Summary
La termoforesi su microscala ottiene rapidamente costanti di legame a basso costo del materiale. La termoforesi su microscala etichettata o senza etichetta è disponibile in commercio; tuttavia, la termoforesi senza etichette non è in grado di gestire la diversità delle misurazioni di interazione che possono essere eseguite utilizzando etichette fluorescenti. Forniamo un protocollo per le misure di termoforesi etichettate.
Abstract
La capacità di determinare l'affinità di legame dei lipidi alle proteine è una parte essenziale della comprensione delle interazioni proteina-lipidi nel traffico di membrana, nella trasduzione del segnale e nel rimodellamento citoscheletrico. Gli strumenti classici per misurare tali interazioni includono la risonanza plasmonica di superficie (SPR) e la calorimetria isotermica a titolazione (ITC). Sebbene strumenti potenti, questi approcci hanno battute d'arresto. ITC richiede grandi quantità di proteine purificate e lipidi, che possono essere costosi e difficili da produrre. Inoltre, ITC e SPR richiedono molto tempo, il che potrebbe aumentare significativamente il costo di esecuzione di questi esperimenti. Un modo per aggirare queste restrizioni è utilizzare la tecnica relativamente nuova della termoforesi su microscala (MST). MST è veloce ed economico utilizzando piccole quantità di campione per ottenere una curva di saturazione per un determinato evento di legame. Attualmente sono disponibili due tipi di sistemi MST. Un tipo di MST richiede l'etichettatura con un fluoroforo nello spettro blu o rosso. Il secondo sistema si basa sulla fluorescenza intrinseca degli amminoacidi aromatici nella gamma UV. Entrambi i sistemi rilevano il movimento delle molecole in risposta all'induzione localizzata del calore da un laser a infrarossi. Ogni approccio ha i suoi vantaggi e svantaggi. L'MST senza etichetta può utilizzare proteine native senza tag; tuttavia, molti analiti, compresi i prodotti farmaceutici, fluoresceno nell'intervallo UV, il che può interferire con la determinazione di valori KD accurati. In confronto, l'MST etichettato consente una maggiore diversità di interazioni misurabili a coppie utilizzando sonde marcate fluorescenti attaccate a ligandi con assorbanze misurabili nell'intervallo visibile rispetto ai raggi UV, limitando il potenziale di interferenza dei segnali dagli analiti.
Introduction
La termoforesi su microscala è una tecnica relativamente nuova nel determinare le costanti di disassociazione (KD) e le costanti di inibizione (IC50) tra ligandi biochimicamente rilevanti. Il principale rivenditore commerciale di MST (ad esempio, NanoTemper) offre due tecnologie MST popolari: 1) MST senza etichetta che richiede un tag fluorescente e 2) termoforesi etichettata utilizzando la fluorescenza intrinseca delle proteine dipendente dal numero di residui aromatici presenti in ciascuna proteina1. Uno svantaggio della termoforesi senza etichetta è che nella maggior parte dei casi non consente la misurazione delle interazioni proteina-proteina. Tuttavia, potrebbe essere possibile progettare proteine senza aminoacidi aromatici come il triptofano per l'uso nella termoforesi senza etichette2.
MST misura il movimento delle particelle in risposta all'induzione di campi di temperatura microscopici avviati da un laser a infrarossi nelle tecnologie attualmente disponibili1. MST può essere utilizzato per misurare le interazioni proteina-proteina, le interazioni proteina-lipide, proteina-piccola molecola, esperimenti di competizione e persino interazioni tra piccole molecole purché si possa produrre una sufficiente separazione del segnale. Inoltre, MST consente la misurazione di interazioni basate su membrana-proteina incorporate in liposomi o nanodischi. La termoforesi etichettata sfrutta l'uso di tag etichettati fluorescentemente che consentono la separazione chimicamente controllabile del segnale tra ligando e analita. I valori di KD possono essere ottenuti utilizzando la termoforesi per interazioni che coinvolgono il legame proteico a basse concentrazioni nanomolari, che nella maggior parte dei casi è una concentrazione di proteine molto più bassa di quella richiesta per la calorimetria isotermica (ITC)3. Inoltre, mST non ha severi requisiti di buffering come richiesto per la risonanza plasmonica di superficie (SPR)4 e la termoforesi etichettata può anche essere utilizzata per misurare costanti di legame di proteine di interesse da soluzioni proteiche non completamente purificate5 con tag fluorescenti inseriti geneticamente6. Uno svantaggio di MST è che i parametri cinetici non possono essere ottenuti facilmente per MST come in SPR2.
