Summary
マイクロスケール熱泳動は、低い材料コストで結合定数を迅速に取得します。標識または標識フリーマイクロスケール熱泳動のいずれかが市販されている;しかしながら、標識フリーの熱泳動は、蛍光標識を用いて行うことができる多様な相互作用測定が可能ではない。当社は、標識熱泳動測定のためのプロトコルを提供しています。
Abstract
脂質とタンパク質との結合親和性を決定する能力は、膜トラフィッキング、シグナル伝達および細胞骨格リモデリングにおけるタンパク質間相互作用を理解する上で不可欠な部分である。このような相互作用を測定するための古典的なツールには、表面プラズモン共鳴(SPR)および等温滴定熱量測定(ITC)が含まれる。強力なツールではありますが、これらのアプローチには挫折があります。ITCは、脂質だけでなく、精製タンパク質を大量に必要とし、コストがかかり、製造が困難な場合があります。さらに、ITCとSPRは非常に時間がかかり、これらの実験を実行するコストを大幅に増加させる可能性があります。これらの制限を回避する方法の1つは、マイクロスケール熱泳動(MST)の比較的新しい技術を使用することです。MSTは、少量のサンプルを使用して、所与の結合事象の飽和曲線を得るために、高速かつ費用対効果が高い。現在、使用可能な MST システムには 2 つのタイプがあります。MSTの1つのタイプは、青色または赤色スペクトルの蛍光色素分子による標識を必要とする。第2のシステムは、UV範囲における芳香族アミノ酸の固有の蛍光に依存する。どちらのシステムも、赤外線レーザーからの局所的な熱誘導に応答して分子の動きを検出します。それぞれのアプローチには長所と短所があります。ラベルフリーMSTは、タグなしの天然タンパク質を使用することができる。しかし、医薬品を含む多くの分析物はUV範囲で蛍光を発し、正確なKD値の決定を妨げる可能性があります。対照的に、標識MSTは、UVとは対照的に可視範囲の測定可能な吸光度を有するリガンドに結合した蛍光標識プローブを利用して、測定可能なペアワイズ相互作用の多様性を可能にし、分析物からのシグナルを妨害する可能性を制限する。
Introduction
マイクロスケール熱泳動は、生化学的に関連するリガンド間の不会合定数(KD)および阻害定数(IC50)を決定する比較的新しい技術です。MSTの大手商業小売業者(NanoTemperなど)は、1)蛍光タグを必要とする標識フリーMSTと、2)各タンパク質に存在する芳香族残基の数に依存するタンパク質の固有の蛍光を使用した標識熱泳動の2つの一般的なMST技術を提供しています1。標識フリー熱泳動の欠点は、ほとんどの場合、タンパク質間相互作用の測定ができないことです。しかし、標識フリー熱泳動2に使用するために、トリプトファンなどの芳香族アミノ酸を含まないタンパク質を操作できる可能性があります。
MSTは、現在利用可能な技術で赤外線レーザーによって開始される微視的な温度場の誘導に応答して粒子の動きを測定します1。MSTは、十分なシグナル分離を生じさせることができる限り、タンパク質間相互作用、タンパク質-脂質相互作用、タンパク質-小分子間相互作用、競合実験、さらには小分子間の相互作用を測定するために使用することができる。さらに、MSTは、リポソームまたはナノディスクのいずれかに埋め込まれた膜 - タンパク質ベースの相互作用の測定を可能にする。標識サーモフォレーシスは、蛍光標識タグの使用を利用して、リガンドと分析物間のシグナルを化学的に制御可能な分離を可能にします。KD値は、低ナノモル濃度でのタンパク質結合を伴う相互作用の熱泳動を使用して得ることができ、ほとんどの場合、等温熱量測定(ITC)3に必要なものよりもはるかに低い濃度のタンパク質である。さらに、MSTには表面プラズモン共鳴(SPR)4に必要な厳密な緩衝要件がなく、標識熱泳動を使用して、遺伝子が挿入された蛍光タグ6を備えた完全に精製されていないタンパク質溶液5から目的のタンパク質の結合定数を測定することもできます。MSTの欠点は、SPR2のようにMSTの速度論的パラメータを容易に取得できないことである。
