Summary
마이크로스케일 열영동은 낮은 재료 비용으로 결합 상수를 신속하게 획득한다. 표지 또는 라벨이 없는 마이크로스케일 열영동이 상업적으로 입수가능하거나; 그러나, 라벨 없는 열영동은 형광 표지를 사용하여 수행될 수 있는 상호작용 측정의 다양성을 할 수 없다. 우리는 라벨이 붙은 열영동 측정을위한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
단백질에 대한 지질의 결합 친화도를 결정하는 능력은 막 밀매, 신호 전달 및 세포 골격 리모델링에서 단백질-지질 상호작용을 이해하는 데 필수적인 부분이다. 이러한 상호 작용을 측정하기위한 고전적인 도구에는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 등온 적정 열량계 (ITC)가 포함됩니다. 강력한 도구이지만 이러한 접근 방식에는 어려움이 있습니다. ITC는 지질뿐만 아니라 다량의 정제 된 단백질을 필요로하며, 이는 비용이 많이 들고 생산하기가 어려울 수 있습니다. 또한 ITC와 SPR은 매우 시간이 많이 걸리므로 이러한 실험을 수행하는 데 드는 비용이 크게 추가 될 수 있습니다. 이러한 제한을 우회하는 한 가지 방법은 마이크로스케일 열영동(MST)의 비교적 새로운 기술을 사용하는 것이다. MST는 주어진 결합 이벤트에 대한 포화 곡선을 얻기 위해 소량의 샘플을 사용하여 빠르고 비용 효율적입니다. 현재 사용할 수 있는 MST 시스템에는 두 가지 유형이 있습니다. MST의 한 유형은 파란색 또는 빨간색 스펙트럼의 형광단으로 라벨링해야합니다. 두 번째 시스템은 UV 범위에서 방향족 아미노산의 고유 형광에 의존합니다. 두 시스템 모두 적외선 레이저에서 열의 국부적 인 유도에 반응하여 분자의 움직임을 감지합니다. 각 접근 방식에는 장점과 단점이 있습니다. 라벨이 없는 MST는 태그가 지정되지 않은 천연 단백질을 사용할 수 있습니다. 그러나, 의약품을 포함한 많은 분석물은, UV 범위의 형광, 이는 정확한 KD 값의 결정을 방해할 수 있다. 비교해 보면, 표지된 MST는 UV와 반대되는 가시 범위에서 측정 가능한 흡수율을 갖는 리간드에 부착된 형광 표지된 프로브를 활용하여 측정 가능한 쌍 상호작용의 더 큰 다양성을 허용하여, 분석물로부터의 신호를 방해할 가능성을 제한한다.
Introduction
마이크로스케일 열영동은 생화학적으로 관련된 리간드 사이의 분해 상수 (KD) 및 억제 상수 (IC50)를 결정하는 비교적 새로운 기술이다. MST (예를 들어, NanoTemper)에 대한 선도적 인 상업 소매 업체는 두 가지 인기있는 MST 기술을 제공합니다 : 1) 형광 태그를 필요로하는 라벨없는 MST 라벨 및 2) 각 단백질에 존재하는 방향족 잔기의 수에 의존하는 단백질의 고유 형광을 사용하는 표지 된 열 영동1. 라벨이 없는 열영동의 단점은 대부분의 경우 단백질-단백질 상호작용의 측정을 허용하지 않는다는 것이다. 그러나, 라벨 프리 열영동2에 사용하기 위해 트립토판과 같은 방향족 아미노산 없이 단백질을 조작하는 것이 가능할 수 있다.
