Summary
Mikroskala termoforese oppnår bindende konstanter raskt til lav materialkostnad. Enten merket eller etikettfri mikroskala termoforese er kommersielt tilgjengelig; Etikettfri termoforese er imidlertid ikke i stand til mangfoldet av interaksjonsmålinger som kan utføres ved hjelp av fluorescerende etiketter. Vi tilbyr en protokoll for merkede termoforesemålinger.
Abstract
Evnen til å bestemme lipidenes bindende affinitet til proteiner er en viktig del av forståelsen av protein-lipid interaksjoner i membranhandel, signaltransduksjon og cytoskeletal ombygging. Klassiske verktøy for måling av slike interaksjoner inkluderer overflateplasmon resonans (SPR) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC). Mens kraftige verktøy, disse tilnærmingene har tilbakeslag. ITC krever store mengder renset protein samt lipider, noe som kan være kostbart og vanskelig å produsere. Videre er ITC så vel som SPR svært tidkrevende, noe som kan legge betydelig til kostnadene ved å utføre disse eksperimentene. En måte å omgå disse begrensningene på er å bruke den relativt nye teknikken for mikroskala termoforese (MST). MST er rask og kostnadseffektiv ved hjelp av små mengder prøve for å oppnå en metningskurve for en gitt bindingshendelse. Det finnes for øyeblikket to typer MST-systemer tilgjengelig. En type MST krever merking med fluorofor i det blå eller røde spekteret. Det andre systemet er avhengig av den iboende fluorescensen av aromatiske aminosyrer i UV-serien. Begge systemene oppdager bevegelsen av molekyler som svar på lokalisert induksjon av varme fra en infrarød laser. Hver tilnærming har sine fordeler og ulemper. Etikettfri MST kan bruke ukodede innfødte proteiner; Imidlertid er mange analytter, inkludert legemidler, fluoresce i UV-området, noe som kan forstyrre bestemmelsen av nøyaktige KD-verdier. Til sammenligning gir merket MST mulighet for et større mangfold av målbare parvise interaksjoner ved hjelp av fluorescerende merkede sonder festet til ligander med målbare absorbanser i det synlige området i motsetning til UV, noe som begrenser potensialet for å forstyrre signaler fra analytter.
Introduction
Mikroskala termoforese er en relativt ny teknikk for å bestemme disassosiasjonskonstanter (KD) samt hemmingskonstanter (IC50) mellom biokjemisk relevante ligander. Den ledende kommersielle forhandleren for MST (f.eks. NanoTemper) tilbyr to populære MST-teknologier: 1) Label free MST som krever en fluorescerende tag, og 2) merket termoforese ved hjelp av den iboende fluorescensen av proteiner avhengig av antall aromatiske rester som finnes i hvert protein1. En ulempe med etikettfri termoforese er at det i de fleste tilfeller ikke tillater måling av proteinproteininteraksjoner. Det kan imidlertid være mulig å konstruere proteiner uten aromatiske aminosyrer som tryptofan for bruk i etikettfri termoforese2.
MST måler bevegelsen av partikler som svar på induksjon av mikroskopiske temperaturfelt initiert av en infrarød laser i tilgjengelige teknologier1. MST kan brukes til å måle proteinproteininteraksjoner, protein-lipidinteraksjoner, protein-små molekyler, konkurranseeksperimenter og til og med interaksjoner mellom små molekyler så lenge man kan produsere nok signalseparasjon. I tillegg tillater MST måling av membranproteinbaserte interaksjoner innebygd i enten liposomer eller nanodiscs. Merket termoforese utnytter bruken av fluorescerende merkede tagger som muliggjør kjemisk kontrollerbar separasjon av signal mellom ligand og analytt. KD-verdier kan oppnås ved hjelp av termoforese for interaksjoner som involverer proteinbinding ved lave nanomolarkonsentrasjoner, som i de fleste tilfeller er en mye lavere konsentrasjon av protein enn det som kreves for isotermisk kalorimetri (ITC)3. I tillegg har MST ikke strenge bufferkrav som kreves for overflateplasmonresonans (SPR)4 og merket termoforese kan til og med brukes til å måle bindende konstanter av proteiner av interesse fra ikke-fullstendig rensede proteinløsninger5 med genetisk innsatte fluorescerende koder6. En ulempe med MST er at kinetiske parametere ikke kan oppnås lett for MST som i SPR2.