熱泳動測定は、溶液の局所的な温度差に依存します。この熱は赤外線レーザーから発生させることができる。MST装置は、赤外(IR)ビームに結合された蛍光検出器を有し、IRレーザーが標的とされる点における蛍光分子の局所的な濃度変化から蛍光の変化を拾うことができる。MSTデバイスは、溶液中で熱が発生するのと同じポイントに集束した蛍光検出器に直接結合されたIRターゲットレーザーを利用します。これにより、IRレーザーによって発生する熱の点での分子の枯渇に対応する温度変化の堅牢な検出が可能になります。測定された蛍光は、一般に、温度上昇に応答してIRレーザーに近づくほど減少する。結果として測定される差は、電荷、サイズ、溶媒和エントロピーなどの複数の要因に起因する可能性があります。これらの差は、熱の誘導または毛細血管の高温からより冷たい部分への分子の移動に応答した蛍光の変化として測定される。
キャピラリーに所定の溶液をロードするときは、キャピラリーの両端に空気を残し、キャピラリーを完全にいっぱいにロードしないことが重要です。市販の毛細血管は約10μLの溶液を保持する。溶液がキャピラリーの中心まで操作され、気泡(キャピラリーをロードする前に脱気する可能性がある)がなく、赤外線レーザーが標的とされるキャピラリーの中心から溶液を揺さぶらないようにラックを慎重にロードする限り、5μLの溶液で正確な測定を達成できます。レーザーが溶液と完全に接触しない場合、その結果は、その濃度に対して使用できない3つの出力のうちの1つになる可能性が最も高い:1)蛍光検出なしまたは低い、2)より高い蛍光検出(ギザギザのピークを有する可能性がある)、または3)所定の滴定からの他の値内の蛍光検出が、ギザギザで丸みを帯びていないピークを有する。
標識熱泳動では、200 を超える蛍光ユニットと 2000 未満の蛍光シグナルを持つのが最適です7。MSTデバイスは、0~100の範囲のLED強度を使用し、200以上または2000未満の信号を達成するために選択することができます。あるいは、異なる濃度の標識リガンドを使用して、蛍光シグナルを最適なレベルに修飾することができる。データ分析時に特定のMST測定値を基準としてキャップスキャンを実行することが重要です。キャップスキャンが不十分な場合、後で外れ値と判断される点が生じることがよくあります。キャップスキャンで単一のMST電力を測定する場合、各実行には約30分かかります。商用デバイスでは、MST 電力の変更が可能です。古いソフトウェアバージョンでは、これは0から100まで設定できました。それ以降のバージョンでは、低、中、または高のMSTを選択できます。堅牢なトレースを実現するには、研究者はこれらのそれぞれを試して、特定の相互作用に対して最も堅牢なデータが得られるMST設定を決定する必要があります。
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Protocol
1. 材料の準備
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製する:137 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM NaH2PO4、および2 mM KH2PO4、pH 7.41。
- NTA-Atto 647 N染料を調製する。ストックNTA-Atto 647 N色素を100%DMSO溶液からトゥイーンなしのPBSに100nMに希釈する。
- Vam7-His8 – タンパク質を大腸菌 中の融合タンパク質として発現させ、Ni-NTAおよびサイズ排除クロマトグラフィー8を使用して精製します。
- PBS緩衝液中の分析物を滴定する。分析物が別のバッファー内にある場合、標識 MST は、分析物バッファーの内容物が標識タンパク質と相互作用しない限り、DMSO などの分子とのわずかなバッファーの違いに対して特に敏感ではありません。
2. MSTデバイスの作製
- デバイスの背面にある電源スイッチをオンにします。
- コントロールソフトウェアを開き、デバイスに接続されているコンピュータでラップトップの電源が入っていて、接続状態になっていることを確認します。
- この実験の蛍光とMSTの設定を入力します。 [前の MST を 3 秒] に設定し、 MST を 30 秒に設定し、 蛍光回復 (Fluo.) を 1 秒後に設定します。前に最初の蛍光を測定し、長い時間を必要としません;MSTは、熱誘導後に平衡に達する実際の時間です。
