Summary
La termoforesis a microescala obtiene constantes de unión rápidamente a bajo costo de material. La termoforesis a microescala etiquetada o sin etiqueta está disponible comercialmente; sin embargo, la termoforesis sin etiquetas no es capaz de la diversidad de mediciones de interacción que se pueden realizar utilizando etiquetas fluorescentes. Proporcionamos un protocolo para mediciones de termoforesis etiquetadas.
Abstract
La capacidad de determinar la afinidad de unión de los lípidos a las proteínas es una parte esencial de la comprensión de las interacciones proteína-lípido en el tráfico de membranas, la transducción de señales y la remodelación citoesquelética. Las herramientas clásicas para medir tales interacciones incluyen la resonancia de plasmón de superficie (SPR) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Si bien son herramientas poderosas, estos enfoques tienen contratiempos. ItC requiere grandes cantidades de proteína purificada, así como lípidos, que pueden ser costosos y difíciles de producir. Además, el ITC y el SPR consumen mucho tiempo, lo que podría aumentar significativamente el costo de realizar estos experimentos. Una forma de evitar estas restricciones es utilizar la técnica relativamente nueva de termoforesis a microescala (MST). MST es rápido y rentable utilizando pequeñas cantidades de muestra para obtener una curva de saturación para un evento de unión dado. Actualmente hay dos tipos de sistemas MST disponibles. Un tipo de MST requiere etiquetado con un fluoróforo en el espectro azul o rojo. El segundo sistema se basa en la fluorescencia intrínseca de los aminoácidos aromáticos en el rango UV. Ambos sistemas detectan el movimiento de las moléculas en respuesta a la inducción localizada de calor de un láser infrarrojo. Cada enfoque tiene sus ventajas y desventajas. El MST sin etiquetas puede usar proteínas nativas sin etiquetar; sin embargo, muchos analitos, incluidos los productos farmacéuticos, emiten fluorescencia en el rango UV, lo que puede interferir con la determinación de valores precisos de KD. En comparación, el MST etiquetado permite una mayor diversidad de interacciones medibles por pares utilizando sondas marcadas fluorescentemente unidas a ligandos con absorbancias medibles en el rango visible en lugar de UV, lo que limita el potencial de interferencia de señales de analitos.
Introduction
La termoforesis a microescala es una técnica relativamente nueva para determinar constantes de disociación (KD) y constantes de inhibición (IC50) entre ligandos bioquímicamente relevantes. El minorista comercial líder para MST (por ejemplo, NanoTemper) ofrece dos tecnologías populares de MST: 1) MST sin etiquetas que requiere una etiqueta fluorescente, y 2) termoforesis etiquetada utilizando la fluorescencia inherente de proteínas dependientes del número de residuos aromáticos presentes en cada proteína1. Una desventaja de la termoforesis sin etiqueta es que, en la mayoría de los casos, no permite la medición de las interacciones proteína-proteína. Sin embargo, puede ser posible diseñar proteínas sin aminoácidos aromáticos como el triptófano para su uso en la termoforesis sin etiqueta2.
MST mide el movimiento de partículas en respuesta a la inducción de campos de temperatura microscópicos iniciados por un láser infrarrojo en las tecnologías actualmente disponibles1. MST se puede utilizar para medir las interacciones proteína-proteína, las interacciones proteína-lípido, la molécula pequeña de proteína, los experimentos de competencia e incluso las interacciones entre moléculas pequeñas, siempre y cuando se pueda producir suficiente separación de señales. Además, MST permite la medición de interacciones basadas en membrana-proteína incrustadas en liposomas o nanodiscos. La termoforesis etiquetada aprovecha el uso de etiquetas marcadas fluorescentemente que permiten la separación químicamente controlable de la señal entre el ligando y el analito. Los valores de KD se pueden obtener mediante termoforesis para interacciones que implican la unión a proteínas a bajas concentraciones nanomolares, que en la mayoría de los casos es una concentración de proteína mucho menor que la requerida para la calorimetría isotérmica (ITC)3. Además, MST no tiene requisitos de amortiguación estrictos como se requiere para la resonancia de plasmón de superficie (SPR)4 y la termoforesis etiquetada incluso se puede usar para medir constantes de unión de proteínas de interés a partir de soluciones proteicas no completamente purificadas5 con etiquetas fluorescentes insertadas genéticamente6. Una desventaja de MST es que los parámetros cinéticos no se pueden obtener fácilmente para MST como en SPR2.