MST는 현재 이용 가능한 기술에서 적외선 레이저에 의해 개시되는 미세한 온도 필드의 유도에 응답하여 입자의 이동을 측정한다1. MST는 단백질-단백질 상호작용, 단백질-지질 상호작용, 단백질-소분자, 경쟁 실험, 심지어 소분자 간의 상호작용까지 측정하는데 사용될 수 있으며, 이는 충분한 신호 분리를 생성할 수 있는 한 말이다. 추가적으로, MST는 리포솜 또는 나노디스크에 매립된 막-단백질 기반 상호작용의 측정을 허용한다. 표지된 열영동은 형광 표지된 태그의 사용을 이용하므로 리간드와 분석물 사이의 신호를 화학적으로 제어할 수 있습니다. KD 값은 낮은 나노몰 농도에서 단백질 결합을 수반하는 상호작용에 대해 열영동을 사용하여 얻을 수 있으며, 대부분의 경우 등온 열량측정법(ITC)3에 필요한 것보다 훨씬 낮은 농도의 단백질이다. 추가적으로, MST는 표면 플라즈몬 공명(SPR)4에 요구되는 엄격한 완충 요건을 갖지 않으며, 표지된 열영동은 심지어 유전적으로 삽입된 형광 태그6를 갖는 완전 정제되지 않은 단백질 용액5으로부터 관심있는 단백질의 결합 상수를 측정하는데 사용될 수 있다. MST의 단점은 SPR2에서와 같이 MST에 대해 운동 매개 변수를 쉽게 얻을 수 없다는 것입니다.
열영동 측정은 용액의 국소 온도 차이에 따라 달라집니다. 이 열은 적외선 레이저에서 생성 될 수 있습니다. MST 장치는 적외선(IR) 빔에 결합된 형광 검출기를 가지며, IR 레이저가 표적이 되는 지점에서 형광 분자의 국소 농도 변화로부터 형광의 변화를 포착할 수 있다. MST 장치는 용액에서 열이 발생되는 동일한 지점에 집속된 형광 검출기에 직접 결합된 IR 표적 레이저를 이용한다. 이를 통해 IR 레이저에 의해 생성 된 열 지점에서 분자의 고갈에 해당하는 온도 변화를 강력하게 감지 할 수 있습니다. 측정된 형광은 일반적으로 온도 증가에 반응하여 IR 레이저에 더 가깝게 감소한다. 결과로 측정 된 차이는 전하, 크기 또는 용매화 엔트로피를 포함한 여러 요인으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 차이는 모세관의 뜨거운에서 더 차가운 부분까지 열의 유도 또는 분자의 이동에 대한 반응으로 형광의 변화로 측정됩니다.
주어진 용액으로 모세관을 적재 할 때, 모세관의 양쪽 끝에 공기를 남겨두고 모세관을 완전히 가득 채우지 않는 것이 중요합니다. 상업용 모세관은 약 10 μL의 용액을 보유한다. 용액이 모세관의 중심으로 조작되는 한 5 μL의 용액으로 정확한 측정을 달성 할 수 있으며, 기포 (모세관을 적재하기 전에 잠재적으로 가스 제거)가 없으며, 하나는 적외선 레이저가 목표로하는 모세관 중심에서 용액을 흔들지 않도록 랙을 조심스럽게 적재하는 것입니다. 레이저가 용액과 완전히 접촉하지 않으면, 그 결과는 그 농도에 대해 사용할 수 없는 세 가지 출력 중 하나가 될 가능성이 큽니다: 1) 형광 검출이 없거나 낮음, 2) 더 높은 형광 검출(잠재적으로 들쭉날쭉한 피크가 있음), 또는 3) 주어진 적정에서 다른 값 내에서 형광 검출, 그러나 들쭉날쭉하고 둥글지 않은 피크가 있습니다.
