Summary
تمثل الـ DNA FISH ثلاثية الأبعاد أداة لتصور اللوية الجينومية المتعددة داخل النوى المحفوظة ثلاثية الأبعاد، مع تحديد تفاعلاتها المتبادلة وتوطينها بشكل لا لبس فيه داخل الفضاء النووي على مستوى خلية واحدة. هنا ، يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة لمجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية.
Abstract
والسؤال الرئيسي في بيولوجيا الخلايا هو تنظيم الجينوم داخل الفضاء النووي وكيف يمكن أن تؤثر بنية الكروماتين على عمليات مثل التعبير الجيني وهوية الخلية والتمايز. يمكن تقسيم العديد من النُهج التي تم تطويرها لدراسة العمارة ثلاثية الأبعاد للجينوم إلى فئتين متكاملتين: التقنيات القائمة على التقاط تشكيل الكروموسوم (C-technologies) والتصوير. في حين أن الأول يقوم على التقاط تشكيل الكروموسوم والتفاعلات الحمض النووي القريب في مجموعة من الخلايا الثابتة ، وهذا الأخير ، على أساس تهجين الحمض النووي في الموقع (FISH) على النوى 3D الحفاظ عليها ، يسمح التصور المعاصر لل loci متعددة على مستوى خلية واحدة (متعددة الألوان)، ودراسة تفاعلاتها وتوزيعها داخل نواة (3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك). تقنية ثلاثية الأبعاد للحمض النووي متعدد الألوان FISH لديها حد من تصور سوى عدد قليل من loci المحددة مسبقا، لا يسمح بإجراء تحليل شامل للبنية النووية. ومع ذلك ، نظرا لمتانة نتائجها ، 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك في تركيبة مع المجهر 3D وإعادة بناء الصورة هو وسيلة ممكنة للتحقق من صحة النتائج القائمة على التكنولوجيا جيم ودراسة لا لبس فيها موقف وتنظيم loci محددة على مستوى خلية واحدة. هنا ، نقترح طريقة خطوة بخطوة من 3D متعدد الألوان DNA FISH مناسبة لمجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية ومناقشة جميع الإجراءات العملية والخطوات الحاسمة ومفاهيم التصوير ثلاثي الأبعاد وتحليل البيانات اللازمة للحصول على ثلاثية الألوان ناجحة وغنية بالمعلومات الحمض النووي الأسماك في سياقات بيولوجية مختلفة.
Introduction
تحتاج eukaryotes أعلى إلى تكثيف منهجي والتعاقد على كمية كبيرة من المعلومات الوراثية في الفضاء 3D دقيقة من نواة1،2،3،4. اليوم ، ونحن نعلم أن يتم ترتيب الجينوم مكانيا في المقصورات والمجالات المرتبطة طوبولوجية5 ، وأن مستويات متعددة من طي الحمض النووي تولد الاتصالات بين مناطق الجينوم المختلفة التي قد تنطوي على تكوين حلقة الكروماتين6،7. يمكن للحلقات الديناميكية ثلاثية الأبعاد من الكروماتين أن تؤثر على العديد من العمليات البيولوجية المختلفة مثل النسخ8،9، التمايز والتطوير10،11، إصلاح الحمض النووي12،13، في حين تشارك اضطراباته في أمراض مختلفة14،15،16 وعيوب النمو15،17،18.
وقد تم تطوير العديد من النهج لدراسة تنظيم الجينوم 3D. الكروموسوم الالتقاط التكنولوجيات القائمة على (C-التكنولوجيات، 3C، 4C، 5C، مرحبا-C والمشتقات) وقد وضعت لدراسة تنظيم الجينوم في الخلايا الثابتة3،4،19،20. وتستند هذه النُهج إلى القدرة على التقاط ترددات الاتصال بين موضع الجينوم في القرب المادي. C-التكنولوجيات، اعتمادا على تعقيدها، وقبض على منظمة الجينوم 3D العالمية والطوبولوجيا النووية من عدد الخلايا3،4،19،20. ومع ذلك ، فإن التفاعلات ثلاثية الأبعاد ديناميكية في الزمان والمكان ، ومتغيرة للغاية بين الخلايا الفردية التي تتكون من تفاعلات متعددة ، وهي غير متجانسة على نطاق واسع21،22.