Termoforesemålinger avhenger av den lokale temperaturforskjellen til en løsning. Denne varmen kan genereres fra en infrarød laser. MST-enheten har en fluorescensdetektor koblet til en infrarød (IR) stråle og kan plukke opp endringer i fluorescens fra lokale konsentrasjonsendringer av fluorescerende molekyler på det punktet hvor IR-laseren er målrettet. MST-enheten bruker en IR-målrettet laser koblet direkte til en fluorescensdetektor fokusert på samme tidspunkt som varmen genereres i løsningen. Dette muliggjør robust deteksjon av temperaturendringer som tilsvarer uttømming av molekyler ved varmepunktet generert av IR-laseren. Målt fluorescens reduseres vanligvis nærmere IR-laseren som følge av temperaturøkninger. Forskjellene målt som et resultat kan skyldes flere faktorer, inkludert ladning, størrelse eller solvasjon entropi. Disse forskjellene måles som endringer i fluorescens som følge av induksjon av varme eller bevegelse av molekyler fra varme til kaldere deler av kapillæren.
Når du laster en kapillær med en gitt løsning, er det viktig å forlate luft i hver ende av kapillæren og ikke laste kapillæren helt full. Den kommersielle kapillæren har ca 10 μL løsning. Man kan oppnå nøyaktige målinger med 5 μL løsning så lenge løsningen er manipulert til midten av kapillæren, det er ingen luftbobler (potensielt degas før lasting av kapillær), og man er forsiktig med å laste stativet for ikke å jostle løsningen fra midten av kapillæren, hvor den infrarøde laseren er målrettet. Hvis laseren ikke kommer i kontakt fullt ut med løsningen, vil resultatet mest sannsynlig være en av tre ubrukelige utganger for den konsentrasjonen: 1) ingen eller lav fluorescensdeteksjon, 2) høyere fluorescensdeteksjon (potensielt med hakket topp), eller 3) fluorescensdeteksjon innenfor andre verdier fra gitt titrering, men med en hakket og uberørt topp.
For merket termoforese er det optimalt å ha et fluorescenssignal over 200 og under 2000 fluorescensenheter7. MST-enheten bruker en rekke LED-intensiteter fra 0 til 100, som kan velges for å oppnå et signal over 200 eller under 2000. Alternativt kan man bruke forskjellige konsentrasjoner av den merkede liganden for å endre fluorescenssignalet til et optimalt nivå. Det er viktig å kjøre en cap scan med en gitt MST-måling som referanse når du analyserer data, da en dårlig cap scan ofte kan resultere i et punkt som senere kan bestemmes å være en outlier. Hver kjøring bør ta omtrent 30 minutter hvis du måler en enkelt MST-strøm med en hetteskanning. De kommersielle enhetene tillater endringer i MST-strøm. I eldre programvareversjoner kan dette angis fra 0 til 100. og i senere versjoner kan man velge lav, middels eller høy MST. For å oppnå robuste spor, kan det hende at en forsker må prøve hver av disse og bestemme hvilken MST-innstilling som resulterer i de mest robuste dataene for en gitt interaksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av materialer
- Forbered fosfatbufret saltvann (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 og 2 mM KH2PO4, pH 7,41.
- Forbered NTA-Atto 647 N fargestoff. Fortynn lager NTA-Atto 647 N fargestoff til 100 nM fra en 100% DMSO-løsning til PBS uten Tween.
- Express Vam7-His8 – Protein som fusjonsprotein i E. coli og rense ved hjelp av Ni-NTA og størrelseseksklusjonskromatografi8.
- Titer analytten i PBS-bufferen. Hvis analytten er i en annen buffer, er merket MST ikke spesielt følsom for mindre bufferforskjeller fra molekyler som DMSO, med mindre innholdet i analyttbufferen samhandler med merket protein.
2. Klargjøring av MST-enheten
- Slå på strømbryteren på baksiden av enheten.
- Åpne kontrollprogramvaren og sørg for at den bærbare datamaskinen er på og i tilkoblet status på datamaskinen som er koblet til enheten.
