Summary
Användningen av en RNA-baserad metod för att bestämma kvantitativa immunprofiler av solida tumörvävnader och utnyttja kliniska kohorter för immunonkologi biomarkör upptäckt beskrivs genom en molekylär och informatik protokoll.
Abstract
Immunterapier visar löfte vid behandling av onkologipatienter, men komplexa heterogenitet av tumörmikromiljön gör förutsäga behandlingssvar utmanande. Förmågan att lösa de relativa populationerna av immunceller som finns i och runt tumörvävnaden har visat sig vara kliniskt relevant för att förstå svar, men begränsas av traditionella tekniker som flödecytometri och immunohistokemi ( IHC), på grund av den stora mängd vävnad som krävs, brist på exakta markörer celltyp, och många tekniska och logistiska hinder. En analys (t.ex. immunoprism immunprofileringassay) övervinner dessa utmaningar genom att ta emot båda små mängder RNA och mycket försämrade RNA, vanliga funktioner i RNA som utvinns ur kliniskt arkiverad fast tumörvävnad. Analysen nås via en reagenskit och molnbaserade informatik som ger en kvantitativ, hög genomströmning immunprofileringslösning för Illumina sekvenseringsplattformar. Forskare börjar med så få som två delar av formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) vävnad eller 20-40 ng av totala RNA (beroende på provkvalitet), och protokollet genererar en immun profil rapport kvantifiera åtta immuncelltyper och tio immun fly gener, fånga en fullständig bild av tumör mikromiljön. Ingen ytterligare bioinformatisk analys krävs för att använda sig av de resulterande uppgifterna. Med lämpliga provkohorter kan protokollet också användas för att identifiera statistiskt signifikanta biomarkörer inom en patientpopulation av intresse.
Introduction
Kvantifiering av tumörinfiltreralymfocyter (TILs) och andra immunrelaterade molekyler i formalin-fasta och paraffin inbäddade (FFPE) fast tumör mänskliga vävnadprover har visat värde i klinisk forskning1,2,3. Vanliga tekniker som flödecytometri och single-cell ribonucleic syra (RNA) sekvensering är användbara för färsk vävnad och blod4, men är olämpliga för analys av FFPE material på grund av oförmåga att skapa livskraftiga cellsuspensioner. Nuvarande metoder som har använts för att kvantifiera dessa celler i FFPE vävnad lider av stora utmaningar. Immunohistochemistry (IHC) och andra liknande bildframställning arbetsflöden kräver specifika antikroppar för att upptäcka cell-ytan proteiner, vilket kan vara svårt att standardisera mellan laboratorier för att möjliggöra reproducerbara kvantifiering5. Plattformar som nCounter-systemet förlitar sig på uttrycket av enskilda gener för att definiera viktiga immunceller6, vilket begränsar känsligheten och specificiteten hos detektion. Mer generiska RNA sekvensering metoder, tillsammans med fristående mjukvaruverktyg, finns tillgängliga men kräver betydande optimering och validering före användning7,8,9,10,11,12. Senaste framstegen i att kombinera laser capture microdissection (LCM) med RNA sekvensering för FFPE vävnad har visat löfte; En mer hög genomströmning krävs dock nyckelfärdiga lösningar för translationella studier som syftar till att identifiera robusta biomarkörer13,14. Metoder för att generera flerdimensionella biomarkörer, såsom Prediktiv immunmodellering, som definierar patientkohorter inklusive terapi responders, cancer subtyper, eller överlevnad resultat med hög prediktiv noggrannhet och statistisk signifikans blir allt viktigare i en ålder av precision medicin och immunterapi15,16.
För att ta itu med detta behov utvecklades en immunprofileringanalys för att möjliggöra känslig och specifik kvantifiering av immunceller i solid tumör FFPE-vävnad med hjälp av standardiserade RNA-sekvenseringreagenser och molnbaserade informatik. Förutom att ta emot försämrade RNA från FFPE-vävnad kan protokollet rymma RNA från att begränsa vävnadsprover som kärnnålbiopsier, nålaspirater och mikro- eller makrodissekerad vävnad. RNA-data från varje prov jämförs med en databas med genuttrycksmodeller av immunceller, som kallas immunsystemets hälsouttrycksmodeller, för att kvantifiera immunceller i procent av de totala cellerna som finns i provet. Kort, dessa modeller byggdes med hjälp av maskininlärningsmetoder för att identifiera unika multigena uttrycksmönster från heltranskriptomdata som genereras från renade immuncellpopulationer (isolerade med kanoniska cell-yta markörer)17,18. De flerdimensionella hälsouttrycksmodeller som ligger till grund för tekniken gör det möjligt för analysen att kvantifiera varje immuncell som en procent av de totala celler som finns i den heterogena blandningen. Detta gör det möjligt för forskaren att generera jämförelser mellan och inom urvalet immunceller, som har visat sig ha kliniskt värde19,20. Andra tillämpningar är kvantifiering av immunsvar före och efter behandling, enligt beskrivningen i de representativa resultaten. Analysen rapporterar om flera funktioner i immuncontexture av tumör och tumör mikromiljö inklusive de absoluta procentsatserna av åtta immuncelltyper (härledda från genuttryckmodeller): CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, CD56+ Natural Killer celler, CD19+ B-celler, CD14+ monocyter, Tregs, M1 makrofager och M2 makrofager. Dessutom rapporterar analysen uttrycket (i transkriptioner per miljon, eller TPM) av tio immunflyktgener: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 och ARG1.
Reagenssatsen används för att göra bibliotek av hög kvalitet redo för sekvensering på en Illumina-plattform efter en hybridinsamlingsbaserad biblioteksberedningsmetod, som visas i figur 1. Om en forskare inte har en Illumina sekvenseringsplattform i sitt laboratorium, får de lämna in sina prover till ett kärnlaboratorium för sekvensering. När sekvenseringsdata har genererats laddas upp till Prismportalen för automatiserad analys och en omfattande kvantitativ profil för varje enskilt prov returneras till användaren i form av immunrapporten (figur 2A. Användare kan också definiera provgrupperier i Prismportalen för att generera en Biomarker-rapport (figur 2B), som belyser statistiskt signifikanta biomarkörer som skiljer två patientkohorter. Viktigt är att de data som genereras av reagenssatsen endast är avsedda för forskningsanvändning och får inte användas för diagnostiska ändamål.
Bild 1: Översikt över arbetsflödet. I detta protokoll konverteras RNA först till cDNA. Sekvensering sadaptrar är ligated, och adapter-ligated cDNA förstärks och streckkodas av PCR för att skapa en pre-capture bibliotek. Biotinylated sonder hybridiseras sedan till specifika cDNA mål som sedan fångas med streptavidin pärlor. Obundet, icke-riktat cDNA avlägsnas genom tvätt. En slutlig PCR-anrikning ger ett bibliotek efter inspelning redo för sekvensering. *Totalt RNA måste komma från mänskliga prover. kan vara intakt eller försämrad (FFPE) RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representant Immun rapporter. Arbetsflödet genererar två rapporter, en individuell immunrapport (A)för varje bearbetade prov och en biomarkörrapport(B)för definierade patientkohorter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protokollet kräver cirka 16 h förberedelsetid (från totalt RNA till bibliotek redo för sekvensering); Det finns dock ett antal valfria stopppunkter, som anges i protokollet. Analysen använder sig av den rika, dynamiska karaktären av transkriptomics att gå bortom äldre single-analyte biomarkörer till flerdimensionella genuttryck modeller, vilket möjliggör omfattande biologisk karakterisering av vävnadsprover med standardiserade reagenser och lättanvända programvaruverktyg. Det ger forskare möjlighet att använda en modern teknik i sitt eget laboratorium, genom att utnyttja maskininlärning och en databas med hälsouttrycksmodeller för att härleda mer exakta, kvantitativa immunprofiler av värdefulla kliniska prover och upptäcka flerdimensionella RNA biomarkörer med fullständig statistisk analys.
Protocol
De mänskliga vävnadsprover som används i de representativa resultat som visas här köptes från en ansedd enhet (TriStar Technology Group) och har informerat givarens samtycke tillåter akademisk och kommersiell forskning, samt godkännande från en kompetent etisk Kommittén.
