंतर द्वारा निर्धारित किया जाता है। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, इस बातचीत के लिए अलगाव लगभग 75 प्रतिदीप्ति इकाइयां थीं। आम तौर पर, बोलते हुए, कम से कम 5 प्रतिदीप्ति इकाइयों का पृथक्करण अज्ञात रासायनिक आत्मीयता माप के एमएसटी डेटा पर आत्मविश्वास से भरोसा करने के लिए प्राप्त किया जाना चाहिए। यदि एक मजबूत केडी फिट को थोड़ा कम अलगाव पर प्राप्त किया जाता है, तो कोई भी अभी भी इस तरह के डेटा पर विचार करने में सक्षम हो सकता है यदि यह एसपीआर या आईटीसी जैसी किसी अन्य तकनीक के माध्यम से उपयोग किए जाने वाले आत्मीयता माप से मेल खाता है।

क्योंकि थर्मोफोरेटिक निशान में से कुछ ने नमूने में कुछ चिपचिपाहट दिखाई, चित्रा 3 के लिए चुना गया आउटपुट Tjump के साथ थर्मोफोरेसिस का एक संयोजन था। यह सेटिंग विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के अधिकांश बाद के संस्करणों में पूर्व-चयनित सेटिंग है. चित्रा 3 एक सिग्मोइडल बाइंडिंग एफ़िनिटी मॉडल के लिए एक मजबूत फिट को इंगित करता है क्योंकि 12 बिंदु 1: 1 अनुमापन के साथ स्पष्ट संतृप्ति थी। डिवाइस एक दिए गए रन में 16 अंक लेने की अनुमति देता है, और कई इंटरैक्शन को एक मजबूत बाध्यकारी आत्मीयता माप प्राप्त करने के लिए इन सभी बिंदुओं की आवश्यकता होती है। अधिक आत्मविश्वास प्राप्त करने के लिए, इस परीक्षण को इस प्रयोग के लिए कुल 36 केशिका ट्यूबों की आवश्यकता के लिए दो या दो से अधिक बार नए केशिकाओं के साथ दोहराया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, कोई भी इस डेटा की पुष्टि करने के लिए एसपीआर जैसी एक और तकनीक की कोशिश कर सकता है ताकि आत्मीयता स्थिरांक की विश्वसनीय रिपोर्टिंग सुनिश्चित की जा सके जैसा कि हमने पहले किया है 8,16।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के किसी भी संभावित संघर्ष की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एमसीबी 1818310) से आरएएफ को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को एच ली मोफिट कैंसर सेंटर (एनआईएच / एनसीआई: पी 30-सीए076292) में रासायनिक जीव विज्ञान कोर सुविधा / प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी यूनिट द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye GE Healthcare PA23031 For protein labeleing
Graphpad Prsim Graphpad software
Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) Nanotemper MO-K022 Capillaries for MST
Monolith NT.115 machine Nanotemper University equipment
NTA-Atto 647 N Sigma 2175 label for His tags
Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) Echelon P-3008 Lipid for binding experiments

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References

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जैव रसायन अंक 180 Phosphoinositide फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 3-फॉस्फेट FYVE डोमेन रिक्तिका लाइसोसोम एंडोसोम
प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को मापने के लिए माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस का उपयोग
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Sparks, R. P., Lawless, W., Arango,… More

Sparks, R. P., Lawless, W., Arango, A. S., Tajkhorshid, E., Fratti, R. A. Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions. J. Vis. Exp. (180), e60607, doi:10.3791/60607 (2022).

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