Las mediciones de termoforesis dependen de la diferencia de temperatura local de una solución. Este calor se puede generar a partir de un láser infrarrojo. El dispositivo MST tiene un detector de fluorescencia acoplado a un haz infrarrojo (IR) y puede detectar cambios en la fluorescencia de los cambios de concentración local de las moléculas fluorescentes en el punto donde se dirige el láser IR. El dispositivo MST utiliza un láser dirigido a IR acoplado directamente a un detector de fluorescencia enfocado en el mismo punto en el que se genera el calor en la solución. Esto permite una detección robusta de los cambios de temperatura correspondientes al agotamiento de las moléculas en el punto de calor generado por el láser IR. La fluorescencia medida generalmente disminuye más cerca del láser IR en respuesta a los aumentos de temperatura. Las diferencias medidas como resultado pueden deberse a múltiples factores, incluida la carga, el tamaño o la entropía de la solvatación. Estas diferencias se miden como cambios en la fluorescencia en respuesta a la inducción de calor o al movimiento de moléculas de partes calientes a más frías del capilar.
Al cargar un capilar con una solución dada, es importante dejar aire en cada extremo del capilar y no cargar el capilar completamente lleno. El capilar comercial contiene aproximadamente 10 μL de solución. Uno puede lograr mediciones precisas con 5 μL de solución siempre que la solución se manipule hasta el centro del capilar, no haya burbujas de aire (potencialmente desgasificación antes de la carga capilar), y uno tenga cuidado al cargar el bastidor para no empujar la solución desde el centro del capilar, donde se dirige el láser infrarrojo. Si el láser no entra en contacto completamente con la solución, lo más probable es que el resultado sea una de las tres salidas inutilizables para esa concentración: 1) detección de fluorescencia nula o baja, 2) detección de fluorescencia más alta (potencialmente con pico irregular), o 3) detección de fluorescencia dentro de otros valores de titulación dada, pero con un pico irregular y no redondeado.
Para la termoforesis etiquetada es óptimo tener una señal de fluorescencia por encima de 200 y por debajo de 2000 unidades de fluorescencia7. El dispositivo MST utiliza un rango de intensidades LED de 0 a 100, que se pueden seleccionar para lograr una señal superior a 200 o inferior a 2000. Alternativamente, se pueden usar diferentes concentraciones del ligando marcado para modificar la señal de fluorescencia a un nivel óptimo. Es importante ejecutar un escaneo de tapa con una medición MST dada como referencia al analizar datos, ya que un escaneo de tapa deficiente a menudo puede resultar en un punto que luego se puede determinar que es un valor atípico. Cada carrera debe tomar aproximadamente 30 minutos si se mide una sola potencia MST con un escaneo de tapa. Los dispositivos comerciales permiten cambios en la potencia MST. En versiones de software anteriores, esto se podía establecer de 0 a 100; y en versiones posteriores se puede seleccionar MST bajo, medio o alto. Para lograr trazas robustas, un investigador puede necesitar probar cada una de ellas y decidir qué configuración de MST da como resultado los datos más robustos para una interacción determinada.
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Protocol
1. Preparación de materiales
- Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 y 2 mM KH2PO4, pH 7.41.
- Preparar el tinte NTA-Atto 647 N. Diluya el tinte NTA-Atto 647 N a 100 nM de una solución 100% DMSO en PBS sin Tween.
- Express Vam7-His8 – Proteína como proteína de fusión en E. coli y purificar mediante Cromatografía de Ni-NTA y exclusión de tamaño8.
- Valore el analito en el tampón PBS. Si el analito está en un tampón diferente, el MST etiquetado no es particularmente sensible a las diferencias menores del tampón de moléculas como el DMSO, a menos que el contenido del tampón de analito interactúe con la proteína marcada.
2. Preparación del dispositivo MST
- Encienda el interruptor de encendido en la parte posterior del dispositivo.
- Abra el software de control y asegúrese de que la computadora portátil esté encendida y en estado de conexión en la computadora conectada al dispositivo.
