Summary
Система модели in vitro была разработана для захвата архитектурных изменений тканей при плоской карциноматической карциномате легких (LUSC) прогрессии в трехмерной (3D) совместной культуре с связанными с раком фибробластами (CAFs). Эта органоидная система обеспечивает уникальную платформу для изучения роли различных опухолевых клеток, интродуцированных и насущных изменений, которые модулируют фенотип опухоли.
Abstract
Опухолево-стромноговые взаимодействия играют решающую роль в развитии плоской карциномы легких (LUSC). Однако понимание того, как эти динамические взаимодействия способствуют изменениям в области архитектуры, наблюдаемым во время опухолевого генеза, остается сложным из-за отсутствия соответствующих моделей. В этом протоколе мы описываем генерацию 3D-модели кокультуры с использованием культуры первичных клеток LUSC, известной как TUM622. Tum622 клетки были созданы из LUSC пациента полученных ксенотрансплантат (PDX) и имеют уникальное свойство формировать ацинар-подобных структур, когда семенами в подвале мембраны матрицы. Мы демонстрируем, что TUM622 acini в 3D-кокультуре переизглашает ключевые особенности архитектуры тканей во время прогрессии LUSC, а также динамические взаимодействия между клетками LUSC и компонентами микроокружения опухоли (TME), включая внеклеточные матрицы (ECM) и связанные с раком фибробласты (CAFs). Мы также адаптируем наш основной 3D культивирование, чтобы продемонстрировать, как эта система может быть использована для различных анализов ниже по течению. В целом, эта органоидная модель создает биологически богатую и адаптируемую платформу, которая позволяет получить представление о клеточных и внутренних механизмов, которые способствуют нарушению эпителиальной архитектуры во время прогрессирования карциномы и помогут поиск новых терапевтических целей и диагностических маркеров.
Introduction
Рак легких является основной причиной смертности, связанной с раком во всем мире. Карцинома легких плоскоклеточной (LUSC), которая является вторым наиболее распространенным типом немелкоклеточного рака легких (NSCLC) и составляет примерно 30% всех раковых заболеваний легких, часто диагностируется на поздних стадиях и имеет плохой прогноз1. Варианты лечения для пациентов LUSC являются одной из основных неудовлетворенных потребностей, которые могут быть улучшены путем лучшего понимания основных клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют LUSC опухолевого.
Как и в большинстве случаев рака человека, патогенез LUSC характеризуется нарушением нетронутыми, хорошо упорядоченной эпителиальной ткани архитектуры2. В ходе этого процесса утрачены надлежащие атикально-базальные клеточные полярности, клеточные клетки и клеточные матричные контакты, что позволяет неконтролируемый рост и инвазивное поведение опухолевых клеток. В настоящее время широко ценится, что злокачественные особенности раковых клеток не могут проявляться без важного взаимодействия между раковыми клетками и их местной микросредой опухоли (TME)3. Ключевые компоненты в TME, включая внеклеточной матрицы (ECM), связанные с раком фибробласты (ЦАФ), а также эндотелиальные клетки и инфильтрации иммунных клеток активно формируют TME и диски tumorigenesis4. Тем не менее, наше текущее понимание того, как опухолевые клетки и эти ключевые компоненты в TME взаимодействуют, чтобы управлять тканевыми архитектурными изменениями во время прогрессии LUSC, очень ограничено.
Трехмерная (3D) культура является важным инструментом для изучения биологической активности клеточных и насущных изменений в регулировании архитектурных изменений тканей как в нормальных, так и в болезненных тканях5. 3D культуры обеспечивают соответствующий структурный и функциональный контекст, который обычно отсутствует в традиционных двухмерных (2D) культур. Дополнительные размеры таких систем более точно имитируют ткани in vivo во многих аспектах физиологии клеток и клеточного поведения, включая пролиферацию, дифференциацию, миграцию, экспрессию белка и реакцию на медикаментозное лечение. В последние годы усилия различных лабораторий привели к разработке в пробирке 3D-моделей как для обычныхлегких,так и для NSCLC6,7,,8. Тем не менее, модель плоской карциномы легких, которая может резюмировать как динамические архитектурные изменения ткани во время опухолевого, а также включить ключевые стромальные компоненты был недоступен.