تُعنى تقنية التهجين ثلاثي الأبعاد للحمض النووي متعدد الألوان في الموقع (FISH) بتصور موضع جينومي محدد على مستوى خلية واحدة، مما يتيح إجراء تحقيق مباشر في البنية النووية ثلاثية الأبعاد بطريقة مكملة لتقنيات C. وهو يمثل تكنولوجيا تستخدم حاليا للتحقق من صحة النتائج C بشكل لا لبس فيه. يستخدم الحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان FISH مسابر ذات علامة فلورية مكملة لموضع الجينوم للاهتمامات. استخدام الفلوروفوريات المختلفة ومعدات المجهر مناسبة تسمح التصور المعاصر لأهداف متعددة داخل الفضاء النووي23،24. في السنوات الأخيرة ، تم دمج FISH مع التقدم التكنولوجي في المجهر للحصول على تصور الهياكل ذات النطاق الدقيق بدقةعالية 25،26 أو مع نهج CRISPR-Cas لتصور الأحماض النووية في التصوير الحي27،28. على الرغم من اعتماد واسع النطاق، لا يزال نهج الحمض النووي متعدد الألوان متعدد الألوان يعتبر صعبًا في العديد من المختبرات لأنه يجب تكييف المواد البيولوجية المستخدمة.
هنا ، نقدم بروتوكولًا شاملًا لـ 3D MULTIColor DNA FISH (من إعداد الخلية / المسبار إلى تحليل البيانات) ينطبق على مجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية ، مما يتيح تصور loci الجينومية المتعددة والحفاظ على بنية 3D من النوى. من أجل دراسة العمارة النووية ، يجب الحفاظ على هيكل النوى ثلاثية الأبعاد. لهذا السبب ، على النقيض من البروتوكولات القائمة الأخرى29،30،31، نتجنب استخدام تدرج الكحول وتخزين القسائم في الكحول التي يمكن أن تؤثر على بنية الكروماتين32. يتم تكييف هذه الطريقة من الحفاظ على بروتوكولات الحمض النووي 3D FISH24،33 ليتم تطبيقها على مجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية ، سواء المعزولة في الجسم الحي السابق أو المستزرعة في المختبر. هناك معلمات permeabilization وإزالة البروتينة لمختلف مورفولوجيا النووية والخصائص الخلوية (على سبيل المثال، درجات مختلفة من الضغط النووي، وفرة الهيكل الخلوي)34. وغالباً ما توصف هذه المعلمات عموماً في بروتوكولات أخرى24،33، دون تقديم تمييز واضح للإجراء داخل أنواع الخلايا المختلفة. وعلاوة على ذلك، قمنا بتطوير أداة محددة تسمى NuCLаD (محدد مواقع الاتصالات النووية في 3D)16، وتوفير مبادئ لتحليل البيانات من شأنها تحسين القرب ثلاثي الأبعاد بين أماكن مختلفة وتوزيعها الطوبولوجي النووي داخل الفضاء النووي بطريقة آلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الحمض النووي إعداد التحقيق وإجراءات وضع العلامات مع ترجمة نك
- تنقية وتنظيف الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BACs)، plasmids أو منتجات PCR مع مجموعات محددة(جدول المواد)،إعادة تعليق في ddH2O، والتحقق من قبل electrophoresis على هلام agarose والقياس الكمي.
- إجراء ترجمة نك على 1.5−2 ميكروغرام من الحمض النووي من الخطوة 1.1 في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر عن طريق خلط جميع الكواشف في أنبوب الحمض النووي المنخفض 0.5 مل وفقاً للجدول 1.
ملاحظة: يمكن للتحقيقات المسماة مباشرة تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. مجموعات لإنتاج تحقيقات وصفت بشكل غير مباشر ومباشر مع مختلف الفلوروكرومات اليكسا عن طريق ترجمة نك متوفرة تجاريا. - احتضان مزيج ترجمة الـ nick في خلاط حراري عند 16 درجة مئوية لفترة حسب طول مادة الحمض النووي الأولية: 45 دقيقة لمنتجات PCR (مجموعة من منتجات PCR من 2000 نقطة أساس لكل منها) وما يصل إلى 4 ساعة لـ BAC DNA وplasmids.