Del I: Förberedelser inför inspelning av bibliotek
1. RNA-kvantifiering och kvalificering
- Kvantifiera RNA med hjälp av en fluoretrisk analys för att bestämma lämplig ingång till analysen. Bedöma kvaliteten på ingången RNA med elektrofores för att bestämma RNA Integritetsnummer (RIN) och andelen fragment > 200 nukleotider (DV200)värden.
- För intakt (RIN > 7) eller delvis försämrade RNA prover (RIN = 2 till 7) följ biblioteket förberedelsesteg för hög kvalitet / intakt RNA, börjar med steg 2.1. Kvaliteten på RNA är viktigt för att välja rätt fragmentering tid i Thermal Cycler Program #1 (Kompletterande tabell 2).
- För mycket försämrade prover (t.ex. RIN = 1 till 2 eller FFPE) bestämmer du Värdet dV200. Dessa prover kräver inte fragmentering och följer instruktionerna för försämrade RNA, med början i steg 2.2.
- Förbered lämplig mängd totalt RNA för varje prov för genom utspädning 20 ng av RNA (hög kvalitet/intakt RNA med RIN > 2) eller 40 ng RNA (Degraderad/FFPE RNA med DV200 > 20%) till 5 μL i nuclease-fritt vatten. Bearbetning av prover med DV200 < 20% rekommenderas inte. För de kontroll-RNA-prover som medföljer satsen, späd 1 μL av lämplig RNA i 4 μL nucleasefritt vatten. Kontrollprover kommer att följa samma bearbetning som beskrivs för antingen högkvalitativa (intakta) eller degraderade (FFPE) RNA-material, enligt etiketten. Se Tilläggstabell 1 för alla reagenser som ingår i satsen.
2. RNA Fragmentering och priming
- Följ steg 2.1.1 för högkvalitativ/intakt RNA med RIN > 2.
- För högkvalitativa RNA, montera fragmentering och priming reaktion på is i en nuclease-fri PCR-rör enligt tabell 1.
- Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner flera gånger. Sedan, kort snurra ner proverna i en mikrocentrifug
OBS: För alla centrifugspinn i protokollet rekommenderas en hastighet på ≥ 1 000 x g för minst 3 s. - Placera proverna i en termisk cycler och använd Program #1 (Kompletterande tabell 2).
- Överför omedelbart rören till is en och fortsätt till First Strand cDNA Synthesis for High Quality RNA (steg 3.1). För samtidig beredning av både hög kvalitet och FFPE RNA, börja förbereda FFPE RNA (steg 2.2) under fragmenteringinkubations.
- Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner flera gånger. Sedan, kort snurra ner proverna i en mikrocentrifug
- För högkvalitativa RNA, montera fragmentering och priming reaktion på is i en nuclease-fri PCR-rör enligt tabell 1.
| Fragmentering och priming Mix | Volym (μL) |
| Intakt eller delvis degraderad RNA (20 ng) | 5 |
| Första strängsyntesreaktionsbuffert | 4 |
| Slumpmässiga primers | 1 |
| Total volym | 10 |
Tabell 1: Fragmentering och priming reaktion för högkvalitativa RNA. Komponenter i fragmenteringen och grundreaktionen för högkvalitativa RNA bör monteras och blandas på is enligt de visade volymerna. En master mix av First Strand Synthesis Reaction Buffer och Random Primers kan göras och läggas till RNA prover.
- Följ steg 2.2.1 för degraderad/FFPE RNA med DV200 > 20%.
- För mycket försämrad (FFPE) RNA som inte kräver fragmentering, montera priming reaktion som beskrivs i tabell 2. För intakt RNA, kom ihåg att följa steg 2.1.
- Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner flera gånger. Sedan, kort snurra ner proverna i en mikrocentrifug.
- Placera proverna i en termisk cycler och använd Program #2 (Kompletterande tabell 2).
- Överför rören till is och fortsätt till First Strand cDNA Synthesis för highly degraded (FFPE) RNA (steg 3.2).
- För mycket försämrad (FFPE) RNA som inte kräver fragmentering, montera priming reaktion som beskrivs i tabell 2. För intakt RNA, kom ihåg att följa steg 2.1.
| Priming Reaktion | Volym (μL) |
| FFPE RNA (40 ng) | 5 |
| Slumpmässiga primers | 1 |
| Total volym | 6 |
Tabell 2: Slumpmässig priming reaktion för mycket försämrade RNA. Komponenter i den priming reaktionen för mycket försämrade RNA bör monteras på is i en nuclease-fri PCR-rör.
3. Första Sträng cDNA syntes
- Följ steg 3.1.1 för högkvalitativ/intakt RNA med RIN > 2.
- För intakt RNA (hög kvalitet), montera den första Strand syntesreaktionen på is i ett nuclease-fritt PCR-rör enligt tabell 3.
- Att hålla reaktionerna på isen, blanda noggrant genom att pipettera upp och ner flera gånger. Snurra kort ner proverna i en mikrocentrifug och fortsätt direkt till Första strängsyntesinkubation (steg 4).
- För intakt RNA (hög kvalitet), montera den första Strand syntesreaktionen på is i ett nuclease-fritt PCR-rör enligt tabell 3.
| Första Strandsyntesen | Volym (μL) |
| Fragmenterad och primad RNA (steg 2.1.3) | 10 |
| Första Strängsyntesspecificitetreagens | 8 |
| Första Strandsyntesenzymmixen | 2 |
| Total volym | 20 |
Tabell 3: Första Strängsyntesreaktionen för högkvalitativa RNA. Komponenter i fragmenteringoch priming reaktion för hög kvalitet RNA bör monteras och blandas på is enligt de angivna volymerna. En master mix av First Strand Synthesis Specificity Reagens och First Strand Synthesis Enzyme Mix kan göras och läggas till fragmenterade och primade RNA prover.
- Följ steg 3.2.1 för degraderad/FFPE RNA med DV200 > 20%.
- För mycket degraderad RNA (FFPE), montera den första Strand syntesreaktionen på is i ett nuclease-fritt PCR-rör enligt tabell 4.
- Att hålla reaktionerna på isen, blanda noggrant genom att pipettera upp och ner flera gånger. Snurra kort ner proverna i en mikrocentrifug och fortsätt direkt till Första strängsyntesinkubation (steg 4).
- För mycket degraderad RNA (FFPE), montera den första Strand syntesreaktionen på is i ett nuclease-fritt PCR-rör enligt tabell 4.
| Första Strandsyntesen | Volym (μL) |
| Primad RNA (steg 2.2.3) | 6 |
| Första strängsyntesreaktionsbuffert | 4 |
| Första Strand Specificity Reagens | 8 |
| Första Strandsyntesenzymmixen | 2 |
| Total volym | 20 |
Tabell 4: Första Strandsyntesreaktionen för starkt försämrade RNA. Komponenter i fragmenteringoch priming reaktion för mycket försämrade RNA bör monteras och blandas på is enligt de volymer som visas. En master mix av First Strand Synthesis Reaction Buffer, First Strand Synthesis Specificity Reagens, och First Strand Synthesis Enzyme Mix kan göras och läggas till de primarade RNA prover.
4. Första Strängsyntesinkubaation
- Att hålla rören på is, blanda ordentligt genom att pipetta upp och ner flera gånger. Snurra kort ner proverna i en mikrocentrifug. Inkubera proverna i en förvärmd termisk cycler efter Program #3 (Kompletterande tabell 2).
5. Andra Strand cDNA syntes
- Förbered den andra strängen cDNA syntes reaktion på is genom montering av de komponenter som anges i tabell 5, inklusive den första strängen reaktion produkt från steg 4.1.
| Andra Strand syntes reaktion | Volym (μL) |
| Första Strandsyntesprodukt (steg 4.1) | 20 |
| Andra strängsyntesreaktionsbuffert | 8 |
| Andra Strand syntes enzym mix | 4 |
| Nuclease-fritt vatten | 48 |
| Total volym | 80 |
Tabell 5: Andra Strand syntes reaktion. Komponenter i den andra strängen cDNA syntes reaktion bör monteras och blandas på is enligt de volymer som visas. En master mix av den andra strandsyntesen Reaktion Buffer, Andra Strand Synthesis Enzyme Mix, och Nuclease-free Water kan göras och läggas till den första strandsyntesprodukten.