Здесь мы описываем методы создания новой 3-мерной (3D) системы сокультуры с использованием первичных PDX-производных клеток LUSC (термин TUM622) и CAFs9,10. Оба TUM622 и CAFs являются производными от NSCLC пациента с плохо дифференцированных опухолей10. При встраиваемых в себя в качестве одиночных клеток в ECM, редкая субпопуляция клеток TUM622 имеет возможность формировать органоиды с ацинар-подобными структурами, которые отображают надлежащее атикально-базальной полярности клеток. Эти ацинар-подобные структуры гиперпластичны, демонстрируют неоднородное выражение стволовых и дифференциационных маркеров, похожих на исходную опухоль, оставаясь при этом неинвазивными, и таким образом имитируют самую раннюю стадию развития LUSC. Важно отметить, что мы показали, что архитектура тканей ацинаровоподобных структур может быть изменена путем ингибирования клеточных сигнальных путей с помощью мелких молекулных ингибиторов или добавления ключевых компонентов в ECM, таких как ЦАФы, последний из которых усиливает образование ацини и еще больше провоцирует ацини стать инвазивными, когда в непосредственной близости. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что эта 3D-система сокультуры органоидов LUSC является ценной платформой для исследования динамической взаимности между клетками LUSC и TME и может быть адаптирована для мониторинга реакции клеток LUSC на медикаментозное лечение11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Пропускные и культивирование TUM622 ячеек и CAFs в 2D-культурах
- Пропуск и культивирование клеток TUM622
- Теплый 3D культуры средних и клеточных реагентов диссоциации (см. Таблица материалов) для TUM622 клеток при 37 градусов по Цельсию.
- Прохождение TUM622 клеток при 80% вниски в 2D колбах. Как правило, это происходит через неделю после прохождения.
- Откажитесь от старой среды из колбы T75 и вымойте один раз с 6 мл буфера HEPES. Избегайте пиптинг непосредственно на клетки.
- Аспирируй буфер HEPES. Добавьте 4 мл трипсина/ЭДТА (0,25 мг/мл, см. Таблицу Материалов) для быстрого промывки и отбросьте трипсин/ЭДТА.
- Добавьте 2 мл трипсина/ЭДТА и инкубируйте при 37 градусах По 5 мин. Удалите фляги из инкубатора и коснитесь колбы, чтобы ослабить клетки, не создавая пузырьков воздуха и возвращайте фляги в инкубатор еще на 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие трипсина необратимо повредит клетки и изменить их фенотип, таким образом, рекомендуется ограничить время клетки подвергаются трипсин. - Подтвержденные клетки отделились и отделились под легким микроскопом (4x или 10x). Добавьте 4 мл буфера нейтрализации (буфер TNS) (см. информацию о реагентах субкультуры в таблице материалов),за которым следуют 10 мл 3D-культуры (см. Таблица материалов).
- Пипетка вверх-вниз осторожно, чтобы еще больше разъединить клетки с помощью 10 мл пипетки. Перенесите подвеску через 40 мкм-ситечко в коническую трубку мощностью 50 мл.
- Подсчитайте номера клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
- Семена 0,8 х 106 ячеек/T75 колба в 20 мл 3D-культуры среды (см. Таблица материалов).
- Кормите клетки через день, заменяя половину отработанного носителя свежей средой.
- Пропускные и культивирование ЦАФов
- Проходные CAFs, когда клетки достигают спущенности. Обычно это происходит после 5 дней культивирования от 1:2 раскола.
- Подготовка каф-среде с использованием базальной среды RPMI с 20% теплоинактивированной сывороткой крупного рогатого скота плода, 1% L-глютамина и 1% пенициллина/стрептомицина. Разогрейте среднюю до 37 градусов по Цельсию.
- В колбе T75, промыть CAFs с фосфат-буфером сольника (PBS) один раз добавить 2 мл трипсина / EDTA и инкубировать при 37 КС в течение 5 мин.
- Наблюдайте под светлым микроскопом для того чтобы обеспечить клетки разъединять в колбе (4x или 10x). Если нет, продлите инкубацию еще на 2-3 мин.
- После того, как клетки отделились и разобщены, добавьте 10 мл 3D-культуры среды, чтобы нейтрализовать трипсин/EDTA и пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы еще больше разъединить ЦАФы.
- Перенесите суспензию клетки в коническую трубку 50 мл и снесите вниз при 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Отбросьте супернатант и отразите гранулы в соответствующем объеме 3D-культуры среды (см. Таблица материалов)и перейти в две новые фляги T75.