- キャピラリーの表:各キャピラリーチューブについて、ターゲット(リガンド)の名前、リガンドの名前(分析物)、ターゲットの濃度、および最高の滴定濃度を入力し、オートフィル滴定比を使用します。たとえば、Vam7-His8 の目標濃度に 50 nM、ターゲット名に Vam7-His8、リガンド名に Di-C8 PA (1,2-ジオクタノイルホスファチジン酸) と入力し、リガンドの最高濃度を 1:1 に選択してオートフィルスロット 2 ~ 16 にドラッグダウンします。
- キャップスキャンを実行して、標的タンパク質のシグナルに基づいて適切なLED(20%LED(プリセット))を選択し、標識MST用に200~2000個の蛍光単位を調整します。キャップスキャンでは、均一な丸みを帯びた釣鐘型のピークが表示されます。
- MST検出力の範囲を選択し、それぞれの値を入力して最も堅牢なバインディングフィットをテストし、 キャップスキャン+測定の開始を押し、異なる値をスキャンして、テストされる特定の相互作用に最適な動作条件を決定します。
- 解析ソフトウェアとTjumpによる熱泳動のプリセットを使用して、最適なMST検出力を決定します。最も適合するMST検出力と比較して、最低濃度と最高濃度の間のほとんどの蛍光分離に従って適合を分析し、反復試験のMST検出力を選択します。
- 1 回目の実行と 2 回目の実行の間にフォトブリーチングが発生しているかどうかは、解析ソフトウェアを使用して解析をエキスパート モードに切り替えて判断します。次に、分析のために熱泳動の代わりに蛍光を選択します。エキスパートモードを選択し、フォトブリーチングを選択します。
3. 標識MST用サンプルの調製
- Vam7-His8溶液をトゥイーンなしでPBS中の200nMの濃度に持って来なさい。
- NTA-Atto 647 色素を PBS で 100 nM にするには、トゥイーンを使用せずに使用してください。
- Vam7-His8 色素と NTA-Atto 647 色素を 1:1 の体積比で混合し、光に覆われた室温で 30 分間座らせます。セクション2.5のように標的タンパク質の適切な濃度を決定する(ビデオで示されているようにNi-NTA色素のKDの利用に関する補足を参照 )。
- NTA-Atto 647 N色素とタンパク質の混合物を、約8,161 x gの卓上遠心分離機を用いて暗室で10分間遠心分離する。
- タンパク質が変性するのを防ぐために、必要に応じて数時間以内に再利用するために、実験後または実験中に氷上で混合物を4°Cで保存する。
- NT濃度ファインダーを使用して、滴定に必要な濃度範囲を決定します。
- Di-C8 PAを水中の適切な最大濃度にしてください。
- 前の工程に基づいて16濃度のPBS緩衝液中で1:1段階希釈を用いて分析物を滴定する。SPRとは異なり、熱泳動はバッファーの違いに対してそれほど敏感ではありません。
4. サンプルのMST
- デバイスと接続されているラップトップの電源を入れます。
- マシン前面の上矢印を押し、キャピラリーラックをスライドさせて取り出します。
- 位置 1 で最も高い濃度のラックにキャピラリーをロードします。
- 制御ソフトウェアで、NTA-Atto 647 Nに対応するレッドチャンネルを選択します。
- 各キャピラリーの濃度、位置、および名前の情報をキャピラリーの 表に入力します。
- キャピラリースキャンを実行するには、20%のLED(プリセット)で キャップスキャンを開始し 、LED強度設定またはリガンド(標識タンパク質)の濃度を使用して、200〜2000の蛍光ユニットに従って調整します。
- MST 電力の範囲を選択します。
- キャップスキャン+ MST測定を開始します。
- 解析ソフトを使用して解析します。
5. MSTデータの分析
注:ナノテンパーが提供する分析ソフトウェアは独自のものであり、M.O.アフィニティー分析を使用して実行されます。蛍光または熱泳動に基づいて結合親和性を測定するには、さまざまな方法があります。このソフトウェアの新しいバージョンは、サーモフォレーシスを使用してデータを自動的に評価するようにプリセットされており、両方の測定を利用するTjumpでサーモフォレーシスを使用するようにプリセットされています。あるいは、Tjump単独または熱フォレーシス単独のいずれかを選択することもできます。さらに、分析ソフトウェアにより、初期蛍光を使用して推定された親和性測定が可能になります。これらの設定には、エキスパートモードでのみアクセスできます。