표지된 열영동을 위해서는 200 이상의 형광 신호와 2000 미만의 형광 단위7을 갖는 것이 최적이다. MST 장치는 0에서 100까지의 LED 강도 범위를 사용하며, 이는 200 이상 또는 2000 미만의 신호를 달성하기 위해 선택할 수 있습니다. 대안적으로, 형광 신호를 최적 수준으로 변형시키기 위해 표지된 리간드의 상이한 농도를 사용할 수 있다. 데이터를 분석할 때 주어진 MST 측정을 기준으로 캡 스캔을 실행하는 것이 중요한데, 불량한 캡 스캔은 종종 나중에 이상치로 결정될 수 있는 점을 초래할 수 있기 때문입니다. 캡 스캔으로 단일 MST 전력을 측정하는 경우 각 실행에 약 30분이 소요됩니다. 상용 장치는 MST 전력의 변경을 허용합니다. 이전 소프트웨어 버전에서는 0에서 100까지 설정할 수 있습니다. 이후 버전에서는 낮음, 중간 또는 높은 MST를 선택할 수 있습니다. 강력한 추적을 달성하기 위해 연구원은 이들 각각을 시도하고 주어진 상호 작용에 대해 가장 강력한 데이터를 생성하는 MST 설정을 결정해야 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 재료의 제조
- 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 제조하였다: 137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 및 2 mM KH2PO4, pH 7.41.
- NTA-Atto 647 N 염료를 제조하였다. NTA-Atto 647 N 염료를 100% DMSO 용액으로부터 100 nM로 희석하여 트윈이 없는 PBS로 희석한다.
- 익스프레스 Vam7-His8 – 대장균 의 융합 단백질로서 Ni-NTA 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 단백질8.
- 분석물을 PBS 완충액에 적정한다. 분석물이 상이한 완충액 내에 있는 경우, 표지된 MST는 분석물 완충액의 내용이 표지된 단백질과 상호작용하지 않는 한, DMSO와 같은 분자로부터의 사소한 완충액 차이에 특히 민감하지 않다.
2. MST 장치의 제조
- 장치 뒷면의 전원 스위치를 켭니다.
- 제어 소프트웨어를 열고 랩톱이 장치에 연결된 컴퓨터에서 켜져 있고 연결된 상태인지 확인합니다.
- 이 실험에 대한 형광 및 MST 설정을 입력합니다. MST 전 을 3초, MST 를 30초, 형광 회수(Fluo .) 를 1초 후에 설정한다. 초기 형광을 측정하기 전에 장시간을 필요로 하지 않으며; MST는 열 유도 후 평형에 도달하는 실제 시간입니다.
- 모세혈관의 표: 각 모세관 튜브에 대해, 표적의 이름(리간드), 리간드(분석물)의 이름, 표적의 농도, 및 가장 높은 적정 농도를 입력하고 자가필 적정비를 사용한다. 예를 들어, 표적 농도에 대해 Vam7-His8, 표적 명칭에 대해 Vam7-His8, 리간드 이름에 대해 Di-C8 PA (1,2-디옥타노일 포스파티드산)를 입력하고, 최고 농도의 리간드를 1:1로 선택하고 아래로 드래그하여 자동 충전 슬롯 2-16을 입력한다.
- 캡 스캔을 실행하여 표적 단백질의 신호에 기초하여 적절한 LED(20% LED(프리셋))를 선택하고 표지된 MST에 대해 200 내지 2000개의 형광 유닛 사이에서 조정한다. 캡 스캔은 균일 한 둥근 종 모양의 봉우리를 표시해야합니다.
- MST 파워의 범위를 선택하고 각각에 대한 값을 입력하여 가장 견고한 바인딩 핏을 테스트하고 Start Cap Scan + Measurement를 누르고 서로 다른 값을 스캔하여 테스트중인 주어진 상호 작용에 가장 적합한 작동 조건을 결정합니다.
- 분석 소프트웨어 및 Tjump를 사용한 열영동을 위한 사전 설정을 사용하여 MST 전력에 가장 적합한 성능을 결정합니다. 가장 적합한 MST 파워와 비교하여 가장 낮은 농도와 가장 높은 농도 사이의 대부분의 형광 분리에 따른 적합성을 분석하고 복제 시험을 위한 MST 파워를 선택합니다.
- 분석 소프트웨어로 이동하여 분석을 전문가 모드로 전환하여 첫 번째와 두 번째 실행 사이에 광표백이 발생했는지 확인합니다. 다음으로, 분석을 위해 열영동 대신 형광을 선택하십시오. 전문가 모드를 선택한 다음 광표백을 선택합니다.