2. Покрытие TUM622 клеток в внеклеточной матрице для 3D Культирования
- За день до эксперимента, оттепель флаконы подвалм мембранной матрицы в холодильнике 4 кВ ночь. Охладить пластиковые пипетки (2 мл) и наконечники при -20 градусов на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не все много подвальной мембранной матрицы имеют одинаковую способность поддерживать 3D рост клеток TUM622. Таким образом, необходимо приобрести и протестировать несколько партий подвальной мембранной матрицы, чтобы определить те, которые поддерживают надежное образование ацини. Как правило, это требует более высокой концентрации белка (16-18 мг/мл) в матрице. - В день эксперимента, теплая 3D-культура среды, HEPES буфер, трипсин / EDTA и трипсин нейтрализации буфера (TNS) в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Непосредственно перед настройкой культуры, принять оттаяла подвал мембраны матрицы из холодильника и положить флакон на лед.
- Охлаждение тканевых культурных пластин на металлической платформе кулер размещены на льду. Поместите центрифуги на металлическую стойку охлаждения на льду.
- Используя клетки TUM622, полученные с шага 1.1.7, вычислите нужное количество ячеек, необходимых для покрытия. Как правило, 15000-300000 клеток необходимы на колодец 24-хорошо пластины. Более низкая плотность больше подходит для визуализации и количественной оценки, в то время как более высокая плотность предпочтительнее при сборе клеток для экстракции РНК или западного промотирования.
- Перенесите суспензию клеток в охлажденный центрифуговый трубку (каждая трубка, содержащая клетки для тройного умыкают) и вращайтесь вниз при 300 х г в висячей центрифуге в вешалом ведре при 4 кв кв 5 мин.
- Тщательно аспирируйте супернатант с помощью аспирирующей пипетки, прикрепленной к нефильтрованного наконечника (20 кЛ), оставляя в трубке около 100 зл. м/с (использовать маркировку на трубке в качестве направляющего руководства).
- Аккуратно нажмите на стороне трубки, чтобы выбить и разъединить гранулы, прежде чем вернуть его в стойку охлаждения.
- Используя 2 мл предварительно охлажденных пипетки, аккуратно перемешать матрицу, труба вверх и вниз несколько раз, сохраняя флакон в контакте со льдом. Пипетка на ровной и умеренной скорости, так что никакие пузырьки не вводятся в матрицу во время этой процедуры.
- Перенесите соответствующий объем матрицы в каждую центрифужную трубку. Для покрытия трипликетов в 24-хорошая пластина, добавить 1,1 мл подвала мембранной матрицы для каждой трубки.
- Используя предварительно охлажденные наконечники, пипетка матрицы в каждой трубке вверх и вниз около 10 раз, чтобы сделать однородную подвеску ячейки.
- Передача 310 л клеточной/матричной подвески в каждую скважину предварительно охлажденной 24-хорошо пластины. Пипетка помещается под углом 90 градусов к поверхности пластины, а подвеска добавляется к центру колодца. Подвеска должна распространяться и покрывать весь колодец без необходимости наклона пластины.
- Для облегчения анализа иммунофлуоресценции ниже по течению, пластины ячейки / матричной подвески параллельно в 2-хорошо камерных слайдов. Передача 100 Зл клеточной/матричной подвески в центр скважины 2-колодца камерного слайда (см. Таблица материалов). Это позволяет матрице образовывать куполообразную структуру с гораздо меньшим объемом.
- Вернуть пластину и камеры слайд обратно в ткани культуры инкубатора и инкубировать в течение 30 минут, чтобы матрица затвердеть. Изучите пластину/слайд под световым микроскопом, чтобы убедиться, что отдельные клетки равномерно распределены по матрице (4x или 10x).
- Добавьте 1 мл предварительно разогретой 3D-культуры полной среды в каждую скважину и 1,5 мл 3D культуры среды к каждой скважине камеры слайд затем вернуть их в инкубатор.
3. 3D Coculturing TUM622 клеток и CAFs во внеклеточной матрице
- Подготовка клеточных суспензий TUM622 и CAFs в соответствии с разделом 2.
- Подсчитайте плотность клеток CAF, взяв 10 зл клеточной подвески и смешав ее с 10 ЗЛ трипан синего цвета.
- Добавьте 10 юл смеси к каждой из двух камер на гемаситометре, чтобы подсчитать и рассчитать плотность клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: CAFs имеют неправильные формы и не могут быть точно подсчитаны на автоматическом счетчике ячейки. - Совместное встраивание TUM622 клеток и CAFs в матрицу мембран ывальное полотно
- На основе информации о плотности клеток вычислите нужное количество ячеек, используемых для покрытия. ЦАО посеяны в соотношении 2:1 от клеток TUM622. Например, для 30 000 посеянных TUM622 ячеек 60 000 ЦАФов со-встроены.
- Перенесите соответствующий объем TUM622, а также подвеску ячейки CAFs в ту же центрифугу трубки и выполните шаги 2,5-2,11 для покрытия в 24-колодцевые пластины. Для иммунофлуоресценции, передача 60 Л TUM622/CAFs смешивать на камерные слайды, как описано в шаге 2.12).