- Angi fluorescens- og MST-innstillinger for dette eksperimentet. Sett MST Før til 3 s, MST på 30 s og Fluorescence recovery (Fluo.) etter 1 s. Før tiltak innledende fluorescens og krever ikke lange tider; MST er den faktiske tiden for likevekt som skal nås etter varmeinduksjon.
- Tabell over kapillærer: For hvert kapillærrør skriver du inn navnet på målet (ligand), navnet på liganden (analytt), konsentrasjonen av målet og den høyeste titreringskonsentrasjonen og bruker autofylltitreringsforhold. Skriv for eksempel inn 50 nM for målkonsentrasjonen av Vam7-His8, Vam7-His8 for målnavn, (1,2-dioktanoylfosfatidsyre) Di-C8 PA for ligandnavn, og den høyeste konsentrasjonen ligand velger 1:1 og drar ned til autofyllspor 2-16.
- Kjør en Cap Scan for å velge riktig LED (20% LED (forhåndsinnstilling)) basert på signalet til målproteinet og juster mellom 200 og 2000 fluorescensenheter for merket MST. Cap Scans skal vise ensartede avrundede klokkeformede topper.
- Velg en rekke MST-krefter, og angi verdier for hver av dem som skal testes for den mest robuste bindingstilpasning, og trykk start cap scan + måling, og skann forskjellige verdier for å bestemme de beste driftsforholdene for gitt interaksjon som testes.
- Bestem MST-kraften med best mulig passform ved hjelp av analyseprogramvaren og forhåndsinnstillingen for termoforese med Tjump. Analyser passer i henhold til de fleste fluorescensseparasjoner mellom laveste og høyeste konsentrasjon sammenlignet med MST-kraften med best passform og velg MST-kraften for replikeringsforsøk.
- Finn ut om photobleaching har skjedd mellom første og andre kjøring ved å gå til analyseprogramvaren og bytte analysen til ekspertmodus. Velg deretter fluorescens i stedet for termoforese for analyse. Velg ekspertmodus og deretter fotobleaching.
3. Forberedelse av prøver for merket MST
- Bring Vam7-His8-løsningen til en konsentrasjon på 200 nM i PBS uten Tween.
- Bring NTA-Atto 647 fargestoffet til 100 nM i PBS uten Tween.
- Bland Vam7-His8 og NTA-Atto 647 fargestoff med et volumtric ratio på 1:1 og la det sitte ved romtemperatur dekket av lys i 30 minutter. Bestem riktig konsentrasjon av målprotein som i pkt. 2.5 (se Supplement on utilization of KD of Ni-NTA dye as demonstrated in video).
- Sentrifugeblanding av NTA-Atto 647 N fargestoff og protein i 10 min i et mørkt rom ved hjelp av en bordplate sentrifuge på ca. 8161 x g.
- Oppbevar blandingen ved 4 °C etter eksperimentet eller på is under forsøket for gjenbruk i løpet av få timer om nødvendig for å hindre protein i å denaturere.
- Bruk NT-konsentrasjonsfinneren til å bestemme konsentrasjonsområdet som trengs for titrering.
- Bring Di-C8 PA til passende maksimal konsentrasjon i vann.
- Titer analytten ved hjelp av en 1:1 seriell fortynning i PBS-buffer for 16 konsentrasjoner basert på forrige trinn. I motsetning til SPR er termoforese ikke like følsom for bufferforskjeller.
4. MST av prøver
- Slå på enheten og den tilkoblede bærbare datamaskinen.
- Trykk pil opp foran på maskinen og skyv kapillærstativet ut.
- Last kapillærene i stativet med høyest konsentrasjon i posisjon 1.
- I kontrollprogramvaren velger du den røde kanalen som tilsvarer NTA-Atto 647 N.
- Angi konsentrasjons-, posisjons- og navneinformasjon for hver kapillær i tabellen over kapillærer.
- Kjør en kapillærskanning ved å trykke start cap scan ved 20% LED (forhåndsinnstilt) og justere i henhold til mellom 200 og 2000 fluorescensenheter ved hjelp av enten LED-intensitetsinnstillinger eller konsentrasjon av ligand (merket protein).
- Velg et område med MST-strøm.
- Start Cap Scan + MST-måling.
- Analyser ved hjelp av analyseprogramvaren.