- Att hålla rören på is, blanda ordentligt genom att pipetta upp och ner flera gånger. Inkubera i en termisk cycler efter Program #4 (Kompletterande tabell 2).
6. cDNA-rensning med SPRI (Fast fas Vändbar immobilisering) Pärlor
- Låt SPRI Pärlor na värmas upp till rumstemperatur i minst 30 min före användning, och sedan vortex SPRI Pärlor för cirka 30 s att avbryta.
- Tillsätt 144 μl resuspended pärlor till den andra strängsyntesreaktionen (~80 μL). Blanda väl genom att pipettera upp och ner minst 10 gånger och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Snurra kort rören i en mikrocentrifug och placera rören på ett magnetiskt rack för att separera pärlor från supernatanten. När lösningen är klar, försiktigt ta bort och kassera supernatant. Var noga med att inte störa pärlorna, som innehåller DNA.
- Tillsätt 180 μl nyberedd 80% etanol i rören medan på den magnetiska rack. Inkubera vid rumstemperatur i 30 s, och sedan försiktigt ta bort och kassera supernatant.
- Upprepa steg 6.4 en gång för totalt 2 tvättsteg.
- Ta bort den kvarvarande etanolen helt. Låt rören på magneträcket och lufttorka pärlorna i ca 3 min med locket öppet, eller tills det är synligt torrt. Torka inte pärlorna över, eftersom detta kan leda till lägre återhämtning av DNA.
- Ta bort rören från magneten och tillsätt 53 μL 0,1 x TE-buffert (ingår i reagenssatsen, se Kompletterande tabell 1)till pärlorna. Pipette upp och ner minst 10 gånger för att blanda ordentligt. Inkubera i 2 min vid rumstemperatur.
- Placera rören på ett magnetiskt rack, så att pärlorna helt kan separeras från supernatanten. Överför 50 μl av supernatanten för att rengöra nuclease-fria PCR-rör. Var noga med att inte störa pärlorna. Detta är en valfri stopppunkt i protokollet, cDNA-prover kan lagras vid -20 °C.
7. Slutreparation av cDNA-bibliotek
- Montera ändreparationsreaktionen på isen genom att montera komponenterna i tabell 6 till den andra strängsyntesprodukten från steg 6.8.
| Reaktion vid slutreparation | Volym (μL) |
| Andra Strand Syntes Produkt (Steg 6.8) | 50 |
| Reaktionsbuffert för slutreparation | 7 |
| End Repair Enzym Mix | 3 |
| Total volym | 60 |
Tabell 6: Ändreparationsreaktion. Komponenter i ändreparationsreaktionen ska monteras och blandas på is enligt de visade volymerna. En master mix av End Repair Reaction Buffer och End Repair Enzyme Mix kan göras och läggas till den andra strandsyntesprodukten.
- Ställ in en pipett till 50 μL och sedan pipett hela volymen upp och ner minst 10 gånger för att blanda ordentligt. Kort centrifugför att samla all vätska från sidorna av rören. Det är viktigt att blanda väl. Förekomsten av en liten mängd bubblor kommer inte att störa prestanda.
- Inkubera proverna i en termisk cycler efter Program #5 (Kompletterande tabell 2).
8. Adapterligation
- Innan ligationsreaktionen ställs in späder du adaptern i iskall adaptorutspädningsbuffert enligt tabell 7, multiplicera med det antal prover som krävs, plus 10 % extra. Håll den utspädda adaptern på isen.
| Ligation utspädning | Volym (μL) |
| Adapter | 0.5 |
| Buffert för adapterutspädning | 2 |
| Total volym | 2.5 |
Tabell 7: Adapterutspädning. Adaptern ska spädas ut på is med adapterutspädningsbuffert enligt de visade volymerna.
- Montera ligationsreaktionen på isen genom att lägga till komponenterna enligt beskrivningen i tabell 8, i den ordning som anges, till slutet prep reaktion produkt från steg 7.3. Observera att Ligation Master Mix och Ligation Enhancer kan blandas i förväg. Denna blandning är stabil i minst 8 timmar vid 4 °C. Blanda inte ligationmastermixen, Ligationsförstärkaren och adaptern före användning i adapternligationssteget.
| Ligation Reaktion | Volym (μL) |
| Avsluta Prepped DNA (steg 7.3) | 60 |
| Utspädd adapter (steg 8.1) | 2.5 |
| Ligation förstärkare | 1 |
| Ligation Master Mix | 30 |
| Total volym | 93.5 |
Tabell 8: Ligationreaktion. Komponenter i adapterligationsreaktionen ska monteras på is enligt de volymer som visas i den ordning som visas. En master mix av Ligation Enhancer och Ligation Master Mix kan göras och läggas till End Prepped DNA med utspädd adapter. Blanda inte den utspädda adaptern och LigationMaster Mix eller Ligation Enhancer innan du blandar med end prepped DNA.
- Ställ in en pipett till 80 μL och sedan pipett hela volymen upp och ner minst 10 gånger för att blanda ordentligt. Utför en snabb spinn för att samla all vätska från sidorna av rören. Ligationmastermixen är mycket viskös. Var noga med att säkerställa tillräcklig blandning av ligering reaktion, som ofullständig blandning kommer att resultera i minskad ligering effektivitet. Förekomsten av en liten mängd bubblor kommer inte att störa prestanda.
- Inkubera efter Program #6 (Kompletterande tabell 2), och ta sedan bort ligeringsblandningen från värmeväxlaren och tillsätt 3 μL adaptatmedivt bearbetningsenzym, vilket resulterar i en total volym på 96,5 μL.
- Pipette upp och ner flera gånger för att blanda väl, och sedan inkubera efter Program #7 (Kompletterande tabell 2) innan du fortsätter omedelbart till rening av Ligation Reaktion.
9. Rening av Ligation reaktion med SPRI Neads
- Låt SPRI Pärlor att värma till rumstemperatur i minst 30 min före användning, och sedan vortex SPRI Pärlor för cirka 30 s att avbryta.
- Tillsätt 87 μl resuspended SPRI Pärlor och blanda väl genom att pipetta upp och ner minst 10 gånger. Inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
- Snurra kort rören i en mikrocentrifug och placera rören på ett magnetiskt rack för att separera pärlor från supernatanten. När lösningen är klar (~ 5 min), försiktigt ta bort och kasta supernatant. Kasta inte pärlorna.
- Tillsätt 180 μl nyberedd 80% etanol i rören medan på den magnetiska rack. Inkubera vid rumstemperatur i 30 s, och sedan försiktigt ta bort och kassera supernatant. Upprepa steg 9.4 en gång för totalt 2 tvättsteg.
- Ta bort den kvarvarande etanolen helt. Låt rören på magneträcket och lufttorka pärlorna i ca 3 min med locket öppet, eller tills det är synligt torrt. Torka inte pärlorna över, eftersom detta kan leda till lägre återhämtning av DNA.
- Ta bort rören från magneten och tillsätt 17 μL 0,1 x TE-buffert till pärlorna. Pipette upp och ner minst 10 gånger för att blanda ordentligt. Inkubera i 2 min vid rumstemperatur, och placera sedan rören på ett magnetiskt rack, så att pärlorna helt kan separeras från supernatanten.
- Överför 15 μL av supernatanten för att rengöra nuclease-fria PCR-rör. Var noga med att inte störa pärlorna. Detta är en valfri stopppunkt i protokollet, kan adapter-ligated DNA lagras vid -20 °C.