- Coculturing TUM622 с накладными CAFs в матрице мембраны подвала (см. Таблица материалов)
- Настройка монокультуры TUM622 по шагам 2.5-2.13.
- Перенесите в два раза больше подвески CAFs (по сравнению с количеством посеянных TUM622 ячеек) в центрифужную трубку и снесите вниз при температуре в 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Приспособите супернатант и повторно остановите CAFs в 1 мл 3D-культуры среды.
- Перенесите 1 мл подвески CAFs в скважину, содержащую встроенные клетки TUM622.
4. Сбор урожая TUM622 Acini для экстракции РНК/белка и флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS)
- Подготовьте буфер для мытья и буфер сбора ячеек в соответствии с протоколом сбора 3D-клеток накануне и охладите на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Держите пластины на пластине кулер и другие реагенты на льду, прежде чем начать процесс извлечения.
- Аспирные носители из 3D-культурных колодцев, не касаясь матрицы, и аккуратно промойте колодец 3 раза 1 мл буфера для мытья.
- Прибавьте к окончательной стирке и добавьте 1 мл буфера сбора клеток к каждой скважине.
- Используйте p1000 пипетка отзыв, чтобы соскребать матрицу от каждого колодца.
- Пипетка вверх и вниз, чтобы еще больше разъединить матрицу.
- Перенесите 1 мл смеси в предварительно охлажденный конической трубке 15 мл. Добавьте еще 1 мл буфера для сбора урожая в тот же колодец.
- Повторите шаги 4.5-4.7, и перенесите всю смесь одной и той же и той же и в одну коническую трубку 15 мл.
- Крышка труб и рок на 4 КК в течение 30 мин.
- Заполните каждую трубку ледяной PBS до 10 мл, а затем центрифуги на 300 х г в течение 5 минут при 4 градусах По Цельсия.
- Пусть же придав себя супернатанта, не касаясь гранул. Супернатан должен содержать фрагменты матрицы, но все сфероиды должны быть собраны в нижней части трубки.
- Добавьте ледяной PBS для второй стирки. Перевернуть трубку несколько раз, чтобы разъединить гранулы. Спин вниз на 300 х г в течение 5 мин.
- Во время вращения, подготовить лисис буфер для белка и РНК сбора.
- Тщательно аспирировать супернатант и добавить буфер лиза для обработки ниже по течению для сбора белка или РНК. Кроме того, ячейки могут быть переприкованы для анализа потока /сортировки FACS или последовательного пропуска.
5. Иммунофлуоресценция TUM622 Ачини
- Подготовка буфера иммунофлуоресценции (БУФЕР IF: PBS с 0,1% бычьего сыворотки альбумина (BSA), 0,2% Triton X-100 и 0,05% Tween-20), первичный блокирующий буфер (буфер IF с 10% козьей сывороткой), вторичный блокирующий буфер (первичный буфер блокировки с 20 мкг/мл козла против мыши F.ab))2)
- Аспир среды из 2-колодец камерных слайдов, промыть один раз с PBS и установить слайд на металлической пластины кулер на льду. Камера слайд должен оставаться на металлической пластины кулер для остальной части протокола.
- Добавить предварительно охлажденный 4% PFA, чтобы исправить ацини и инкубировать на льду в течение 20 минут.
- Удалить 4% PFA и мыть три раза с 2 мл предварительно охлажденных PBS каждый в течение 5 минут с нежным качания на рокер.
- АспирpbS и permeabilize с 1,5 мл 0,5% Тритон X-100 в PBS (предварительно охлажденный) в течение 20 минут. К концу этой процедуры куполоподобная структура станет рыхлой.
- Аккуратно аспирируйте буфер permeabilization от слайда камеры, чтобы избежать потери образца. Это достигается путем добавления тонкого наконечника (20 л) к успокоительной пипетке и нажатия кончика к углу камеры.
- Вымойте три раза с 2 мл предварительно охлажденных PBS каждый в течение 5 минут с нежным качания на рокер.
- Заблокируйте образец основным блокирующим буфером на льду в течение 1 ч.
- Удалите первичный блокирующий буфер и добавьте вторичный блокирующий буфер и заблокируйте в течение 30 минут.