- Introduzca la configuración de fluorescencia y MST para este experimento. Establezca MST Antes a 3 s, MST en 30 s y Recuperación de fluorescencia (Fluo.) después de 1 s. Antes mide la fluorescencia inicial y no requiere largos tiempos; MST es la cantidad real de tiempo para que se alcance el equilibrio después de la inducción de calor.
- Tabla de capilares: Para cada tubo capilar, ingrese el nombre del objetivo (ligando), el nombre del ligando (analito), la concentración del objetivo y la concentración de titulación más alta y use la relación de titulación de autollen. Por ejemplo, introduzca 50 nM para la concentración objetivo de Vam7-His8, Vam7-His8 para el nombre del objetivo, (ácido fosfatídico 1,2-dioctanoil) Di-C8 PA para el nombre del ligando, y la concentración más alta el ligando seleccionando 1:1 y arrastrándolo hacia abajo hasta las ranuras de autollenado 2-16.
- Ejecute un escaneo de tapa para seleccionar el LED apropiado (20% LED (preestablecido)) en función de la señal de la proteína objetivo y ajuste entre 200 y 2000 unidades de fluorescencia para MST etiquetado. Los escaneos de tapa deben mostrar picos uniformes redondeados en forma de campana.
- Seleccione un rango de potencias MST e ingrese valores para cada uno para probar el ajuste de unión más robusto y presione Start Cap Scan + Measurement, escaneando diferentes valores para determinar las mejores condiciones de operación para una interacción dada que se está probando.
- Determine la potencia MST con el mejor ajuste utilizando el software de análisis y el ajuste preestablecido para termoforesis con Tjump. Analice los ajustes de acuerdo con la mayor parte de la separación de fluorescencia entre la concentración más baja y la más alta en comparación con la potencia MST con el mejor ajuste y seleccione la potencia MST para replicar los ensayos.
- Determine si el fotoblanqueo se ha producido entre la primera y la segunda ejecución yendo al software de análisis y cambiando el análisis al modo experto. A continuación, seleccione fluorescencia en lugar de termoforesis para el análisis. Seleccione el modo experto y luego el fotoblanqueo.
3. Preparación de muestras para MST etiquetado
- Lleve la solución Vam7-His8 a una concentración de 200 nM en PBS sin Tween.
- Lleve el tinte NTA-Atto 647 a 100 nM en PBS sin Tween.
- Mezcle el tinte Vam7-His8 y NTA-Atto 647 en una proporción volumétrica de 1:1 y deje reposar a temperatura ambiente cubierto de luz durante 30 min. Determinar la concentración adecuada de proteína diana como en la sección 2.5 (ver Suplemento sobre la utilización de KD de colorante Ni-NTA como se demuestra en vídeo).
- Mezcla centrífuga de colorante NTA-Atto 647 N y proteína durante 10 min en una habitación oscura utilizando una centrífuga de mesa a aproximadamente 8.161 x g.
- Guarde la mezcla a 4 °C después del experimento o en hielo durante el experimento para reutilizarla en unas pocas horas si es necesario para evitar que la proteína se desnaturalice.
- Utilice el buscador de concentración NT para determinar el rango de concentración necesario para la titulación.
- Llevar Di-C8 PA a la concentración máxima adecuada en agua.
- Valore el analito utilizando una dilución en serie 1:1 en tampón PBS para 16 concentraciones basadas en el paso anterior. A diferencia de SPR, la termoforesis no es tan sensible a las diferencias de amortiguación.
4. MST de muestras
- Encienda el dispositivo y la computadora portátil conectada.
- Presione la flecha hacia arriba en la parte frontal de la máquina y deslice la rejilla capilar hacia afuera.
- Cargue los capilares en el bastidor con la mayor concentración en la posición 1.
- En el software de control, seleccione el canal rojo correspondiente a NTA-Atto 647 N.
- Introduzca la información de concentración, posición y nombre de cada capilar en la Tabla de capilares.
- Ejecute un escaneo capilar presionando Start Cap Scan al 20% de LED (preestablecido) y ajuste de acuerdo con entre 200 y 2000 unidades de fluorescencia utilizando la configuración de intensidad del LED o la concentración de ligando (proteína etiquetada).