Le misurazioni della termoforesi dipendono dalla differenza di temperatura locale di una soluzione. Questo calore può essere generato da un laser a infrarossi. Il dispositivo MST ha un rilevatore di fluorescenza accoppiato a un raggio infrarosso (IR) e può rilevare i cambiamenti di fluorescenza dai cambiamenti di concentrazione locali delle molecole fluorescenti nel punto in cui è mirato il laser IR. Il dispositivo MST utilizza un laser mirato IR accoppiato direttamente a un rilevatore di fluorescenza focalizzato nello stesso punto in cui il calore viene generato nella soluzione. Ciò consente un rilevamento robusto delle variazioni di temperatura corrispondenti all'esaurimento delle molecole nel punto di calore generato dal laser IR. La fluorescenza misurata generalmente diminuisce più vicino al laser IR in risposta agli aumenti di temperatura. Le differenze misurate di conseguenza possono essere dovute a molteplici fattori tra cui carica, dimensione o entropia di solvatazione. Queste differenze sono misurate come cambiamenti nella fluorescenza in risposta all'induzione del calore o al movimento delle molecole dalle parti calde a quelle più fredde del capillare.
Quando si carica un capillare con una determinata soluzione, è importante lasciare aria a entrambe le estremità del capillare e non caricare il capillare completamente pieno. Il capillare commerciale contiene circa 10 μL di soluzione. Si possono ottenere misurazioni accurate con 5 μL di soluzione purché la soluzione sia manipolata al centro del capillare, non ci siano bolle d'aria (potenzialmente degas prima del caricamento capillare), e si è attenti a caricare il rack per non spingere la soluzione dal centro del capillare, dove è mirato il laser a infrarossi. Se il laser non viene completamente a contatto con la soluzione, il risultato sarà molto probabilmente una delle tre uscite inutilizzabili per quella concentrazione: 1) rilevamento di fluorescenza nulla o bassa, 2) rilevamento di fluorescenza più elevata (potenzialmente con picco frastagliato) o 3) rilevamento di fluorescenza all'interno di altri valori da una data titolazione, ma con un picco frastagliato e non arrotondato.
Per la termoforesi marcata è ottimale avere un segnale di fluorescenza superiore a 200 e inferiore a 2000 unità di fluorescenza7. Il dispositivo MST utilizza un intervallo di intensità LED da 0 a 100, che può essere selezionato per ottenere un segnale superiore a 200 o inferiore a 2000. In alternativa, si possono utilizzare diverse concentrazioni del ligando etichettato per modificare il segnale di fluorescenza a un livello ottimale. È importante eseguire una scansione del tappo con una determinata misurazione MST come riferimento durante l'analisi dei dati, poiché una scansione del tappo scadente può spesso portare a un punto che può essere successivamente determinato come un outlier. Ogni corsa dovrebbe richiedere circa 30 minuti se si misura una singola potenza MST con una scansione del tappo. I dispositivi commerciali consentono cambiamenti nella potenza MST. Nelle versioni precedenti del software questo poteva essere impostato da 0 a 100; e nelle versioni successive si può selezionare MST basso, medio o alto. Per ottenere tracce robuste, un ricercatore potrebbe dover provare ciascuna di queste e decidere quale impostazione MST si traduce nei dati più robusti per una determinata interazione.
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Protocol
1. Preparazione dei materiali
- Preparare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 e 2 mM KH2PO4, pH 7,41.
- Preparare il colorante NTA-Atto 647 N. Diluire il colorante NTA-Atto 647 N a 100 nM da una soluzione DMSO al 100% in PBS senza Tween.
- Esprimere Vam7-His8 – Proteina come proteina di fusione in E. coli e purificare utilizzando Ni-NTA e cromatografia di esclusione dimensionale8.
- Titolare l'analita nel buffer PBS. Se l'analita si trova in un tampone diverso, l'MST etichettato non è particolarmente sensibile alle differenze tampone minori rispetto a molecole come il DMSO, a meno che il contenuto del tampone analitico non interagisca con la proteina marcata.
2. Preparazione del dispositivo MST
- Accendere l'interruttore di alimentazione sul retro del dispositivo.