3. 표지된 MST에 대한 샘플의 제조
- Vam7-His8 용액을 트윈이 없는 PBS 중 200 nM의 농도로 가져온다.
- NTA-Atto 647 염료를 트윈 없이 PBS 중의 100 nM으로 가져온다.
- Vam7-His8 및 NTA-Atto 647 염료를 1:1 부피비로 혼합하고 30분 동안 빛으로부터 덮인 실온에서 앉아있게하십시오. 섹션 2.5에서와 같이 표적 단백질의 적절한 농도를 결정한다 (비디오에서 입증된 바와 같이 Ni-NTA 염료의 KD의 이용에 관한 보충 참조 ).
- NTA-Atto 647 N 염료 및 단백질의 혼합물을 대략 8,161 x g의 탁상 원심분리기를 사용하여 암실에서 10분 동안 원심분리한다.
- 단백질 변성을 방지하기 위해 필요한 경우 몇 시간 이내에 재사용하기 위해 실험 후 또는 실험 동안 얼음 위에 혼합물을 4°C에서 보관한다.
- NT 농도 측정기를 사용하여 적정에 필요한 농도 범위를 결정합니다.
- Di-C8 PA를 물에 적절한 최대 농도로 가져옵니다.
- 이전 단계에 기초하여 16 농도에 대해 PBS 완충액 중의 1:1 연속 희석을 사용하여 분석물을 적정한다. SPR과 달리 열영동은 버퍼 차이에 민감하지 않습니다.
4. 샘플의 MST
- 장치 및 연결된 랩톱을 켭니다.
- 기계 앞면의 위쪽 화살표를 누르고 모세관 랙을 밖으로 밀어냅니다.
- 위치 1에서 가장 높은 농도로 랙에 모세혈관을 적재합니다.
- 제어 소프트웨어에서 NTA-Atto 647 N에 해당하는 빨간색 채널을 선택합니다.
- 모세관 표에 각 모세관의 농도, 위치 및 이름 정보를 입력합니다.
- 20% LED(사전 설정)에서 Start Cap Scan을 눌러 모세관 스캔을 실행하고 LED 강도 설정 또는 리간드(표지된 단백질)의 농도를 사용하여 200~2000개의 형광 단위에 따라 조정합니다.
- MST 전원 범위를 선택합니다.
- 캡 스캔 + MST 측정을 시작하십시오.
- 분석 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.
5. MST 데이터 분석
참고: Nanotemper에서 제공하는 분석 소프트웨어는 독점적이며 M.O. 친화성 분석을 사용하여 수행됩니다. 형광 또는 열영동을 기반으로 결합 친화도를 측정하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 이 소프트웨어의 최신 버전은 열영동을 사용하여 데이터를 자동으로 평가하도록 사전 설정되어 있으며 두 측정을 모두 활용하는 Tjump와 함께 열영동을 사용하도록 사전 설정되어 있습니다. 또는 Tjump 단독 또는 Thermophoresis 단독을 선택할 수 있습니다. 추가적으로, 분석 소프트웨어는 초기 형광을 사용하여 추정된 친화도 측정을 허용한다. 이러한 설정은 전문가 모드에서만 액세스할 수 있습니다.
- 데이터 선택 화면에서 데이터 세트 옆에 있는 번개 섬광 상자를 클릭하여 분석 소프트웨어의 평가 전략을 전문가로 설정합니다. 분석 소프트웨어는 MST 분석으로 분석하도록 미리 설정되어 있습니다. 그러나 연구원은 초기 형광을 기반으로 결합 친화도를 추정하기 위해 새 분석 작성을 선택하고 초기 형광 분석을 선택할 수 있습니다. 전문가 모드는 초기 형광에도 사용할 수 있습니다. 아래에 설명된 분석에서, 열영동 및 Tjump는 그의 천연 기질인 지질 포스파티드산과 함께 Vam7-His8의 제시의 KD를 결정하기 위해 사용되었다.