- データ選択画面でデータセットの横にある稲妻のボックスをクリックして、分析ソフトウェアの評価戦略をエキスパートに設定します。解析ソフトウェアは、MST解析に解析するようにプリセットされています。ただし、研究者は [新しい分析の作成] と [初期蛍光分析] を選択して、初期蛍光に基づいて結合親和性を推定できます。エキスパートモードは、初期蛍光にも使用できます。以下に記載する分析において、熱泳動およびTjumpを用いて、その天然基質である脂質ホスファチジン酸と共に提示されたVam7−His8のKDを決定した。
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Representative Results
これは、アフィニティー分析を使用したサンプル出力です。標識MSTを用いて、その天然基質の1つである可溶性ジオクタノイル(DiC8)PAに対するVam7-His8の結合定数を決定した9。図1は、50nMのVam7-His8に対して500μMから開始したDiC8 PAの1:1滴定の1つの試行からの熱泳動トレースを示しています。初期蛍光(赤外線レーザーがオンになる前の時間)、Tjump(赤外線レーザーがオンになった後の時間)、および熱泳動(粒子が温度と平衡に達すると)が示されています。これらの測定値のいずれか1つを単独でKDを計算することも、これらの測定値の2つを考慮してTjumpと熱泳動を組み合わせて使用することもできます。
図2では、解析ソフトウェアから出力されたTjumpによる熱泳動の飽和曲線が示されています。図 2 に示すように、これらの結果から飽和曲線をプロットできます。ただし、Fnorm はゼロから始まらないため、飽和曲線を計算することは難しい場合があります。この問題を回避するには、データを手動で正規化するか、出力を解析ソフトウェアによって決定されたフラクションバインドに設定することができます。一般に、MSTの結果は、図3に示すように対数スケールを使用して決定される。解析ソフトウェアは、KDモデルを選択し、タンパク質濃度を入力することによって結合親和性を決定するために、アカウントタンパク質濃度を自動的に考慮します。解析ソフトウェアのHillモデルも使用でき、タンパク質濃度は考慮されませんが、特定の相互作用の協同性の尺度を与える可能性があります。解析ソフトウェアから出力をエクスポートし、サードパーティ製ソフトウェアでプロットすると、図3に示すようなKD測定値を得ることができます。ジオクタノイルグリセロリン脂質の臨界ミセル濃度(CMC)は>3mMであり、これらの実験がCMC10をはるかに下回って動作していることを示していることに留意すべきである。
図1:Vam7-His8からDiC8 PAへの MSTトレース 赤色チャネルで測定されたNTA-Atto 647N標識Vam7-His8リガンドに対するPA分析物についての痕跡が示されている。初期蛍光は、赤外レーザーをオンにする前に5秒間室温で測定した(A)。Tjump(B)は、内蔵の赤外線レーザーからの熱誘導後の最初の数秒で測定され、測定される粒子の熱泳動の前にIRレーザーが最初にオンになったときに存在する蛍光の違いを測定します。熱泳動(C)は、滴定された分析物に関して測定される粒子のサイズ、電荷、溶媒和エントロピー、または立体構造変化などの要因による熱泳動差による赤外レーザーからの熱によって誘導される動きから分子が平衡化した後に測定される。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:サードパーティ製ソフトウェアを使用してエクスポートされたMST結果から決定された彩度バインディング。 解析ソフトウェアからエクスポートされた正規化された蛍光結果。データをエクスポートし、1部位特異的結合モデルを用いてプロットした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:シグモイドモデルを用いたDiC8 PAへのVam7-His8の結合親和性。 正規化Fnorm [%]を使用して解析ソフトウェアからエクスポートされた図1からエクスポートされたデータの分析。グラフパッドプリズムv.7を用いてFnormに対してプロットされたDiC8 PAの濃度の対数を取ると、シグモイド、4PL、Xは対数(濃度)モデルであり、DiC8 PAに対するVam7-His8結合親和性について89±18.0μMのKDをもたらす適合を可能にする。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