5. Analyse av MST-data
MERK: Analyseprogramvaren fra Nanotemper er proprietær og utføres ved hjelp av M.O. Affinity Analysis. Det finnes ulike måter å måle bindende affiniteter basert på enten fluorescens eller termoforese. Nyere versjoner av denne programvaren er forhåndsinnstilt for automatisk å evaluere data ved hjelp av termoforese og er forhåndsinnstilt for å bruke Thermophoresis med Tjump dra nytte av begge målingene. Alternativt kan man velge enten Tjump alene eller Thermophoresis alene. I tillegg tillater analyseprogramvaren estimerte affinitetsmålinger ved hjelp av innledende fluorescens. Du får bare tilgang til disse innstillingene i ekspertmodus.
- Sett evalueringsstrategien i analyseprogramvaren til ekspert ved å klikke på boksen for lynet ved siden av et datasett i skjermbildet Datavalg. Analyseprogramvaren er forhåndsinnstilt for analyse til MST-analyse; En forsker kan imidlertid velge Opprett ny analyse og velge Innledende fluorescensanalyse for å estimere bindende affiniteter basert på innledende fluorescens. Ekspertmodus er også tilgjengelig for innledende fluorescens. I analysen beskrevet nedenfor ble termoforese og Tjump brukt til å bestemme KD for presentert av Vam7-His8 med sitt naturlige substrat, lipidfosfatidsyren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette er et eksempel på utdata som bruker affinitetsanalysen. Den merkede MST ble brukt til å bestemme bindingskonstanten til Vam7-His8 til den løselige dioktanoyl (DiC8) PA av et av sine naturlige substrater9. Figur 1 presenterer de termoforetiske sporene fra en studie av en 1:1-titrering av DiC8 PA fra 500 μM mot 50 nM Vam7-His8. Innledende fluorescens (tid før infrarød laser slått på), Tjump (tid først etter at infrarød laser slått på) og termoforese (når partikler når likevekt med temperatur) vises. Man kan beregne en KD fra en av disse målingene alene eller kan bruke en kombinasjon av Tjump og termoforese med tanke på to av disse målingene.
I figur 2 vises en metningskurve for termoforesen med Tjump-utgang fra analyseprogramvaren. Som vist i figur 2, kan metningskurven tegnes inn fra disse resultatene; Det kan imidlertid være vanskelig å beregne en metningskurve da Fnorm ikke starter fra null. For å omgå dette problemet kan dataene normaliseres manuelt, eller utdataene kan settes til brøkdelsbundet bestemt av analyseprogramvaren. Vanligvis bestemmes MST-resultatene ved hjelp av en loggskala som vist i figur 3. Analyseprogramvaren står automatisk for kontoproteinkonsentrasjon for å bestemme bindende affinitet ved å velge KD-modellen og legge inn proteinkonsentrasjonen. Hill-modellen i analyseprogramvaren kan også brukes, som ikke vurderer proteinkonsentrasjon, men kan potensielt gi et mål på kooperativitet for en gitt interaksjon. Ved å eksportere begge utgangene fra analyseprogramvaren og plotte i tredjepartsprogramvare, kan man få en KD-måling som vist i figur 3. Det skal bemerkes at den kritiske micellekonsentrasjonen (CMC) av dioctanoylglyserofosfolipider er >3 mM, noe som indikerer at disse eksperimentene opererer langt under CMC10.