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Representative Results
선호도 분석을 사용한 샘플 출력입니다. 표지된 MST는 그의 천연 기질 중 하나의 가용성 디옥타노일(DiC8) PA에 대한 Vam7-His8의 결합 상수를 결정하는데 사용되었다9. 도 1은 Vam7-His8의 50 nM에 대하여 500 μM에서 시작하는 DiC8 PA의 1:1 적정의 일 시험으로부터의 열영동 트레이스를 제시한다. 초기 형광(적외선 레이저가 켜지기 전의 시간), Tjump(적외선 레이저가 켜진 후 초기 시간) 및 열영동(입자가 온도와 평형에 도달하면 됨)이 표시됩니다. 하나는 단독으로 이러한 측정 중 하나에서 KD를 계산할 수 있습니다 또는 이러한 측정 중 두 가지를 고려 Tjump와 열 영동의 조합을 사용할 수 있습니다.
도 2에서, 분석 소프트웨어로부터의 Tjump 출력을 사용한 열영동에 대한 포화 곡선이 도시되어 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 포화 곡선은 이러한 결과로부터 플롯팅될 수 있다; 그러나 Fnorm이 0에서 시작하지 않으므로 포화 곡선을 계산하기가 어려울 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 데이터를 수동으로 정규화하거나 출력을 분석 소프트웨어에 의해 결정된 분수 바인딩으로 설정할 수 있습니다. 일반적으로, MST 결과는 도 3에 도시된 바와 같이 로그 스케일을 사용하여 결정된다. 분석 소프트웨어는 KD 모델을 선택하고 단백질 농도를 입력하여 결합 친화도를 결정하기 위해 자동으로 계정 단백질 농도를 설명합니다. 분석 소프트웨어의 Hill 모델도 사용할 수 있는데, 이는 단백질 농도를 고려하지 않지만 잠재적으로 주어진 상호 작용에 대한 협력성을 측정 할 수 있습니다. 분석 소프트웨어에서 출력을 내보내고 타사 소프트웨어로 플로팅하면 그림 3과 같이 KD 측정을 얻을 수 있습니다. 디옥타노일 글리세로인지질의 임계 미셀 농도 (CMC)는 >3 mM이며, 이는 이들 실험이 CMC10보다 훨씬 낮게 작동하고 있음을 나타낸다는 점에 유의해야 한다.
그림 1: Vam7-His8 내지 DiC8 PA 의 MST 흔적. 적색 채널에서 측정된 NTA-Atto 647N 표지된 Vam7-His8 리간드에 대한 PA 분석물에 대한 흔적이 도시되어 있다. 초기 형광은 적외선 레이저를 켜기 전에 실온에서 5 s (A) 동안 측정되었다. Tjump (B)는 내장 적외선 레이저로부터의 열 유도 후 초기 초에 측정되며 IR 레이저가 측정되는 입자의 열 영동 운동 전에 IR 레이저가 처음 켜질 때 존재하는 형광 차이를 측정합니다. 열영동(C)은 적정 분석물에 대하여 측정되는 입자의 크기, 전하, 용매화 엔트로피 또는 형태적 변화와 같은 요인들에 의한 열영동 운동 차이로 인해 적외선 레이저로부터의 열에 의해 유도된 움직임으로부터 분자가 평형을 이룬 후에 측정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 타사 소프트웨어를 사용하여 내보낸 MST 결과에서 결정된 채도 바인딩. 분석 소프트웨어로부터 내보낸 정규화된 형광 결과. 데이터를 내보내고 단일 사이트 특정 바인딩 모델을 사용하여 플로팅했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 시그모이드 모델을 이용한 DiC8 PA에 대한 Vam7-His8의 결합 친화도. 정규화 Fnorm [%]을 사용하여 분석 소프트웨어에서 내보낸 그림 1에서 내보낸 데이터를 분석합니다. Sigmoidal, 4PL을 사용하여 그래프패드 프리즘 v.7을 사용하여 Fnorm에 대해 플롯팅된 DiC8 PA의 농도의 로그를 취하면, X는 로그(concentration) 모델은 DiC8 PA에 대한 Vam7-His8 결합 친화도에 대해 89 ± 18.0 μM의 KD를 초래하는 적합도를 허용한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
DiC8-PA에 대한 Vam7-His8결합의 결정은 주어진 상호작용에 대해 강력한 적합 KD를 제공하였고, 이는 PA 리포솜에 대한 Vam7-His8의 측정된 KD보다 약간 낮은 친화도이다(미공개). 이러한 차이는 멤브레인의 부족으로 인한 것일 가능성이 가장 높으며, 이는 일반적으로 막 특이적 지질 결합 상호작용에 대한 더 낮은 친화도를 초래하고, 따라서 이러한 상호작용에 대한 리포좀 막 스캐폴드에 대한 역할을 입증한다11.