- Aprire il software di controllo e assicurarsi che il laptop sia acceso e connesso sul computer collegato al dispositivo.
- Immettere le impostazioni di fluorescenza e MST per questo esperimento. Impostare MST Prima su 3 s, MST su 30 s e Recupero fluorescenza (Fluo.) dopo 1 s. Prima misura la fluorescenza iniziale e non richiede lunghi tempi; MST è la quantità effettiva di tempo per raggiungere l'equilibrio dopo l'induzione del calore.
- Tabella dei capillari: per ogni tubo capillare, inserire il nome del bersaglio (ligando), il nome del ligando (analita), la concentrazione del bersaglio e la massima concentrazione di titolazione e utilizzare il rapporto di titolazione di riempimento automatico. Ad esempio, immettere 50 nM per la concentrazione target di Vam7-His8, Vam7-His8 per il nome del target, (acido fosfatidico 1,2-diottanoil) Di-C8 PA per il nome del ligando e la concentrazione più alta il ligando selezionando 1:1 e trascinando verso il basso fino agli slot di riempimento automatico 2-16.
- Eseguire una scansione cap per selezionare il LED appropriato (20% LED (preset)) in base al segnale della proteina bersaglio e regolare tra 200 e 2000 unità di fluorescenza per MST etichettato. Le scansioni del cappuccio dovrebbero mostrare picchi arrotondati uniformi a forma di campana.
- Selezionare un intervallo di potenze MST e immettere i valori per ciascuno per testare l'adattamento di legame più robusto e premere Start Cap Scan + Measurement, scansionando valori diversi per determinare le migliori condizioni operative per una determinata interazione in fase di test.
- Determinare la potenza MST con la migliore vestibilità utilizzando il software di analisi e il preset per la termoforesi con Tjump. Analizza gli adattamenti in base alla maggior parte della separazione di fluorescenza tra la concentrazione più bassa e più alta rispetto alla potenza MST con la migliore vestibilità e seleziona la potenza MST per le prove di replica.
- Determinare se si è verificato il fotosbiancamento tra la prima e la seconda esecuzione accedendo al software di analisi e passando l'analisi alla modalità esperto. Quindi, selezionare la fluorescenza anziché la termoforesi per l'analisi. Selezionare la modalità esperto e quindi il fotosbiancamento.
3. Preparazione di campioni per MST etichettato
- Portare la soluzione Vam7-His8 ad una concentrazione di 200 nM in PBS senza Tween.
- Portare il colorante NTA-Atto 647 a 100 nM in PBS senza Tween.
- Mescolare il colorante Vam7-His8 e NTA-Atto 647 con un rapporto volumetrico 1:1 e lasciare riposare a temperatura ambiente coperto dalla luce per 30 min. Determinare la concentrazione appropriata di proteina bersaglio come nel paragrafo 2.5 (vedere Supplemento sull'utilizzo di KD del colorante Ni-NTA come dimostrato in video).
- Centrifuga miscela di colorante nta-Atto 647 N e proteine per 10 minuti in una stanza buia utilizzando una centrifuga da tavolo a circa 8.161 x g.
- Conservare la miscela a 4 °C dopo l'esperimento o sul ghiaccio durante l'esperimento per riutilizzarla entro poche ore, se necessario, al fine di evitare che le proteine si denatrino.
- Utilizzare il cercatore di concentrazione NT per determinare l'intervallo di concentrazione necessario per la titolazione.
- Portare Di-C8 PA alla concentrazione massima appropriata in acqua.
- Titolare l'analita utilizzando una diluizione seriale 1:1 nel tampone PBS per 16 concentrazioni in base al passaggio precedente. A differenza di SPR, la termoforesi non è così sensibile alle differenze tampone.
4. MST dei campioni
- Accendere il dispositivo e il laptop collegato.
- Premere la freccia su sulla parte anteriore della macchina e far scorrere il rack capillare verso l'esterno.
- Caricare i capillari nel rack con la massima concentrazione in posizione 1.
- Nel software di controllo, selezionare il canale rosso corrispondente a NTA-Atto 647 N.
- Immettere le informazioni sulla concentrazione, la posizione e il nome per ciascun capillare nella Tabella dei capillari.
- Eseguire una scansione capillare premendo Start Cap Scan al 20% di LED (preset) e regolare in base a unità di fluorescenza tra 200 e 2000 utilizzando le impostazioni di intensità del LED o la concentrazione del ligando (proteina etichettata).
