Многомерная система кокультуры для моделирования плоского квадроцикла Прогрессирование карциномы

Summary

Система модели in vitro была разработана для захвата архитектурных изменений тканей при плоской карциноматической карциномате легких (LUSC) прогрессии в трехмерной (3D) совместной культуре с связанными с раком фибробластами (CAFs). Эта органоидная система обеспечивает уникальную платформу для изучения роли различных опухолевых клеток, интродуцированных и насущных изменений, которые модулируют фенотип опухоли.

Abstract

Опухолево-стромноговые взаимодействия играют решающую роль в развитии плоской карциномы легких (LUSC). Однако понимание того, как эти динамические взаимодействия способствуют изменениям в области архитектуры, наблюдаемым во время опухолевого генеза, остается сложным из-за отсутствия соответствующих моделей. В этом протоколе мы описываем генерацию 3D-модели кокультуры с использованием культуры первичных клеток LUSC, известной как TUM622. Tum622 клетки были созданы из LUSC пациента полученных ксенотрансплантат (PDX) и имеют уникальное свойство формировать ацинар-подобных структур, когда семенами в подвале мембраны матрицы. Мы демонстрируем, что TUM622 acini в 3D-кокультуре переизглашает ключевые особенности архитектуры тканей во время прогрессии LUSC, а также динамические взаимодействия между клетками LUSC и компонентами микроокружения опухоли (TME), включая внеклеточные матрицы (ECM) и связанные с раком фибробласты (CAFs). Мы также адаптируем наш основной 3D культивирование, чтобы продемонстрировать, как эта система может быть использована для различных анализов ниже по течению. В целом, эта органоидная модель создает биологически богатую и адаптируемую платформу, которая позволяет получить представление о клеточных и внутренних механизмов, которые способствуют нарушению эпителиальной архитектуры во время прогрессирования карциномы и помогут поиск новых терапевтических целей и диагностических маркеров.

Introduction

Рак легких является основной причиной смертности, связанной с раком во всем мире. Карцинома легких плоскоклеточной (LUSC), которая является вторым наиболее распространенным типом немелкоклеточного рака легких (NSCLC) и составляет примерно 30% всех раковых заболеваний легких, часто диагностируется на поздних стадиях и имеет плохой прогноз¹. Варианты лечения для пациентов LUSC являются одной из основных неудовлетворенных потребностей, которые могут быть улучшены путем лучшего понимания основных клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют LUSC опухолевого.

Как и в большинстве случаев рака человека, патогенез ....

Protocol

1. Пропускные и культивирование TUM622 ячеек и CAFs в 2D-культурах

1. Пропуск и культивирование клеток TUM622
   1. Теплый 3D культуры средних и клеточных реагентов диссоциации (см. Таблица материалов) для TUM622 клеток при 37 градусов по Цельсию.
   2. Прохождение TUM622 клеток при 80% вниски в 2D колбах. Как правило, это происходит через неделю после прохождения.
   3. Откажитесь от старой среды из колбы T75 и вымойте один раз с 6 мл буфера HEPES. Избегайте пиптинг непосредственно на клетки.
   4. Аспирируй буфер HEPES. Добавьте 4 мл трипсина/ЭДТА (0,25 мг/мл, см. Таблицу Материалов) для быстрого промывки и о....

Results

TUM622 и CAFs в 2D-культуре
На рисунке 1 представлена типичная морфология клеток TUM622 и CAFs в 2D-культуре. Клетки TUM622 округлены большими ядрами, в то время как ЦАО плоские и удлиненные. Tum622 клетки могут достигать 80%-90% стоек в культуре. Дальнейшее распространение приводит к большему, но более мелкие клетки, агрегированные в колониях, которые не вступают в прямой контакт. В отличие от этого, ЦАФы предпочитают расти при более высо.......

Discussion

Опухоли являются неоднородными тканями, состоящими из раковых клеток, сосуществующих бок о бок со стромальными клетками, такими как связанные с раком фибробласты, эндотелиальные клетки и иммунные клетки в ECM. Вместе эти разнообразные компоненты перекрестного разговора и влияния на микросреду опухоли, играя активную роль в продвижении опухолевого генеза, процесс, который включает в себя прогрессивные изменения в архитектуре опухоли. В идеале, в пробирке модель развития опухоли должна быть в состоянии захватить динамическ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Среда для роста бронхиального эпителия	Lonza	CC-3170
BEGM Cell Strainer 40 мкм	ThermoFisher	352340	Для прохождения клеток TUM622
Расщепленная каспаза 3 антитело	Технология клеточной сигнализации	9661 (RRID:AB_2341188)	Rabbit
CoolRack CFT30	Biocision	BCS-138	Для 3D-культуры
CoolSink XT96F	Biocision	BCS-536	Для 3D-культуры
Cultrex 3D Набор для сбора клеток	Bio-Techne	3448-020-K
Cultrex (предпочтительно для совместной культуры)	Bio-Techne	3443-005-01	Для 3D-культуры
антитело CXCR4	Abcam	Ab124824 (RRID:AB_10975635)	Антитело
к E-кадгерину	кролика BD Biosciences	610182 (RRID:AB_397581)	Мышь
GelCount	Oxford Optronix		Для подсчета и измерения Acini
антитело GM130	BD Biosciences	610822 (RRID:AB_398141)	Мышиная
козья сыворотка	Vector Labs	S1000 (RRID:AB_2336615)	Для иммунофлуоресценции
термоинактивированный FBS	Gibco	10082-147	Для CAFs
Гистологический образец гель	Richard Allan Scientific	HG-4000-012	Антитело к иммунофлуоресцентному
интегрину альфа-6	Millipore Sigma	Mab1378 (RRID:AB_2128317)
Антитело к инволюкрину	Abcam	Ab68 (RRID:AB_305656)	Антитело
к Ki67	Abcam	Ab15580 (RRID:AB_443209)	Rabbit
Lab-Tec II под камеру #1.5 Немецкая система покровных стекол	Nalge Nunc International	155379 (2)	Для 3D культуры
Lab-Tec II под камеру #1.5 Немецкая система защитного стекла	Nalge Nunc International	155409 (8)	Для 3D культуры
L-глютамин	Gibco	25030-081	Для CAFs
Matrigel (предпочтительно для монокультуры)	Corning	356231	Для 3D культуры
p63 антитела	Cell Signaling Technology	13109 (SRRID:AB_2637091)	Rabbit
Pen/Strep	Gibco	15140-122	Для CAFs
Реагенты ReagentPack Subculture Reagents	Lonza	CC-5034	Для диссоциации клеток TUM622
RPMI	ThermoFisher	11875-093	Для CAFs
антитела Sox2	Cell Signaling Technology	3579 (RRID:AB_2195767)	Rabbit
TrypLE Express	Gibco	12604-021	Для диссоциации CAF
Vi-Cell	Bechman Coulter		Автоматический счетчик клеток
Антитело к виментину	Abcam	Ab92547 (RRID:AB_10562134)	Технология
клеточной сигнализации	бета-бета-катенину	кролика 2677s (RRID:AB_1030943)	Мышь