Figur 1: MST-spor av Vam7-His8 til DiC8 PA. Spor vises for PA analytt til NTA-Atto 647N merket Vam7-His8 ligand målt i den røde kanalen. Opprinnelig fluorescens ble målt ved romtemperatur i 5 s (A) før du slo på infrarød laser. Tjump (B) måles i de første sekundene etter induksjon av varme fra den innebygde infrarøde laseren og måler fluorescensforskjeller som er tilstede når IR-laser først slås på før termoforetisk bevegelse av partikler måles. Termoforese (C) måles etter at molekyler likevekter fra bevegelsen indusert av varme fra den infrarøde laseren på grunn av termoforetiske bevegelsesforskjeller på grunn av faktorer som størrelse, ladning, solvenasjon entropi eller konformasjonsendring av partikkel som måles med hensyn til titrert analytt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Metningsbinding som bestemmes av eksporterte MST-resultater ved hjelp av tredjepartsprogramvare. Normaliserte fluorescensresultater eksportert fra analyseprogramvaren. Dataene ble eksportert og tegnet inn ved hjelp av en-områdes spesifikk bindingsmodell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bindingsaffinitet av Vam7-His8 til DiC8 PA ved hjelp av en sigmoidal modell. Analyse av eksporterte data fra figur 1 eksportert fra analyseprogramvaren ved hjelp av normaliseringen Fnorm [%]. Ved å ta loggen over konsentrasjonene av DiC8 PA plottet mot Fnorm ved hjelp av Graphpad Prism v.7 ved hjelp av Sigmoidal, 4PL, X er log (konsentrasjon) modell tillater en passform som resulterer i en KD på 89 ± 18.0 μM for Vam7-His8 bindende affinitet til DiC8 PA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestemmelsen av Vam7-His8binding til DiC8-PA ga en robust montert KD for den gitte interaksjonen, som er litt lavere affinitet enn den målte KD av Vam7-His8 til PA liposomer (upublisert). Denne forskjellen skyldes mest sannsynlig mangel på en membran, noe som generelt resulterer i lavere affinitet for membranspesifikke lipidbindingsinteraksjoner og viser derfor rollen for liposomets membranstillas til denne interaksjonen11.
For å kunne fastslå styrken på MST-data ytterligere, må en forsker undersøke både formen på sporene fra figur 1 og separasjonen av sporene fra den valgte analysemetoden. Når vi så på sporene fra figur 1, resulterte de fleste konsentrasjoner i et klart spor som bestemt av utjevning av termoforesedelen av kurven. I noen tilfeller kan spor som tilsvarer reaksjoner som inneholder høyere konsentrasjoner av analytt mot slutten av fluorescerende måling skyldes aggregering i prøvetilslutningen til prøvekapillærene, som kan løses ved tillegg av enten eller begge Pluronic eller Tween til buffer12. Imidlertid kan vaskemidler som disse ikke være egnet for protein-lipid interaksjoner13. For å teste for ikke-spesifikk binding for denne typen protein-lipid interaksjon kan man legge til BSA, øke saltkonsentrasjonen eller bruke glyserol i bufferen og teste om dette påvirker estimert KD14,15.
Separasjon bestemmes av forskjellen i Fnorm mellom høyeste og laveste konsentrasjonsmåling for den gitte interaksjonen. Som vist i figur 2 var separasjonen for denne interaksjonen ca. 75 fluorescensenheter. Generelt sett bør en separasjon av minst 5 fluorescensenheter oppnås for å trygt stole på MST-data med ukjente kjemiske affinitetsmålinger. Hvis en robust KD-passform oppnås ved litt lavere separasjon, kan man fortsatt vurdere slike data hvis de korresponderte med affinitetsmålinger som brukes via en annen teknikk som SPR eller ITC.
Fordi noen av de termoforetiske sporene viste noe klebrighet i prøven, var utgangen som ble valgt for figur 3 en kombinasjon av termoforese med Tjump. Denne innstillingen er den forhåndsvalgte innstillingen i de fleste senere versjoner av analyseprogramvaren. Figur 3 indikerer en robust passform til en sigmoidal bindingsaffinitetsmodell, da det var klar metning med en titrering på 12 punkt 1:1. Enheten tillater at 16 poeng tas i en gitt løpetur, og mange interaksjoner krever alle disse punktene for å oppnå en sterk bindende affinitetsmåling. For å oppnå større tillit, bør denne studien gjentas med nye kapillærer to eller flere ganger som krever totalt 36 kapillære rør for dette eksperimentet. I tillegg kan man prøve en annen teknikk som SPR for å bekrefte disse dataene for å sikre pålitelig rapportering av affinitetskonstanter som vi tidligere har gjort8,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av et stipend fra National Science Foundation (MCB 1818310) til RAF. Dette arbeidet ble delvis støttet av Chemical Biology Core Facility/Protein Crystallography Unit ved H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
| Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |
References
- Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
- Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, nP. Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains. Gene. 163 (1), 1-11 (1995).
- Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100 (2010).
- Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).
- Starr, M. L., et al. Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).
- Miner, G. L., et al. The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain. Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models. Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).
- Zhao, H., Lappalainen, P. A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions. Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).
- Kaufmann, S. H. Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents. Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).
- le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
- Corradi, V., et al.
- Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective. SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).
- Sparks, R. P., et al. A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion. Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).