- Seleccione un rango de potencia MST.
- Inicie El escaneo de la tapa + medición MST.
- Analice utilizando el software de análisis.
5. Análisis de los datos del MST
NOTA: El software de análisis proporcionado por Nanotemper es propietario y se realiza utilizando M.O. Affinity Analysis. Existen diferentes formas de medir las afinidades de unión basadas en la fluorescencia o la termoforesis. Las versiones más recientes de este software están preestablecidas para evaluar automáticamente los datos mediante termoforesis y están preestablecidas para usar Thermophoresis con Tjump aprovechando ambas mediciones. Alternativamente, se puede seleccionar Tjump solo o Termoforesis solo. Además, el software de análisis permite mediciones de afinidad estimada utilizando fluorescencia inicial. Solo se puede acceder a esta configuración en modo experto.
- Establezca la estrategia de evaluación en el software de análisis en experto haciendo clic en el cuadro del rayo junto a un conjunto de datos en la pantalla Selección de datos. El software de análisis está preestablecido para analizar a MST Analysis; sin embargo, un investigador puede seleccionar Crear nuevo análisis y seleccionar Análisis de fluorescencia inicial para estimar las afinidades de unión basadas en la fluorescencia inicial. El modo experto también está disponible para la fluorescencia inicial. En el análisis descrito a continuación, se utilizó termoforesis y Tjump para determinar el KD del presentado de Vam7-His8 con su sustrato natural, el ácido fosfatídico lipídico.
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Representative Results
Esta es una salida de muestra utilizando el análisis de afinidad. El MST etiquetado se utilizó para determinar la constante de unión del Vam7-His8 al dioctanoilo soluble (DiC8) PA de uno de sus sustratos naturales9. La Figura 1 presenta los rastros termoforéticos de un ensayo de una titulación 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 μM contra 50 nM de Vam7-His8. Se muestra la fluorescencia inicial (tiempo antes de que se encienda el láser infrarrojo), Tjump (tiempo inicialmente después de que se encienda el láser infrarrojo) y la termoforesis (una vez que las partículas alcanzan el equilibrio con la temperatura). Uno puede calcular un KD a partir de cualquiera de estas mediciones solamente o puede usar una combinación de Tjump y termoforesis considerando dos de estas mediciones.
En la Figura 2, se muestra una curva de saturación para la termoforesis con salida Tjump del software de análisis. Como se muestra en la Figura 2, la curva de saturación se puede trazar a partir de estos resultados; sin embargo, puede ser difícil calcular una curva de saturación ya que Fnorm no comienza desde cero. Para evitar este problema, los datos se pueden normalizar manualmente o la salida se puede establecer en el límite de fracción determinado por el software de análisis. Generalmente, los resultados de MST se determinan utilizando una escala logarítmica como se muestra en la Figura 3. El software de análisis contabiliza automáticamente la concentración de proteínas de la cuenta para determinar la afinidad de unión seleccionando el modelo KD e ingresando la concentración de proteínas. También se puede usar el modelo Hill en el software de análisis, que no considera la concentración de proteínas, pero potencialmente puede dar una medida de cooperatividad para una interacción dada. Exportando cualquiera de los resultados del software de análisis y trazando en software de terceros, se puede obtener una medición de KD como se muestra en la Figura 3. Cabe señalar que la concentración crítica de micelas (CMC) de dioctanoyl glycerophosphospholipids es de >3 mM, lo que indica que estos experimentos están operando muy por debajo de la CMC10.