10. PCR Anrikning av adapter ligated DNA
- Ställ in PCR-reaktionen enligt beskrivningen i tabell 9. En master mix som innehåller Pre-Capture PCR Master Mix och Universal Primer kan göras och läggas till adaptern ligated DNA. För multiplexad sekvensering använder du unika indexprimers för varje reaktion och lägger till varje exempel individuellt.
| PCR-anrikning | Volym (μL) |
| Adapter ligated DNA (Steg 10,1) | 15 |
| Förinta PCR Master Mix | 25 |
| Universell PCR Primer | 5 |
| Index (X) Primer | 5 |
| Total volym | 50 |
Tabell 9: PCR-anrikning av adapterligated DNA. Komponenter i PCR-anrikning av adapterligated DNA-reaktion bör monteras och blandas på is enligt de volymer som visas. En master mix av Pre-Capture PCR Master Mix och Universal PCR Primer kan göras och läggas till adaptern ligated DNA. För multiplexad sekvensering ska varje prov ges en unik IndexPrimer.
- Blanda väl genom att försiktigt pipetting upp och ner 10 gånger. Snurra kort rören i en mikrocentrifug och placera i en termisk cycler och utföra PCR-förstärkning med program #8 (Kompletterande tabell 2).
11. Rening av PCR-reaktionen med Hjälp av SPRI-pärlor
- Låt SPRI Pärlor att värma till rumstemperatur i minst 30 min före användning, och sedan vortex SPRI Pärlor för cirka 30 s att avbryta.
- Tillsätt 45 μl resuspenderade pärlor till varje PCR-reaktion (~50 μL). Blanda väl genom att pipettera upp och ner minst 10 gånger, innan du ruvar i 5 min vid rumstemperatur.
- Snurra kort rören i en mikrocentrifug och placera rören på ett magnetiskt rack för att separera pärlor från supernatanten. När lösningen är klar (~ 5 min), försiktigt ta bort och kasta supernatant. Var noga med att inte störa pärlorna som innehåller DNA.
- Tillsätt 180 μl nyberedd 80% etanol i rören medan i den magnetiska rack. Inkubera vid rumstemperatur i 30 s, och sedan försiktigt ta bort och kassera supernatant. Upprepa steg 11.4 en gång för totalt 2 tvättsteg.
- Ta bort den kvarvarande etanolen helt. Låt rören på magneträcket och lufttorka pärlorna i ca 3 min med locket öppet, eller tills det är synligt torrt. Torka inte pärlorna över, eftersom detta kan leda till lägre återhämtning av DNA.
- Ta bort rören från magneten och lägg till 23 μL 0,1 x TE-buffert i pärlorna. Pipette upp och ner minst 10 gånger för att blanda ordentligt. Inkubera i 2 min vid rumstemperatur.
- Placera rören på ett magnetiskt rack, så att pärlorna helt kan separeras från supernatanten. Överför 20 μL av supernatanten för att rengöra nuclease-fria PCR-rör. Var noga med att inte störa pärlorna. Detta är en valfri stopppunkt i protokollet, Pre-Capture Bibliotek kan lagras vid -20 °C.
12. Validera och kvantifiera förfångasbibliotek
- Mät koncentrationen av förskiljningsbiblioteket med hjälp av en fluoremeter och hög känslighetsanalyssats. En minsta avkastning på 200 ng krävs för att gå vidare till del II: Hybridisering och fångst.
- Kör 1 μL bibliotek på ett digitalt elektroforessystem. Vid behov späd provet för att undvika överbelastning av högkänslighetschipet, enligt tillverkarens protokollrekommendationer.
- Kontrollera att elektropherogramet visar en smal fördelning med en toppstorlek på cirka 250-400 bp (se representativa resultat, figur 3 och figur 4).
- Om en 128 bp-topp (adapter-dimer) syns i Bioanalyzer-spåren, och signalens intensitet är ≥ är intensiteten på 250-400 bp-bibliotekssignalen (se Representativa resultat, figur 5) och sedan ta upp provvolymen (från steg 11.7) till 50 μL med 0,1 x TE-buffert och upprepa SPRI-bead-reningen (steg 11). Detta är en valfri stopppunkt i protokollet, Pre-capture bibliotek kan lagras på -20 ° C innan du går vidare till del II: ImmunoPrism Hybridisering och fånga.
Del II: Hybridisering och fångst
13. Kombinera blockering oligos, Cot-1 DNA, Pre-capture Library DNA, och Torr
- Blanda det streckkoderade biblioteket som utarbetats i steg 11 och kvantifierat i steg 12, med Cot-1 DNA och blockera oligos i ett nuclease-free PCR-rör eller 1,5 ml mikrotube, som visas i tabell 10.
| Reagens | Kvantitet/Volym |
| Streckkodsat bibliotek från steg 10.10 | 200 ng |
| Barnsäng-1 DNA | 2 μg |
| Blockera Oligos | 2 μl |
Tabell 10: Hybridisering Förberedelse och torkning. Komponenter som skall kombineras för torkning av bibliotek som förberedelse av hybridisering bör monteras enligt de kvantiteter som visas.
- Torka innehållet i röret med hjälp av en vakuumkoncentrator inställd på 30-45 °C. Detta är en valfri stopppunkt i protokollet. Efter torkning kan rörförvaras över natten i rumstemperatur (15-25 °C) eller längre vid -20 °C.
14. Hybridisera DNA Capture Probes med biblioteket
- Tina 2x Pärstvättbuffert och hybridiseringsbuffert, hybridiseringsbuffertförstärkare, ImmunoPrism Probe Panel, 10x Wash Buffer 1, 10x Wash Buffer 2, 10x Wash Buffer 3 och 10x Stränga tvättbuffert vid rumstemperatur. Kontrollera hybridiseringsbufferten för kristallisering av salter. Om kristaller finns, värm röret vid 65 °C, skaka intermittent, tills bufferten är helt löslös.
- Vid rumstemperatur, skapa Hybridization Master Mix i ett rör. Multiplicera volymer med antalet prover och lägg till 10 % extra, i följande tabell 11.
| Hybridisering Master Mix | Volym (μL) |
| Hybridiseringsbuffert | 8.5 |
| Hybridiseringsbuffertförstärkare | 2.7 |
| ImmunoPrism Probe Panel | 5 |
| Nuclease-Fritt vatten | 0.8 |
| Total volym | 17 |
Tabell 11: Hybridisering master mix. Komponenter i Hybridisering Master Mix bör monteras och blandas i rumstemperatur beroende på de volymer som visas.
- Vortex eller pipett upp och ner för att blanda väl. Tillsätt sedan 17 μl av Hybridiseringmastermixen till varje rör som innehåller torkat DNA. Täta rören och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Vortex proverna, se till att de är helt blandade, och snurra ner proverna kort i en mikrocentrifug. Om tillämpligt, överför varje prov från en 1,5 ml mikrotube till en nuclease-fri PCR-rör.
- Placera proverna i en termisk cycler och kör Program #9 (Kompletterande tabell 2).
- Under inkubationsin, förbereda tvättbuffertarna (steg 15) och streptavidinpärlor (steg 16), vilket ger tillräckligt med tid för att förvärma buffertar och jämställ streptavidinpärlorna.
15. Förbered tvättbuffertar
Obs: Tvätta buffertar levereras som 2x (Bead Wash Buffer) eller 10x (alla andra tvättbuffertar) koncentrerade lösningar.
- Under hybridiseringinkubaationen späder du ut 2x Bead Wash Buffer och 10x Wash Buffers för att skapa 1x arbetslösningar, multiplicera med det antal prover som krävs och lägg till 10 % extra, efter tabell 12. Om 10x Wash Buffer 1 är grumlig, värm flaskan i ett 65 °C vattenbad eller värmeblock för att återsuspendera partiklar. Frysta 1x Tvättbuffertar ska blandas efter upptining.
| Tvätta buffertar | Koncentrerad buffert (μL) | Nuclease-fritt vatten (μL) | Totalt (μL) |
| Bead tvättbuffert | 150 | 150 | 300 |
| Tvättbuffert 1 | 25 | 225 | 250 |
| Tvätt buffert 2 | 15 | 135 | 150 |
| Tvätt buffert 3 | 15 | 135 | 150 |
| Stränga tvättbuffert | 30 | 270 | 300 |
Tabell 12: Tvättbuffertutspädning. Koncentrationstvättbuffertarna bör spädas med nucleasefritt vatten i rumstemperatur beroende på de visade volymerna.