- Добавить первичные антитела в первичный блокирующий буфер и инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антител, используемых здесь должна быть выше, чем обычно используется для окрашивания клеток в 2D-культуре. Большинство первичных антител, используемых в этом исследовании, разбавляются при 1:100 разбавления (см. Таблица материалов). - Удалить первичные антитела и вымыть образец 3 раза с 2 мл холодного буфера ЕСЛИ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть свободными, принимать дополнительную осторожность при успомывке. - Инкубировать образцы во вторичных антителах, разбавленных в первичном блокирующем буфере на 1 ч на RT. Предпочтительные вторичные антитела должны быть сильно перекрестными адсорсингами, чтобы уменьшить фоновое окрастраивание. Большинство вторичных антител, используемых в этом исследовании разбавляются при 1:200 разбавления.
- Удалите вторичные антитела и промойте образец 3 раза с 2 мл холодного буфера ЕСЛИ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть свободными, принимать дополнительную осторожность при успомывке. - Добавить PBS с DAPI (1:1,000 разбавления) во время последней стирки, чтобы испачкать ядро. Выполнить еще 2 смеет в PBS.
- Изображение образцов на конфокальный микроскоп в течение 3 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за размера органоидов и ограничений в рабочем расстоянии цели, образцы, как правило, изображения на 10x или 20x увеличение.
6. Подготовка 3D образцов культуры для иммуногистохимии
- Аспир среды из 2-колодец камерных слайдов и промыть один раз с PBS.
- Исправить 3D культур в 4% PFA на 37 градусов по Цельсию в одночасье.
- Удалите 4% ПФА, объемные культуры с 2,5 мл гистологии образец геля (см. Таблица материалов) и место слайд на 4 кв С, чтобы затвердеть, по крайней мере 1 ч.
- Передача образцов, окруженных гистологическим гелем образца, на тканевые кассеты и обработанных в автоматизированном процессоре образца ткани на ночь.
- Вставлять образцы в парафиновый воск и готовиться к сечению12.
7. 3D Анализ цитотоксичности для скрининга соединения (Пример для одной 96-хорошо плиты)
- Установите 96-колодчатую пластину на плиту кулер, резервуар 25 мл на резервуаре кулер и 15 мл конических труб на льду перед началом эксперимента.
- Подготовка клеточной матричной суспензии tum622 клеток в предварительно охлажденной 15 мл полипропиленовой конической трубки, добавив соответствующий объем подвальной мембранной матрицы в клетки. Пожеланная плотность для tum622 клеток составляет 10 000 клеток на 70-75 л мембранной матрицы. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы позволить даже смешивания клеток в матрице.
- Переместите пластину с плитой кулер и резервуар с резервуаром кулер от льда на сухую поверхность, чтобы избежать контакта подвала мембранной матрицы со льдом во время передачи.
- Перенесите смесь матричных клеток в охлаждающий резервуар, не создавая пузырьков.
- Используя механический многоканальный пипетк (10-300 л), перенесите 70-75 л клеток смеси в каждую соответствующую скважину 96-хорошей пластины.
- Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение 30 мин для оболочки мембраны в подвале, чтобы затвердеть.
- Добавьте 100 л носителей во всех рядах и верните пластину в инкубатор.
- Начните дозировку соединения на следующий день или позже в зависимости от цели эксперимента.
- Сфероиды могут быть повторно скормлены и повторно дозируются каждые 2-3 дня в течение 10 дней, путем удаления отработанных носителей с 8- или 12-хорошо вакуума многообразия и замены со свежими средствами массовой информации с или без желаемых соединений.
- Количество сфероидов TUM622 можно количественно определить с помощью 3D-изображения в соответствии с протоколом производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TUM622 и CAFs в 2D-культуре
На рисунке 1 представлена типичная морфология клеток TUM622 и CAFs в 2D-культуре. Клетки TUM622 округлены большими ядрами, в то время как ЦАО плоские и удлиненные. Tum622 клетки могут достигать 80%-90% стоек в культуре. Дальнейшее распространение приводит к большему, но более мелкие клетки, агрегированные в колониях, которые не вступают в прямой контакт. В отличие от этого, ЦАФы предпочитают расти при более высокой плотности клеток и будет продолжать размножаться при полной стельности, если обеспечивается достаточное количество питательных веществ.
Рост и морфология TUM622 ацини в 3D ECM
Рисунок 2 представляет собой эксперимент по временному курсу клеток TUM622, посеянных в 3D-культуре. Данные показывают, что одиночные клетки TUM622 способны формировать органоиды с ацинар-подобными морфологиями при встраивании. Между днями 5 и 7, просвет становится очевидным в ацинаре-подобных структур и остается полым после этого (Рисунок 2A). Каждый ацин, состоящий из монослой клеток, окружающих полый просвет, отображает надлежащее апикально-базальной полярности, аналогичной эпителии легких in vivo(рисунок 2B). Эти ацинар-подобные структуры гиперпластичны и продолжают расти до тех пор, пока обеспечивается достаточное количество питательных веществ. Культура может сохраняться до 24 дней до полного распада ECM(рисунок 2C). По оценкам, благодаря ограничению анализа разбавления (LDA) (данные не показаны), предполагается, что лишь редкая субпопуляция клеток TUM622 (0.02%) имеют возможность формировать ацинар-подобные структуры9.