Figura 1: Trazas MST de Vam7-His8 a DiC8 PA. Se muestran trazas para el analito de PA al ligando Vam7-His8 etiquetado con NTA-Atto 647N medido en el canal rojo. La fluorescencia inicial se midió a temperatura ambiente durante 5 s (A) antes de encender el láser infrarrojo. El salto (B) se mide en los segundos iniciales después de la inducción de calor del láser infrarrojo incorporado y mide las diferencias de fluorescencia presentes cuando el láser IR se enciende por primera vez antes de medir el movimiento termoforético de las partículas. La termoforesis (C) se mide después de que las moléculas se equilibran a partir del movimiento inducido por el calor del láser infrarrojo debido a las diferencias de movimiento termoforético debido a factores como el tamaño, la carga, la entropía de la solvatación o el cambio conformacional de la partícula que se mide con respecto al analito titulado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Enlace de saturación determinado a partir de los resultados de MST exportados utilizando software de terceros. Resultados de fluorescencia normalizados exportados desde el software de análisis. Los datos se exportaron y trazaron utilizando un modelo de enlace específico de un sitio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Afinidad de unión de Vam7-His8 a DiC8 PA utilizando un modelo sigmoidal. Análisis de los datos exportados de la Figura 1 exportados desde el software de análisis utilizando la normalización Fnorm [%]. Tomando el log de las concentraciones de DiC8 PA trazadas contra Fnorm usando Graphpad Prism v.7 usando Sigmoidal, 4PL, X es log(concentración) el modelo permite un ajuste que resulta en un KD de 89 ± 18.0 μM para la afinidad de unión Vam7-His8 a DiC8 PA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La determinación de Vam7-His8unión a DiC8-PA proporcionó un KD ajustado robusto para la interacción dada, que es una afinidad ligeramente menor que el KD medido de Vam7-His8 a los liposomas pa (no publicado). Esta diferencia se debe muy probablemente a la falta de una membrana, lo que generalmente resulta en una menor afinidad por las interacciones de unión lipídica específicas de la membrana y, por lo tanto, demuestra el papel del andamio de membrana del liposoma a esta interacción11.
Para determinar aún más la fuerza de los datos de MST, un investigador debe examinar tanto la forma de los rastros de la Figura 1 como la separación de los rastros del método de análisis elegido. Al observar los rastros de la Figura 1, la mayoría de las concentraciones dieron como resultado un rastro claro determinado por la nivelación de la parte de termoforesis de la curva. En algunos casos, los rastros correspondientes a reacciones que contienen concentraciones más altas de analito hacia el final de la medición fluorescente podrían deberse a la agregación en la adherencia de la muestra a los capilares de la muestra, que puede remediarse mediante adiciones de uno o ambos Pluronic o Tween al tampón12. Sin embargo, detergentes como estos pueden no ser adecuados para las interacciones proteína-lípido13. Para probar la unión inespecífica para este tipo de interacción proteína-lípido, se puede agregar BSA, aumentar la concentración de sal o usar glicerol en el tampón y probar si esto afecta el KD14 estimado,15.
La separación está determinada por la diferencia en Fnorm entre la medición de concentración más alta y más baja para la interacción dada. Como se muestra en la Figura 2, la separación para esta interacción fue de aproximadamente 75 unidades de fluorescencia. En términos generales, se debe lograr una separación de al menos 5 unidades de fluorescencia para confiar con confianza en los datos de MST de mediciones de afinidad química desconocidas. Si se logra un ajuste robusto de KD con una separación ligeramente menor, uno podría considerar dichos datos si correspondieran a mediciones de afinidad utilizadas a través de otra técnica como SPR o ITC.
Debido a que algunos de los rastros termoforéticos mostraron cierta pegajosidad en la muestra, la salida elegida para la Figura 3 fue una combinación de termoforesis con Tjump. Esta configuración es la configuración preseleccionada en la mayoría de las versiones posteriores del software de análisis. La Figura 3 indica un ajuste robusto a un modelo de afinidad de unión sigmoidal, ya que hubo una clara saturación con una titulación de 12 puntos 1: 1. El dispositivo permite tomar 16 puntos en una ejecución determinada, y muchas interacciones requieren todos estos puntos para lograr una fuerte medición de afinidad de unión. Para lograr una mayor confianza, este ensayo debe repetirse con nuevos capilares dos o más veces requiriendo un total de 36 tubos capilares para este experimento. Además, se podría probar otra técnica como SPR para corroborar estos datos con el fin de garantizar un informe fiable de las constantes de afinidad como hemos hecho anteriormente8,16.
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Disclosures
Los autores declaran que no existe un posible conflicto de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por una subvención de la National Science Foundation (MCB 1818310) a la RAF. Este trabajo fue apoyado en parte por la Instalación Básica de Biología Química / Unidad de Cristalografía de Proteínas en el Centro oncológico H. Lee Moffitt (NIH / NCI: P30-CA076292).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
| Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |
References
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