- Selezionare un intervallo di potenza MST.
- Avvia Scansione cap + Misurazione MST.
- Analizza utilizzando il software di analisi.
5. Analisi dei dati MST
NOTA: Il software di analisi fornito da Nanotemper è proprietario e viene eseguito utilizzando M.O. Affinity Analysis. Esistono diversi modi per misurare le affinità di legame in base alla fluorescenza o alla termoforesi. Le versioni più recenti di questo software sono preimpostate per valutare automaticamente i dati utilizzando la termoforesi e sono preimpostate per utilizzare la termoforesi con Tjump sfruttando entrambe le misurazioni. In alternativa, si può selezionare Tjump da solo o Thermophoresis da solo. Inoltre, il software di analisi consente misurazioni di affinità stimate utilizzando la fluorescenza iniziale. È possibile accedere a queste impostazioni solo in modalità esperto.
- Impostare la strategia di valutazione nel software di analisi su expert facendo clic sulla casella per il fulmine accanto a un set di dati nella schermata Selezione dati. Il software di analisi è preimpostato per l'analisi MST; tuttavia, un ricercatore può selezionare Crea nuova analisi e selezionare Analisi di fluorescenza iniziale per stimare le affinità di legame in base alla fluorescenza iniziale. La modalità Expert è disponibile anche per la fluorescenza iniziale. Nell'analisi descritta di seguito, la termoforesi e il Tjump sono stati utilizzati per determinare il KD del presentato di Vam7-His8 con il suo substrato naturale, l'acido fosfatidico lipidico.
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Representative Results
Si tratta di un output di esempio che utilizza l'analisi di affinità. L'MST etichettato è stato utilizzato per determinare la costante di legame del Vam7-His8 al diottanoil (DiC8) PA solubile di uno dei suoi substrati naturali9. La Figura 1 presenta le tracce termoforetiche di uno studio di titolazione 1:1 di DiC8 PA a partire da 500 μM contro 50 nM di Vam7-His8. Vengono mostrate la fluorescenza iniziale (tempo prima dell'accensione del laser a infrarossi), Tjump (tempo inizialmente dopo l'accensione del laser a infrarossi) e termoforesi (una volta che le particelle raggiungono l'equilibrio con la temperatura). Si può calcolare un KD da una qualsiasi di queste misurazioni da solo o si può usare una combinazione di Tjump e termoforesi considerando due di queste misurazioni.
Nella Figura 2, viene mostrata una curva di saturazione per la termoforesi con uscita Tjump dal software di analisi. Come mostrato nella Figura 2, la curva di saturazione può essere tracciata da questi risultati; tuttavia, può essere difficile calcolare una curva di saturazione poiché Fnorm non parte da zero. Per aggirare questo problema, i dati possono essere normalizzati manualmente o l'output può essere impostato sul limite di frazione determinato dal software di analisi. Generalmente, i risultati MST sono determinati utilizzando una scala di log come mostrato nella Figura 3. Il software di analisi tiene conto automaticamente della concentrazione di proteine di conto al fine di determinare l'affinità di legame selezionando il modello KD e inserendo la concentrazione proteica. Può anche essere utilizzato il modello di Hill nel software di analisi, che non considera la concentrazione proteica, ma può potenzialmente fornire una misura di cooperazione per una data interazione. Esportando entrambi gli output dal software di analisi e tracciando in software di terze parti, è possibile ottenere una misurazione KD come mostrato nella Figura 3. Va notato che la concentrazione critica di micelle (CMC) di diottanoil glicerofosfolipidi è >3 mM, indicando che questi esperimenti stanno operando molto al di sotto del CMC10.