- Aliquot 1x Wash Buffertar i nuclease-fria PCR rör och placera vid lämpliga temperaturer som anges i tabell 13. Var noga med att inkludera tillräckligt med överkörning för rörledningar. För uppvärmda buffertar, använd en termisk cycler inställd på 65 °C med locket inställt på 70 °C.
| Tvätta buffertar | Håll temperatur | Volym/Rör (μL) | Antal rör/prov |
| Bead tvättbuffert | RT (15-25 °C) | 100 | 3 |
| Tvättbuffert 1 | 65 °C | 100 | 1 |
| Tvättbuffert 1 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Tvätt buffert 2 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Tvätt buffert 3 | RT (15-25 °C) | 150 | 1 |
| Stränga tvättbuffert | 65 °C | 150 | 2 |
Tabell 13: Utspädda tvättbuffertar. De utspädda tvättbuffertarna ska alikvoteras i separata rör beroende på volymer och antal rör per prov som visas. Tvättbuffertar måste hållas vid den angivna temperaturen före användning.
- Förbered Bead Resuspension Mix i rumstemperatur enligt tabell 14, multiplicera med det antal prover som krävs och lägg till 10 % extra.
| Bead Resuspension Mix | Volym (μL) |
| Hybridiseringsbuffert | 8.5 |
| Hybridiseringsbuffertförstärkare | 2.7 |
| Nuclease-Fritt vatten | 5.8 |
| Total volym | 17 |
Tabell 14: Bead Resuspension Mix. Komponenter i Bead Resuspension Mix bör monteras och blandas i rumstemperatur beroende på de volymer som visas.
16. Förbered Streptavidin Pärlor
- Jämviktspärlor i rumstemperatur i minst 30 min före användning. Blanda pärlorna noggrant genom att virvla nde i 15 s och aliquot 50 μL pärlor per fångst i ett nuclease-fritt PCR-rör.
- Tillsätt 100 μl 1x Bead Wash Buffer (beredd i steg 15.1) till varje rör. Försiktigt pipett upp och ner 10 gånger att blanda. Placera röret på ett magnetiskt rack, så att pärlorna helt kan separeras från supernatanten.
- Ta bort och kassera den klara supernatanten. Var noga med att inte störa pärlorna.
- Utför följande tvätt.
- Ta bort från magnetiskt rack. Tillsätt 100 μl 1x Bead Wash Buffer till varje rör som innehåller pärlor, och sedan pipett upp och ner 10 gånger för att blanda.
- Placera röret i det magnetiska racket, så att pärlorna helt kan separeras från supernatanten.
- Ta försiktigt bort och kassera den klara supernatanten.
- Upprepa steg 16,4 en gång för totalt två tvättar.
- Ta bort från magnetiskt rack. Tillsätt 17 μl bead resuspension Mix från steg 15.3 till varje rör. Pipette upp och ner flera gånger för att blanda noggrant. Se till att pärlorna inte fastnar på sidorna av rören. Om det behövs, snurra kort rören för att samla pärlorna längst ner.
17. Bind hybridiserade mål till Streptavidin Pärlor
- När hybridiseringen på 4 timmar är klar tar du bort proverna från värmeväxlaren och ställer in den termiska cyclern att inkubera vid 65 °C med det uppvärmda locket inställt på 70 °C.
- Med hjälp av en flerkanalig pipett, överför 17 μl helt homogeniserade pärlor till proverna. Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner 10 gånger.
- Bind DNA till pärlorna genom att placera rören i värmeväxlaren efter Program #10 (Kompletterande tabell 2). Under inkubationsiningen, ta kort bort remsarören var 10-12 min och försiktigt virvel för 3 s för att säkerställa att pärlorna förblir i suspension. Alternativt, blanda genom att pipettera upp och ner flera gånger. Fortsätt omedelbart till Wash Streptavidin Pärlor (steg 18).
18. Tvätta Streptavidin Pärlor för att ta bort obundet DNA
- Använd 1x Wash Buffers från steg 15.2 och lagra uppvärmda buffertar i värmecycler under tvättar.
- Tillsätt 100 μl förvärmd 1x tvättbuffert 1 i rören från steg 17.3. Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner 10 gånger. Placera rören på ett magnetiskt rack, så att pärlorna helt kan separeras från supernatanten.
- Pipette och kasta supernatant, som innehåller obundet DNA. Ta bort från magnetiskt rack.
- Utför följande 65 °C tvätt.
- Tillsätt 150 μl förvärmd 1x strikt tvättbuffert.
- Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner minst 10 gånger. Undvik bubblor under rörledningar. Se till att pärlorna är helt återsuspenderade i alla rör.
- Inkubera i värmeväxlaren vid 65 °C i 5 min.
- Placera rören på ett magnetiskt rack, så att pärlorna helt kan separeras från supernatanten. Pipette och kasta supernatant, som innehåller obundet DNA. Ta bort från magnetiskt rack.
- Upprepa steg 18,4 för totalt två stränga tvättar.
- Utför den första rumstemperaturtvätten.
- Tillsätt 150 μl rumstemperatur 1x tvättbuffert 1.
- Pipette upp och ner 10 till 20 gånger för att helt avbryta pärlorna.
- Täta rören och inkubera i 2 min, omväxlande mellan försiktigt virvlande i 30 s och vila i 30 sekunder. Var säker pärlor i alla brunnar förblir helt resuspended i alla rör i hela inkubationstiden.
- Kort centrifugera rören.
- Placera rören på ett magnetiskt rack, så att pärlorna helt kan separeras från supernatanten. Pipette och kasta supernatanten.
- Täta rören och centrifugera kort. Återgå till magnetiskt rack och använd en 10 μl pipett för att ta bort eventuell akvarvarande tvättbuffert.
- Utför den andra rumstemperaturtvätten.
- Tillsätt 150 μl rumstemperatur 1x tvättbuffert 2.
- Pipette upp och ner 10 till 20 gånger för att helt avbryta pärlorna.
- Täta rören och inkubera i 2 min, omväxlande mellan försiktigt virvlande i 30 s och vila i 30 sekunder. Var säker pärlor i alla brunnar förblir helt resuspended i alla rör i hela inkubationstiden.
- Kort centrifugera rören.
- Överför hela volymen pärlor som återskjutits i Wash Buffer 2 för att rengöra nuclease-fria PCR-rör. Viktigt: Överföring av pärlortill nya rör är viktigt att undvika förorening utanför målet.
- Placera rören på ett magnetiskt rack, så att pärlorna helt kan separeras från supernatanten. Pipette och kasta supernatanten.
- Täta rören och centrifugera kort. Återgå till magnetiskt rack och använd en 10 μl pipett för att ta bort eventuell akvarvarande tvättbuffert.
- Utför den tredje rumstemperaturtvätten.
- Tillsätt 150 μl rumstemperatur 1x tvättbuffert 3.
- Pipette upp och ner 10 till 20 gånger för att helt avbryta pärlorna.
- Täta rören och inkubera i 2 min, omväxlande mellan försiktigt virvlande i 30 s och vila i 30 sekunder. Var säker pärlor i alla brunnar förblir helt resuspended i alla rör i hela inkubationstiden.
- Kort centrifugera rören.
- Placera rören på ett magnetiskt rack, så att pärlorna helt kan separeras från supernatanten. Pipette och kasta supernatanten.
- Täta rören och centrifugera kort. Återgå till magnetiskt rack och använd en 10 μL pipett för att ta bort eventuella kvarvarande tvättbuffert.
- Ta bort från den magnetiska rack och tillsätt 20 μl nuclease-fritt vatten till pärlorna.
- Pipette upp och ner 10 gånger för att säkerställa att pärlor fastnat på sidan av rören har återskjutits.
- Viktigt: Kasta inte pärlorna. Använd hela 20 μL av resuspended pärlor med fångat DNA i steg 19.