Рост и морфология сокультуры TUM622-CAFs
На рисунке 3 изображены настройки и репрезентативные результаты сокультур TUM622-CAF. CAFs могут быть интегрированы в кокультуру либо путем наложения на верхней части матрицы или совместно встроенных с TUM622 клеток. Независимо от установки, наличие CAFs значительно увеличило количество и размер сформированных сфероидов(рисунок 3B). Интересно, что, когда TUM622 acini вступают в непосредственной близости с CAFs, они побуждают ацини стать инвазивными и мигрировать в сторону CAFs, образуя "слезы капли", как структуры(Рисунок 3C). Обратите внимание, что TUM622 acini в монокультуре не отображают инвазивное поведение и образуют только "слезы капли", как структуры, когда близко к CAFs.
Представитель иммунофлуоресцентных и иммуногистохимии окрашивания результатов
На рисунке 4 показаны репрезентативные результаты иммунофлуоресценции и иммуногистохимии окрашивания TUM622 acini после 10 дней культивирования. Конфокальные снимки были сделаны на экваториальной плоскости иммунофлуоресцентно окрашенных TUM622 acini(рисунок 4A). В отличие от этого, каждый раздел из образца иммуногистохимии может захватывать ацини на разных плоскостях(рисунок 4B). Оба результата показали разнородное выражение стволовых и дифференцированных клеток в каждом ацине.
TUM622 3D цитотоксичность асссс с помощью ингибитора Пути Wnt
На рисунке 5 показана доза-реакция TUM622 acini, обработанная XAV939, ингибитором танкиразы(рисунок 5A,B). XAV939 был добавлен в культуру 1 день после покрытия и обновляется каждые 2 дня в общей сложности 10 дней. В конце эксперимента количество ацини было количественно оценено изображением. Яркие изображения при более высоком увеличении были также приобретены, чтобы захватить морфологию сфероидов в управлении по сравнению с XAV939 обработанных скважин(рисунок 5C). В целом, XAV939 отображает доза-зависимых ингибирование на ацини формирования и изменяет архитектуру тканей сфероидов формируется. Эти результаты показывают, что активация канонического пути Wnt требуется во время TUM622 ацинар морфогенез.
Рисунок 1: TUM622 и CAFs в 2D-культуре. Представитель ярко-поля изображения TUM622 клетки и CAFs культивировалвав в 2D. Шкала бар 100 мкм. Эта цифра была изменена из Чэнь и др.9 и используется с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Рост и морфология TUM622 acini в 3D ECM. (A) Время курс изображения TUM622 клеток культивировалась в подвале мембраны матрицы в течение 10-дневного периода. Шкала бар No 100 мкм. (B) Иммунофлуоресценция TUM622 ацини окрашенных атикально-базальных маркеров полярности клеток, Golgi-фермент (GM-130, зеленый, апокальный) и Integrin альфа 6 (CD49f, базаль, красный). (C) Количественная оценка номера асини (правая у-оси, красный) и средний размер асини (левая у-оси, синий) покрынный в тройной в 24-хорошую пластину в течение 24 дней в культуре. Бары ошибок представляют SD. Эта цифра была изменена из Чэнь и др.9 и используется с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Рост и морфология сокультуры TUM622-CAFs. (A) Схематический рисунок установки сокультуры TUM622-CAFs. CAFs накладываются или совместно встраиваются с tum62 ячейками в ECM. После 6-12 дней в кокультуре, TUM622 клетки способны формировать все больше и больше ацини по сравнению с моно-культуры и вторгнуться ECM, когда в непосредственной близости и прямого контакта с CAFs. Обратите внимание, что инвазивный фенотип может наблюдаться только в совместной культуре. (B) Брайтфилд изображение TUM622 3D культур в присутствии или отсутствии накладных CAFs после 8 дней. Шкала баров 200 мкм. (C) Брайтфилд изображения, показывающие слезоточивый капли формы ацини формирования в кокультурах, независимо от CAFs накладываются или совместно встроены в ECM. Шкала баров 200 мкм. Эта цифра была изменена из Чэнь и др.9 и используется с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Представитель иммунофлуоресцентных и иммуногистохимии окрашивания результатов. (A) Антитела окрашивания ацини с маркерами стволовых / прародителей клеток (CXCR4 и SOX2), мезенхим (Vimentin), эпителиальная дифференциация (Инволукрин), апоптоз (Cleaved-Caspase-3) и пролиферации (Ki67) в зеленом, DAPI в синий, E-cadherin Шкала бар 50 мкм. (B) Иммуногистохимия на участках FFPE TUM622 acini. Шкала бар 100 мкм (вверху) и 50 мкм (внизу). Эта цифра была изменена из Чэнь и др.9 и используется