MST 데이터의 강도를 더 결정하기 위해 연구원은 그림 1의 흔적 모양과 선택한 분석 방법에서 흔적을 분리하는 것을 모두 조사해야합니다. 도 1로부터의 흔적을 살펴보면, 대부분의 농도는 곡선의 열영동 부분의 평준화에 의해 결정된 바와 같이 명확한 추적을 가져왔다. 일부 예에서, 형광 측정의 끝쪽으로 더 높은 농도의 분석물을 함유하는 반응에 상응하는 트레이스는 샘플 모세혈관에 대한 샘플 부착에서의 응집에 기인할 수 있으며, 이는 완충액(12)에 플루로닉 또는 트윈 중 어느 하나 또는 둘 모두를 첨가함으로써 해결될 수 있다. 그러나, 이들과 같은 세제는 단백질-지질 상호작용13에 적합하지 않을 수 있다. 이러한 유형의 단백질-지질 상호작용에 대한 비특이적 결합을 시험하기 위해 BSA에 첨가하거나, 염 농도를 증가시키거나, 완충액에 글리세롤을 사용하여 이것이 추정된 KD14,15에 영향을 미치는지 여부를 시험할 수 있다.
분리는 주어진 상호 작용에 대한 최고 농도 측정과 최저 농도 측정 사이의 Fnorm의 차이에 의해 결정됩니다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 이러한 상호작용에 대한 분리는 대략 75개의 형광 단위였다. 일반적으로, 말하자면, 적어도 5개의 형광 단위의 분리는 알려지지 않은 화학적 친화성 측정의 MST 데이터에 자신있게 의존하기 위해 달성되어야 한다. 약간 낮은 분리에서 견고한 KD 피팅을 달성하는 경우 SPR 또는 ITC와 같은 다른 기술을 통해 사용되는 친화성 측정에 해당하는 경우 이러한 데이터를 계속 고려할 수 있습니다.
일부 열영동 흔적이 샘플에서 약간의 끈적임을 나타내었기 때문에 그림 3에서 선택한 출력은 열영동과 Tjump의 조합이었습니다. 이 설정은 대부분의 최신 버전의 분석 소프트웨어에서 미리 선택된 설정입니다. 도 3은 12점 1:1 적정으로 명확한 포화가 있었으므로 시그모이드 결합 친화도 모델에 대한 견고한 적합도를 나타낸다. 이 장치는 주어진 실행에서 16 포인트를 취할 수 있으며, 많은 상호 작용은 강력한 결합 친화도 측정을 달성하기 위해 이러한 모든 점을 필요로합니다. 더 큰 자신감을 얻기 위해,이 시험은이 실험을 위해 총 36 개의 모세관 튜브를 필요로하는 새로운 모세 혈관으로 두 번 이상 반복되어야합니다. 또한 SPR과 같은 다른 기술을 시도하여이 데이터를 확증하여 이전에 수행 한 것처럼 선호도 상수의 신뢰할 수있는보고를 보장 할 수 있습니다8,16.
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Disclosures
저자는 잠재적 인 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 과학 재단 (MCB 1818310)의 RAF에 대한 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구는 H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH / NCI : P30-CA076292)의 화학 생물학 핵심 시설 / 단백질 결정학 부서에서 부분적으로 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
| Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |
References
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