19. Utför slutlig, pcr-berikande efter inspelning
- Förbered PCR-huvudmixen efter inspelning enligt följande tabell, multiplicera med det antal prover som krävs och lägg till 10 % extra, enligt tabell 15.
| Komponent för huvudmixkomponent efter inspelning | Volym (μL) |
| PCR MasterMix efter inspelning | 25 |
| Pcr Primer Mix efter inspelning | 1.25 |
| Nuclease-Fritt vatten | 3.75 |
| Total volym | 30 |
Tabell 15: PCR-huvudmix efter inspelning. Komponenter i PCR Master Mix efter infångstbör monteras och blandas på is enligt de volymer som visas.
- Tillsätt 30 μl av PCR-mastermixen efter infångsten till varje prov för en slutlig reaktionsvolym på 50 μL. Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner 10 gånger.
- Placera PCR-rören i värmeväxlaren och inkubera efter Program #11 (Kompletterande tabell 2).
20. Rena PCR-fragment efter inspelning
- Låt SPRI Pärlor att värma till rumstemperatur i minst 30 min före användning, och sedan vortex SPRI Pärlor för cirka 30 s att avbryta.
- Tillsätt 75 μl resuspended pärlor till varje PCR-berikad fångst (50 μL). Blanda väl genom att pipettera upp och ner minst 10 gånger. Streptavidin pärlor kommer inte att störa SPRI bead rening. Inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Snurra kort rören i en mikrocentrifug och placera rören på ett magnetiskt rack för att separera pärlor från supernatanten. När lösningen är klar, försiktigt ta bort och kassera supernatant. Var noga med att inte störa pärlorna, som innehåller DNA.
- Tillsätt 180 μl nyberedd 80% etanol i röret medan i den magnetiska rack. Inkubera vid rumstemperatur i 30 s, och sedan försiktigt ta bort och kassera supernatant.
- Upprepa steg 20,4 en gång för totalt 2 tvättsteg.
- Ta bort den kvarvarande etanolen helt. Låt röret på magnetracketen och lufttorka 3 min med locket öppet, eller tills det är synligt torrt. Övertorka inte pärlorna. Detta kan leda till lägre återhämtning av DNA.
- Ta bort röret från magneten. Elute DNA från pärlorna genom att lägga till 22 μL 0,1 x TE Buffert. Blanda väl genom att pipetta upp och ner flera gånger. Inkubera i 2 min vid rumstemperatur. Placera röret på magnetgallret tills lösningen är klar.
- Ta bort 20 μL av supernatanten och överför till ett rent nuclease-fritt PCR-rör, var noga med att inte störa pärlorna. Detta är en valfri stopppunkt i protokollet, bibliotek kan lagras vid -20 °C.
21. Validera och kvantifiera bibliotek
- Mät koncentrationen av det fångade biblioteket med hjälp av en fluoremeter och högkänslighetsanalyskit.
- Mät den genomsnittliga fragmentlängden för det intagna biblioteket med hjälp av ett digitalt elektrofores-DNA-chip med hög känslighet och beräkna den genomsnittliga fragmentstorleken för varje bibliotek med hjälp av systemprogramvaran. Genomsnittlig fragmentstorlek bör vara ca 250-400 bp (se representativa resultat, figur 6 och figur 7). Detta är en valfri stopppunkt i protokollet, avslutade bibliotek kan lagras vid -20 °C.
22. Sekvensering på en sekvenseringsplattform
- För sekvensering, späd bibliotek till 2 nM och följ tillverkarens riktlinjer för lastning och drift av sequencer. Sekvensbibliotek till ett minsta djup på 15 miljoner enstaka slutläsningar av minst 50 bp i längd.
23. Analys av sekvenseringsdata för att generera immunprofiler och upptäck Biomarkörer med Prisma Portal, ett molnbaserat informatikverktyg
- Skapa ett Prism-konto genom att besöka https://prism.cofactorgenomics.com/
- När du har loggat in klickar du på Skicka nytt projekt i det övre verktygsfältet från valfri sida i Prism för att ladda upp de multiplexed FASTQ sekvenseringfiler, eller ladda upp filer som lagras på BaseSpace med Prism-kontot.
- Fyll i formuläret Nytt projekt inklusive projektnamnet och prover efter grupp eller kohort. Grupperingen av prover och motsvarande grupperingsnamn är nödvändiga för att generera Biomarker Discovery Report. Observera att minst 3 exempel per grupp krävs för att generera Biomarker Discovery Report. Klicka på knappen Starta program om du vill skicka formuläret. en bekräftelsesida visas om den lyckas.
- När du är inloggad klickar du på Visa resultat i det övre verktygsfältet eller någon sida i Prism. Prisma gör det möjligt för en användare att se status för inskickade projekt och visa exempel- och biomarkörrapporter per projekt. Det kommer att finnas en tabell över projekt som användaren har skapat på Prism. Tabellen har tre kolumner för status, namn och datum för inlämning.
Status för varje projekt kan vara:
• "Löpning", där projektanalysen för närvarande är igång, eller,
• "Framgång", där projektanalysen är klar och rapporter finns tillgängliga. - Om ett projekt har slutfört analysen (indikerad av statusen "Framgång" visar du de enskilda exempelrapporterna och en Identifieringsrapport för Biomarker. Observera att Identifieringsrapporten biomarkör endast är tillgänglig om projektet innehåller minst tre prover per grupp som krävs.
- Om du vill komma åt dessa rapporter går du tillbaka till projekttabellen och klickar på namnet på projektet. På den här projektsidan finns det en tabell med en rad för varje exempel i projektet. Klicka på länken i varje rad, under kolumnen Rapport, för att komma åt den enskilda rapporten för varje exempel. Klicka på länken för Biomarker Discovery Report direkt under tabellen. Om inga länkar finns på den här sidan har projektet inte slutfört analysen.
Representative Results
Det finns ett antal kontrollpunkter i hela protokollet som gör det möjligt för en användare att utvärdera kvaliteten och kvantiteten av genererat material. Efter steg 12 som beskrivs i protokollet genereras ett elektropherogram enligt figur 3, representativt för ett typiskt förfångade bibliotek för ett intakt RNA-prov (RIN = 7.8).
Bild 3: Typiskt Förfångaavingsbibliotek Bioanalyzer spår för ett intakt RNA-prov. Förfångabara bibliotek visas som en bred topp runt 250-400 baspar (bp) i storlek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Försiktighet bör iakttas för att undvika överförstärkning, vilket indikeras av den andra toppen runt 1000 bp som visas i figur 4, ett representativt elektropherogram av ett förfångade bibliotek som genereras från ett FFPE RNA-prov (DV200 = 46). Om denna topp är liten i förhållande till huvudtoppen (ca 250-400 baspar (bp), som visas), kommer det inte att störa nedströms steg eller analys. Om den andra toppen är stor i förhållande till 250-400 bp topp, pre-capture biblioteket kan göras om med färre PCR cykler för att minska överförstärkning.
Bild 4: Typiskt Förfångakande bibliotek Bioanalyzer spår för en FFPE RNA prov. Den andra toppen runt 1000 bp är ett tecken på överförstärkning. Om denna topp är liten i förhållande till huvudtoppen runt 250-400 bp (som visas), kommer det inte att störa nedströms steg eller analys. Om den andra toppen är stor i förhållande till 250-400 bp topp, pre-capture biblioteket kan göras om med färre PCR cykler för att minska över-förstärkning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som beskrivs i steg 12.1.3 bör förekomsten av adapterdimor utvärderas för att avgöra om ytterligare rensning är nödvändig. De elektropherogram som visas i figur 5 är representativa för oacceptabla (figur 5A,DV200 = 33) och godtagbara (figur 5B,DV200 = 46) nivåer av adapterdimer, som visas som den skarpa toppen runt 128 bp.
Bild 5: Förfångande bibliotek Bioanalyzer spår. Adaptern dimer dyker upp som en skarp topp runt 128 bp. (A) Överdriven adapter dimers finns i detta elektropherogram. (B)Acceptabla adapternivåer avbildas i detta spår. Båda spåren visar tecken på mild överförstärkning, men detta bör inte störa ImmunoPrism Assay. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vid slutförandet av protokollet, före sekvensering, utvärderas de slutliga biblioteken igen med hjälp av digital elektrofores. Bibliotek tillverkade av FFPE RNA tenderar att ha en mindre genomsnittlig storleksfördelning än bibliotek gjorda av intakt RNA. För intakta RNA-prover bör den resulterande spårningen se ut ungefär som figur 6 (RIN = 9.5). För försämrade eller FFPE RNA bör den resulterande spårningen se ut ungefär som figur 7 (DV200 = 36).