с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: TUM622 3D цитотоксичность ассси с помощью ингибитора Пути Wnt. (A) Количественная оценка сфероидных чисел в 96-колодцевой пластине, где клетки TUM622 лечились диметиловым сульфоксидом (Контроль) или XAV939. Каждое условие оценивается в триплицах. Ошибки баров представляют SD. (B) Всего хорошо изображения из 24-хорошо пластины, принятые с изображением, показывающие тормозящие эффекты XAV939 на образование ацини. (C) Представитель яркое поле изображения из управления против обработанных скважин, демонстрирующих морфологические изменения, вызванные XAV939 лечения. Шкала баров 100 мкм. Эта цифра была изменена из Чэнь и др.9 и используется с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Опухоли являются неоднородными тканями, состоящими из раковых клеток, сосуществующих бок о бок со стромальными клетками, такими как связанные с раком фибробласты, эндотелиальные клетки и иммунные клетки в ECM. Вместе эти разнообразные компоненты перекрестного разговора и влияния на микросреду опухоли, играя активную роль в продвижении опухолевого генеза, процесс, который включает в себя прогрессивные изменения в архитектуре опухоли. В идеале, в пробирке модель развития опухоли должна быть в состоянии захватить динамические архитектурные изменения ткани наблюдается в человеческих опухолей in vivo, сложное взаимодействие различных типов клеток в микроокружении опухоли и в то же время позволяют экспериментальные манипуляции как на опухолевых клетках, так и на компонентах ТМЕ. Хотя в последние годы был достигнут значительный прогресс в области 3D-моделей рака, такие модели не были легко доступны для LUSC. Большинство моделей, о которых сообщалось на сегодняшний день, включают лишь некоторые аспекты этих важных особенностей. Здесь мы сообщаем о методах 3D-системы кокультуры LUSC, которая одновременно фиксирует ключевые архитектурные изменения тканей, наблюдаемые при разработке LUSC, а также динамические взаимодействия между опухолевыми клетками и основными компонентами ТМЭ, включая ECM и ЦАФы.
Способность этой системы более точно моделировать архитектурные изменения тканей основана на уникальном свойстве клеток TUM622 в формировании органоидов с ацинар-подобными морфологиями при внешленных 3D EC. Сформированный из самообновляющейся одной клетки, каждый аминус состоит из монослойа клеток, окружающих полый просвет. Этот монослой клеток проявляет атикально-базальную клеточной полярности и остается неинвазивным, напоминающим тканевую архитектуру эпителия легких. В то время как TUM622 как 3D моно-культура отображает гиперпластичный рост, добавление CAFs еще больше усиливает ацинарный морфогенез и индуцирует все больше и больше ацини к форме. Важно отметить, что CAFs вызывают динамические архитектурные изменения ткани в клетках TUM622, когда два типа клеток вступают в непосредственной близости, что позволяет клеткам TUM622 потерять свою атикально-базальную полярность и вторгнуться в матрицу к CAFs. Эти фенотипические изменения резюмируют как раннюю гиперплазию, так и поздние инвазивные стадии LUSC.
В отличие от многих моделей опухолевых сфероидов, где каждый сфероид формируется путем агрегации многих клеток, каждый ацин tum622 происходит от одной клетки9. По in vitro LDA, по оценкам, лишь незначительная субпопуляция (0,02%) из TUM622 клетки имеют такую емкость9. Хотя редко, эти клетки могут самообновления, о чем свидетельствует их способность проходить серийное проехав в 3D, а также дифференцировать в неоднородной популяции клеток, аналогичных оригинальной опухоли. Из-за этой уникальной особенности TUM622 клеток, очень важно обеспечить равномерное распределение отдельных tum622 клеток в ECM во время покрытия для успешного культивирования и вниз по течению анализа. Для достижения этой цели, несколько ключевых моментов должны быть тщательно соблюдены в протоколе, в том числе определение соответствующей плотности посева, сохраняя все инструменты и реагенты прохладно во время смешивания клеток и матрицы, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание, избегая введения пузырьков в процессе смешивания и позволяя достаточно времени для матрицы, чтобы полностью укрепиться перед добавлением среды культуры. Вместе эти меры предосторожности помогут достичь более равномерного матричного субстрата и состояния культуры для всех встроенных ячеек.