Figura 1: Tracce MST di Vam7-His8 a DiC8 PA. Le tracce sono mostrate per l'analita PA al ligando NTA-Atto 647N etichettato Vam7-His8 misurato nel canale rosso. La fluorescenza iniziale è stata misurata a temperatura ambiente per 5 s (A) prima di accendere il laser a infrarossi. Il tjump (B) viene misurato nei secondi iniziali successivi all'induzione del calore dal laser a infrarossi incorporato e misura le differenze di fluorescenza presenti quando il laser IR viene acceso per la prima volta prima del movimento termoforetico delle particelle misurate. La termoforesi (C) viene misurata dopo che le molecole si equilibrano dal movimento indotto dal calore del laser a infrarossi a causa di differenze di movimento termoforetico dovute a fattori quali dimensioni, carica, entropia di solvatazione o cambiamento conformazionale della particella misurata rispetto all'analita titolato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Binding di saturazione determinato dai risultati MST esportati utilizzando software di terze parti. Risultati di fluorescenza normalizzati esportati dal software di analisi. I dati sono stati esportati e tracciati utilizzando un modello di associazione specifico di un sito. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Affinità di legame di Vam7-His8 a DiC8 PA utilizzando un modello sigmoidale. Analisi dei dati esportati dalla Figura 1 esportati dal software di analisi utilizzando la normalizzazione Fnorm [%]. Prendendo il registro delle concentrazioni di DiC8 PA tracciate contro Fnorm usando Graphpad Prism v.7 usando Sigmoidal, 4PL, X è il modello log(concentrazione) consente un adattamento che si traduce in un KD di 89 ± 18,0 μM per l'affinità di legame Vam7-His8 con DiC8 PA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La determinazione di Vam7-His8binding a DiC8-PA ha fornito un KD robusto per l'interazione data, che è un'affinità leggermente inferiore rispetto alla KD misurata di Vam7-His8 ai liposomi PA (non pubblicata). Questa differenza è molto probabilmente dovuta alla mancanza di una membrana, che generalmente si traduce in una minore affinità per le interazioni di legame lipidico specifiche della membrana e quindi dimostra il ruolo dell'impalcatura della membrana liposoma a questa interazione11.
Al fine di determinare ulteriormente la forza dei dati MST, un ricercatore deve esaminare sia la forma delle tracce dalla Figura 1 che la separazione delle tracce dal metodo di analisi scelto. Osservando le tracce della Figura 1, la maggior parte delle concentrazioni ha portato a una traccia chiara come determinato dal livellamento della porzione di termoforesi della curva. In alcuni casi le tracce corrispondenti a reazioni contenenti concentrazioni più elevate di analita verso la fine della misurazione fluorescente potrebbero essere dovute all'aggregazione nel campione dell'aderenza ai capillari del campione, che può essere risolta con aggiunte di uno o entrambi Pluronic o Tween al tampone12. Tuttavia, detergenti come questi potrebbero non essere adatti per le interazioni proteina-lipidi13. Per testare il legame non specifico per questo tipo di interazione proteina-lipide si può aggiungere BSA, aumentare la concentrazione di sale, o usare il glicerolo nel tampone e verificare se questo influisce sulla KD14,15 stimata.
La separazione è determinata dalla differenza in Fnorm tra la misurazione della concentrazione più alta e più bassa per l'interazione data. Come mostrato nella Figura 2, la separazione per questa interazione è stata di circa 75 unità di fluorescenza. In generale, parlando, si dovrebbe ottenere una separazione di almeno 5 unità di fluorescenza per fare affidamento con sicurezza sui dati MST di misurazioni di affinità chimica sconosciute. Se si ottiene un robusto adattamento KD a una separazione leggermente inferiore, si potrebbe essere in grado di considerare ancora tali dati se corrispondessero a misurazioni di affinità utilizzate tramite un'altra tecnica come SPR o ITC.
Poiché alcune delle tracce termoforetiche mostravano una certa viscosità nel campione, l'output scelto per la Figura 3 era una combinazione di termoforesi con Tjump. Questa impostazione è l'impostazione preselezionata nella maggior parte delle versioni successive del software di analisi. La Figura 3 indica un adattamento robusto a un modello di affinità di legame sigmoidale in quanto vi era una chiara saturazione con una titolazione 1:1 a 12 punti. Il dispositivo consente di prendere 16 punti in una determinata corsa e molte interazioni richiedono tutti questi punti per ottenere una forte misurazione dell'affinità di legame. Al fine di ottenere una maggiore sicurezza, questa prova dovrebbe essere ripetuta con nuovi capillari due o più volte richiedendo un totale di 36 tubi capillari per questo esperimento. Inoltre, si potrebbe provare un'altra tecnica come SPR per corroborare questi dati al fine di garantire una segnalazione affidabile delle costanti di affinità come abbiamo fatto in precedenza8,16.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione della National Science Foundation (MCB 1818310) alla RAF. Questo lavoro è stato supportato in parte dalla Chemical Biology Core Facility/Protein Crystallography Unit presso l'H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
| Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |
References
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