Figur 6: Typiskt Sista bibliotek Bioanalyzer spår för en intakt RNA prov. Slutbibliotek visas som en bred topp runt 250-400 baspar (bp) i storlek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 7: Typiskt Bioanalysator spår för ett FFPE RNA-prov. Bibliotek tillverkade av FFPE RNA tenderar att ha en mindre genomsnittlig storleksfördelning än bibliotek gjorda av intakt RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som beskrivits kan de resultat som genereras med det här protokollet tillämpas på två viktiga sätt, som visas i figur 8.
Bild 8: Två användningsfall i protokollet. De resultat som genereras av denna immun profilering analys tillämpas i två viktiga translationella applikationer. (A)Det första användningsfallet börjar från mänsklig fast tumörvävnad (inklusive FFPE-arkiv) och genererar en individuell immunprofil för provet. (B)När data har genererats för en kohort av mänskliga prover kombineras de med hjälp av Prismportalen för att generera en flerdimensionell biomarkör och motsvarande Biomarkörrapport. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att demonstrera vart och ett av dessa användningsfall ingår representativa data från en liten translationell studie21. De prover som används i denna studie är en uppsättning exemplar från 7 patienter som diagnostiserats och behandlas för icke-småcellig lungcancer (NSCLC). Proverna är patientmatchade fast tumörvävnad från före och efter behandling tarmbiopsier. Först analyserades enskilda prover för att generera en immunprofil, till exempel exempelrapporten som visas i figur 9.
Figur 9: Exempel på individuell immunrapport för ett NSCLC-prov. Prism Portal pipeline genererar en grafisk rapport för varje prov bearbetas, med en representativ rapport som genereras för en NSCLC solid tumör prov som visas här. (A)I rapportens framsida avbildas grafiskt nedbrytningen av immunceller som finns i RNA-provet som extraheras från FFPE-vävnaden. (B)På baksidan av rapporten ingår en tabell över immunceller (i absoluta procentsatser) och utrymningsgenuttryck (i transkriptioner per miljon, eller TPM) samt ett resultatuttalande för analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Immunprofilerna före och efter behandling kan användas för att förstå hur en behandling (kemoterapi eller strålning, i denna studie) har modifierat tumörmikromiljön. Ett exempel visas i figur 10, där förändringar i procent för varje immuncell och totalt immuninnehåll visas före och efter kemoterapi, för en enda patient.
Figur 10: Exempel resultat före och efter behandling. Enskilda immunceller och totalt immuninnehåll data som genereras från före och efter behandling prover från en enda NSCLC patient visas. I det här exemplet fick patienten en kemoterapi regim som behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Patienter kan grupperas efter kriterier såsom kliniska resultat eller fenotyper för jämförelse. I figur 11jämfördes proverna i NSCLC-studien till exempel beroende på tid till sjukdomsprogression efter behandling. En delmängd av patienterna visade sjukdomsåterkommer i >18 månader, och en annan delmängd fortskmade snabbare, under ≤18 månader. Mediandeltatsvärdet (skillnaden mellan värden före och efter behandling) jämförs för varje prov för att identifiera förmodade biomarkörer för sjukdomsprogression.
Figur 11: Exempel på klinisk resultatjämförelse. Kvantitativa förändringar mellan immuncellprocenten i matchade NSCLC-prover före och efter behandlingen beräknades och rapporterades som "delta"-värdet. De markerade i gult visar tydliga signaländringar mellan överlevnadsstatusen. Blå staplar representerar mediandeltavärden för >18 månader fram till sjukdomsprogression, orange staplar representerar mediandeltavärden för ≤18 månader fram till sjukdomsprogression. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Slutligen kan liknande provgrupper användas för att titta specifikt på förbehandlingsprover för att identifiera prediktiva biomarkörer genom att använda Prism-portalen för att generera en Biomarkörrapport. Visas i figur 12, samma kliniska fenotyp (sjukdomsprogression) som beskrivs ovan definierar provgrupperingar. I detta exempel identifierades två immunflyktsgener som statistiskt signifikanta differentiatorer av provgrupperingarna (CD47 och OX40, som visas i den nedre panelen av figur 12A). I det här exemplet, eftersom de enskilda genbiomarkörerna är robusta med tydlig statistisk signifikans, tillför den flerdimensionella biomarkören inte något betydande prediktivt värde (ImmunoPrism, som märks i det övre högra stapeldiagrammet i figur 12B). Den fullständiga dataförteckningen, inklusive resultat för alla 18 analyter för analysen, sammanfattas på baksidan av rapporten, inklusive statistisk analys och en kort sammanfattning av metoderna.
Bild 12: Exempel på biomarkörrapport för NSCLC-prover. Biomarker Discovery-pipelinen levererar en visuell rapport över enskilda biomarkörer och en flerdimensionell biomarkör för maskininlärning med detaljerad statistik. (A)För denna studie identifierade rörledningen två individuella biomarkörer (CD47 och OX40) som statistiskt signifikanta för att definiera sjukdomsprogression med en tröskel på 18 månader. (B)Närmare uppgifter om metoden och fullständiga resultat ingår på baksidan av rapporten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande tabell 1: Reagens kit material. En lista över material som finns i ImmunoPrism Kit listas, tillsammans med de artikelnummer som refereras i tillverkarens protokoll. All annan utrustning och alla material som krävs finns upptagna i materialförteckningen. Besök https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/ för säkerhetsdatablad (SDS). Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande tabell 2: Termisk cycler program. De rekommenderade cykelprogram som refereras i hela protokollet sammanfattas för enkel programmering. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande tabell 3: Sekvensering Index Guide. Indexprimers som anges i reagenssatsen visas. en unik primer läggs till varje reaktion för post-sekvensering demultiplexing. Rekommenderade kombinationer av multiplexning på låg nivå finns också. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Discussion
Protokollet kräver 20 ng intakt eller 40 ng mycket försämrad (FFPE) RNA. RNA-provet bör vara fritt från DNA, salter(t.ex. Det rekommenderas inte att fortsätta med RNA-prover som har ett DV200 <20%. Användning av in-kit kontroll RNA rekommenderas starkt eftersom dessa kontroller ger ett sätt att utvärdera prestanda i hela protokollet, från bibliotek förberedelse till analys.
Protokollet är utformat för att utföras med 0,2 ml PCR-bandrör. Om det är möjligt kan protokollet också utföras med hjälp av brunnarna i en 96-brunnPCR-platta. Använd helt enkelt brunnarna på en 96-brunnPCR-platta i stället för alla hänvisningar till PCR-rör eller bandrör. Använd PCR-plattor med tydliga brunnar bara, eftersom det är viktigt att visuellt bekräfta fullständig återsuspension av pärlor under pärpreningar och tvättsteg.
I hela protokollet, hålla reagenser frysta eller på is om inte annat anges. Använd inte reagenser förrän de är helt tinade. Var noga med att noggrant blanda alla reagenser före användning.
Håll enzym vid -20 °C tills de är färdiga att använda och återgå till -20 °C snabbt efter användning. Använd endast molekylärt nucleasefritt vatten; Det rekommenderas inte att använda DEPC-behandlat vatten. När pipettering för att blanda, försiktigt aspirera och avstå minst 50% av den totala volymen tills lösningarna är väl blandade. Pipett blanda alla master blandningar som innehåller enzymer. Använda virvel för att blanda enzymer kan leda till denaturering och äventyra deras prestanda. Under beadreningar, använd nygjorda 80% etanol lösningar från molekylär kvalitet etanol. Användning av etanollösningar som inte är färska kan resultera i lägre avkastning. Undvik över torkning av pärlorna, eftersom detta kan minska elution effektivitet (pärlor ser spruckna om över torkade).