После успешного создания, эта культура может быть использована для различных анализов вниз по течению, чтобы вскрыть клетки и биохимический процесс, который регулирует tumorigenesis. Количество и размер асини, образовавшихся в каждой скважине, можно контролировать с помощью ярких полевых изображений и использовать в качестве считывания для пролиферативной и самообновляющейся способности клеток TUM622. Более подробная динамика морфогенеза каждого ацина можно было наблюдать с живой визуализацией на конфокальном микроскопе, с различными красителями маркировки или без нее. Кондиционированная среда может быть собрана в нескольких точках времени в течение периода культуры для анализа растворимых факторов, которые могут посредника клеток или клеточной матрицы перекрестных переговоров. Клетки TUM622, извлеченные непосредственно из ECM с использованием протокола 4, подходят для экстракции РНК и белка для анализа экспрессии генов, количественной оценки цитометрии потока или сортировки FACS на основе маркеров поверхности клеток. Кроме того, культуры могут быть установлены на месте иммунофлуоресценции или иммуногистохимии исследований, чтобы понять пространственно-временные распределения различных маркеров. Хотя аналогичная, иммуногистохимия дополняет иммунофлуоресценции методы в том, что она позволяет выборки всего ачини, которые не могут быть возможными из-за ограничения глубины изображения конфокальных целей. Для обоих этих методов, время и температура, при которых фиксация и permeabilization выполняются имеют решающее значение, особенно с учетом того, что TUM622 клетки встроены в плотную матрицу (No gt;90% подвал мембраны матрицы) в отличие от многих других 3D культур, где плотность матрицы намного ниже. Поэтому для получения репликационных результатов необходимо внимание к стандартизированной и последовательной фиксации и обработке.
Используя эту систему в качестве платформы, можно исследовать, как клеточные изменения в опухолевых клетках, а также клеточные исправные изменения в микроокружении опухоли, влияют на эпителиальную архитектуру и модели ранних событий, связанных с образованием карциномы. Например, роли онкогенов или генов супрессоров опухолей в регулировании архитектуры опухолевых тканей могут быть изучены путем эксперимента по усилению или потере функции, ориентированному на ген интереса к опухолевым клеткам. Действительно, мы продемонстрировали, что чрезмерное выражение SOX2, которое обычно наблюдается в LUSC, изменяет фенотип клеток TUM622, о чем свидетельствует потеря гиперплазии в 3D и прогрессирование к диспластическому росту9. С другой стороны, можно было бы сравнить нормальные против рака связанных фибробластов в условиях кокультуры, определить, как матричные компоненты или его жесткость влияние ацини роста / морфологии / вторжения, и если блокирование некоторых цитокинов может помешать клеточной связи и, в свою очередь, влияют на архитектуру тканей и прогрессирование опухоли. Важно отметить, что все эти анализы могут быть выполнены в присутствии или отсутствии определенных терапевтических агентов и использоваться в качестве инструмента для определения реакции препарата клеток LUSC с многомерной считывательской11. Важно также отметить, что эта система ограничена в отношении путей, которые она может быть использована для допроса, так как только некоторые, но не все основные сигнальные пути регулируют рост и морфологию tum622 органоидов в культуре (т.е. ингибирование Wnt, но не Notch сигнализации влияет на ацинар мофогенез TUM622 клеток)9.
Таким образом, мы демонстрируем, что эта органоидная система обеспечивает уникальную платформу для генерации новых идей в динамическом взаимодействия между клетками LUSC и микроокружения опухоли во время прогрессирования опухоли. Мы ожидаем, что наша модельная система станет ценной платформой для обнаружения и разработки лекарственных средств. В этом отношении скрининг новых противораковых терапевтических препаратов в контексте родной опухолевой ткани должен помочь в отборе и развитии более эффективных терапевтических препаратов, ориентированных на LUSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторами являются сотрудники и акционеры Pfizer Inc.
Acknowledgments
Мы благодарим Магали Гаффрой, Джона Кригера и Стефани Бисулко из группы Гистопатология И Пфайфер и Биомаркера за поддержку патологии/гистологии, а Майкла Аренсмана за критический обзор рукописи. Мы также благодарим Pfizer Постдокторской программы и онкологии НИОКР группы, в частности, Роберт Абрахам, Пуджа Сапра, Карен Widbin и Дженнифер Tejeda за их поддержку программы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
- Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
- Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
- Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).