DiC8-PAへのVam7-His8結合の決定は、所与の相互作用に対して堅牢なフィッティングKDを提供し、これはPAリポソームに対するVam7-His8の測定されたKDよりもわずかに低い親和性である(未発表)。この差は、膜の欠如に起因する可能性が最も高く、これは一般に、膜特異的脂質結合相互作用に対する親和性の低下をもたらし、したがって、この相互作用に対するリポソーム膜足場の役割を実証する11。
MSTデータの強度をさらに決定するために、研究者は、図1のトレースの形状と、選択した分析方法からのトレースの分離の両方を調べる必要があります。図1の痕跡を見ると、ほとんどの濃度は、曲線の熱泳動部分の横ばいによって決定されるように、明確な痕跡をもたらした。いくつかの例では、蛍光測定の終わりに向かってより高濃度の分析物を含む反応に対応する微量が、試料毛細血管への試料付着における凝集に起因する可能性があり、これは、緩衝液へのプルロニックまたはTweenのいずれかまたは両方の添加によって改善され得る12。しかし、このような洗剤は、タンパク質-脂質相互作用には適していない可能性があります13。このタイプのタンパク質 - 脂質相互作用に対する非特異的結合を試験するには、BSAに添加するか、塩濃度を増加させるか、または緩衝液中のグリセロールを使用して、これが推定KD14,15に影響を及ぼすかどうかを試験することができる。
分離は、所与の相互作用の最高濃度測定値と最低濃度測定値の間のFnormの差によって決定される。図2に示すように、この相互作用に対する分離は、約75蛍光単位であった。一般に、少なくとも5つの蛍光単位の分離は、未知の化学的親和性測定のMSTデータに自信を持って依存するために達成されるべきである。わずかに低い分離で堅牢なKD適合が達成されたとしても、SPRやITCなどの別の技術を介して使用されるアフィニティー測定に対応していれば、そのようなデータをまだ考慮できる可能性があります。
熱泳動トレースの一部がサンプルに粘着性を示したため、図3で選択した出力は、熱泳動とTjumpの組み合わせでした。この設定は、解析ソフトウェアのほとんどの以降のバージョンで事前に選択された設定です。図3は、12点1:1滴定で明確な飽和があったため、シグモイド結合親和性モデルへのロバストな適合を示しています。このデバイスは、所与の実行で16点を採取することを可能にし、多くの相互作用は、強力な結合親和性測定を達成するためにこれらの点のすべてを必要とする。より高い信頼性を達成するために、この試験は、この実験のために合計36本のキャピラリーチューブを必要とする新しい毛細血管で2回以上繰り返されるべきである。さらに、SPR などの別の手法を試して、以前に行ったようにアフィニティ定数の信頼性の高いレポートを確実にするために、このデータを裏付けることもできます8,16。
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Disclosures
著者らは、潜在的な利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、米国国立科学財団(MCB 1818310)からRAFへの助成金によって支援されました。この研究は、H. Lee Moffitt Cancer CenterのChemical Biology Core Facility/Protein Crystallography Unit(NIH/NCI:P30-CA076292)によって部分的に支援された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
| Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |
References
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