Som beskrivs i steg 10 läggs unika indexprimers till varje reaktion. Baserat på sekvenserna i dessa index, för multiplikator på låg nivå, är vissa indexkombinationer optimala. Sekvenserna av dessa index krävs för att demultiplexing data efter sekvensering. Sekvenserna och rekommenderade multiplexningskombinationer finns i kompletterande tabell 3. I samma steg är det viktigt att notera att antalet rekommenderade PCR-cykler varierar beroende på kvaliteten på RNA som används, och, viss optimering kan krävas för att förhindra PCR överförstärkning. För ImmunoPrism Intact Control RNA och andra högkvalitativa RNA, starta optimering med 10 PCR cykler. För ImmunoPrism FFPE Control RNA och andra mycket försämrade/FFPE RNA, starta optimering med 15 PCR cykler. Att producera ett testbibliotek med RNA-representant för det material som ska analyseras för att optimera PCR-cykler rekommenderas. Det minsta antalet PCR-cykler som konsekvent ger tillräckligt förinsamling bibliotek avkastning (> 200 ng) bör användas. En sekundär topp runt 1000 bp på Bioanalyzer spår är ett tecken på över-förstärkning(figur 4). Överförstärkning bör minimeras, men närvaron av en liten sekundär topp kommer inte att störa analysen resultat.
För att minimera provförlust och undvika att byta rör kan steg 13 utföras i PCR-rör, bandrör eller en 96-brunnpcrplatta i stället för 1,5 ml mikrorör, om din vakuumkoncentrator tillåter. Rotorn kan tas bort på många koncentratorer. Detta gör det möjligt för bandrören eller plattorna att passa in i vakuumet. Vakuumkoncentrationen kan sedan köras med hjälp av vattenförinnans uttorkningsinställning utan centrifugering. Se handboken för din vakuumkoncentrator för instruktioner. Om proverna torkas ner i bandrör eller en 96-brunnsplatta kan hybridiseringssteget utföras i samma kärl.
Under steg 17, se till att virvla var 10-12 min för att öka pärp fånga effektivitet. Håll försiktigt locken på de varma bandrören vid blandning för att förhindra att rören öppnas.
De tvättar som beskrivs i steg 18 är avgörande för att undvika hög ospecifik kontaminering och måste följas noga. Var noga med att helt avbryta pärlorna vid varje tvätt, helt ta bort tvättbuffertarna och under wash buffer 2-tvätten överför du proverna till ett nytt bandrör (steg 18.6.5). Se till att streptavidinpärlorna är helt återsuspenderade och förblir i suspension under hela inkubationstiden. Stänk på rörlocken kommer inte att påverka fångsten negativt. Under rumstemperaturtvättar kan en microplate virvelmixer användas för att virvla proverna under hela den två minuter långa inkubationstiden för enklare återsuspension. Låt inte streptavidinpärlorna torka ut. Om det behövs, utöka inkubationsi buffertarna för att undvika torkning av pärlorna. Om du använder mer än ett bandrör, arbeta med ett bandrör i taget för varje tvätt medan de andra bandrören sitter i termocycler. Detta kan bidra till att undvika över torkning av pärlor eller rusar, vilket resulterar i dålig resuspension eller andra suboptimala tekniker. För första gången rekommenderas det inte att bearbeta mer än 8 biblioteksreaktioner åt gången.
Nuvarande immunprofileringstekniker ger ett kontinuum av information - från tusentals datapunkter som kräver betydande tolkning (RNA-sekvensering) till en individuell, diskret datapunkt (single-plex IHC). Protokollet som beskrivs här representerar en metod som är någonstans i mitten, med ett fokuserat utrymme som möjliggör hög känslighet, men fånga endast en delmängd av kliniskt relevanta transkriptomiska data. På grund av arten av bulk RNA utvinning, detta protokoll ger inte information om de rumsliga relationerna mellan immunceller och tumör mikromiljön, men resultaten kan kompletteras med bildteknik för att lägga till denna information. Det finns en myriad av tillämpningar för de data som genereras av detta protokoll, eftersom det finns mycket att lära om biologi av cancer som en sjukdom, och terapier utvecklas för att behandla det. Som visas i representativa resultat, den individuella immunrapporten är användbar för att förstå hur en patients immunprofil kan förändras som svar på händelser som sjukdomsprogression eller behandling. Även om resultaten som presenteras här ger några exempel användningfall, andra tillämpningar inklusive undersöka verkningsmekanismen för en terapi och identifiera förmodade biomarkörer av kliniska resultat såsom progression slös och total överlevnad är också Praktiska. När du använder detta protokoll för biomarkör upptäckt applikationer, Är det viktigt att öva god studie design för att säkerställa homogena populationer analyseras, tillräckliga prover ingår för statistisk makt, och källor till partiskhet beaktas. På grund av analysens fokuserade, strömlinjeformade natur är det möjligt att föreställa sig en väg mot klinisk validering och nedströms applicering av dessa biomarkörer en gång upptäckt.
Disclosures
Alla författare är anställda av Cofactor Genomics, Inc., företaget som utvecklat och producerar ImmunoPrism reagens kit och informatik verktyg som används i denna artikel. ImmunoPrism Assay är endast för forskningsanvändning och är inte avsett för användning i diagnostiska procedurer.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna TriStar Technology Group för att tillhandahålla biologiska exemplar för representativa resultat, liksom hela molekylära, analys, produkt och kommersiella team på Cofactor Genomics för sin tekniska expertis och Stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR 8 tube strip | USA Scientific | 1402-2700 | USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip |
| 200 Proof Ethanol | MilliporeSigma | EX0276-1 | Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment |
| 96-well thermal cyclers | BioRad | 1861096 | |
| Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads | Beckman-Coulter | A63882 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification beads |
| Digital electrophoresis chips and kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Agilent High Sensitivity DNA chips and kit |
| Digital electrophoresis system | Agilent Technologies | G2939AA | Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer |
| Streptavidin Beads | ThermoFisher Scientific | 65306 | Dynabeads M-270 Streptavidin |
| ImmunoPrism Kit – 24 reaction | Cofactor Genomics | CFGK-302 | Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit – 24 reactions |
| Human Cot-1 DNA | ThermoFisher Scientific | 15279011 | Invitrogen brand |
| Magnetic separation rack | Alpaqua/Invitrogen | A001322/12331D | 96-well Magnetic Ring Stand |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22620701 | |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2600 | USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube |
| NextSeq550 | Illumina | SY-415-1002 | Any Illumina sequencer may be used for this protocol |
| Nuclease-free water | ThermoFisher Scientific | AM9937 | |
| Prism Extraction Kit | Cofactor Genomics | CFGK-401 | Cofactor Prism FFPE Extraction Kit – 24 samples |
| Purified RNA | - | - | Purified from human tissue samples |
| Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | Qubit 4 System |
| Fluorometric Assay Tubes | Axygen | PCR-05-C | 0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps |
| High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit | Life Technologies | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| Vacuum concentrator | Eppendorf | 22820001 | VacufugePlus |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| Water bath or heating block | VWR/USA Scientific | NA/2510-1102 | VWR water bath/USA Scientific heating block |
References
- Brambilla, E., et al. Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).
- Iacono, D., et al. Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations. Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).
- Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).
- Sierant, M. C., Choi, J. Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools. Genomics Inform. 16, (2018).
- Klauschen, F., et al. Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning. Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).
- Danaher, P., et al. Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).
- Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape. Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).
- Newman, A. M., et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).
- Becht, E., et al. Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression. Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).
- Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. Data normalization considerations for digital tumor dissection. Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).
- Chen, S. H., et al. A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues. BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).
- Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nature Communications. 4, 2612 (2013).
- Foley, J. W., et al. Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ. Genome Research. , (2019).
- Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482 (2019).
- PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO. , OncologyPRO. https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer (2019).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs. JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Schillebeeckx, I., et al. Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting. Journal of Molecular Diagnostics. 21, Baltimore, MD. (2019).
- Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma. Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).
- Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer. Human Pathology. 69, 110-117 (2017).
- Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting. Cancer Research. 79 (13 Suppl), Atlanta, GA. (2019).