- تحقق من حجم المسابير المنتجة في الخطوة 1.3 عن طريق الكهربية على هلام agarose 2.2٪.
ملاحظة: حجم المسبار الأمثل هو < 200 bp(الشكل 1A).- إذا لم يتم هضم الحمض النووي بما فيه الكفاية، أضف 5 يو من بوليميراز الحمض النووي الأول و0.05 U من DNase I إلى التفاعل واحتضان 1-2 ساعة عند 16 درجة مئوية ثم إعادة التحقق. وقف رد الفعل مع 0.5 MM EDTA (التركيز النهائي). مخزن المسابير في -20 درجة مئوية.
- لكل تجربة الحمض النووي الأسماك، تعجل الكميات التالية من المسابير اعتمادا على المواد DNA بدءا من التي يتم إنتاج المجسات: 200 نانوغرام من منتجات PCR ترجمة نك، 100 نانوغرام من BACs ترجمة نك، أو 300 نانوغرام من بلازميد مترجمة. أضف ddH2O حتى 150 ميكرولتر، و20 ميكروغرام من الحمض النووي لمنوى السلمون غير الموسومة، و3.5 ميكروغرام من الحمض النووي Cot-1 الخاص بالأنواع، و3 مجلدات من EtOH بنسبة 100٪، و1/10 حجم 3 M خلات الصوديوم 5.2. راسب عند -80 درجة مئوية لساعة واحدة.
- الطرد المركزي في السرعة القصوى ل1 ساعة في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant. غسل بيليه مرتين مع 70٪ EtOH.
- إعادة تعليق بيليه في 2 μL من 100٪ formamide درجة الحموضة 7.0، يهز في 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (يمكن أن يستغرق ما يصل إلى بضع ساعات) ومن ثم إضافة حجم متساو من 4x المالحة الصوديوم سترات (SSC)/20% كبريتات دإكستران.
- إعداد 20x SSC عن طريق خلط 175.3 غرام من NaCl و 88.2 غرام من سترات الصوديوم في حجم نهائي من 1 لتر من H2O. أوتوكلاف، تصفية وإعداد aliquots.
ملاحظة: بالنسبة لـ DNA FISH متعدد الألوان، يمكن أن تُعجَّل المجسات المختلفة معًا باستثناء المسابير التي يمكن أن تكون مع بعضها البعض. في هذه الحالات المحددة، نعالجها بشكل منفصل، وتعجل ويعاد تعليق المسابير التي تقسم الكواشف المذكورة في الخطوات 1.5-1.7 فيما يتعلق بعدد المسابير. تجمع المجسات فقط بعد إعادة التعليق في formamide. إذا تم استخدام التغطيات الزجاجية التي تزيد عن 10 مم أو أقل من 10 مم، فقم بزيادة/انخفاض حجم الكواشف المستخدمة في الخطوات 1.5−1.7 بشكل متناسب مع حجم الشريحة. يمكن تخزين مسابجة التهجين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لفترة طويلة من الزمن (تصل إلى شهرين).
- إعداد 20x SSC عن طريق خلط 175.3 غرام من NaCl و 88.2 غرام من سترات الصوديوم في حجم نهائي من 1 لتر من H2O. أوتوكلاف، تصفية وإعداد aliquots.
2- تثبيت الخلايا، والعلاج المسبق، ونفاذها
ملاحظة: ممرات البيرمابيلية وإزالة البروتين هي خطوات حاسمة. يعتمد وقت رد الفعل وتركيز الكواشف بشدة على نوع الخلية ، ووفرة السيتوبلازم ، ومورفولوجيا نووية.
- تثبيت الخلايا، ما قبل العلاج ونفاذية للخلايا اللمفاوية T الأساسية البشرية
ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب للخلايا الصغيرة، مع نواة صغيرة وكمية منخفضة من السيتوبلازم.- استخدام القسائم الزجاجية (10 ملم، سمك رقم 1.5H).
- غسل الزجاج مع DDH2O، ثم مع 70٪ EtOH والسماح لهم الجافة. استخدام كوب واحد لكل بئر من لوحة 24 جيدا.
- إضافة 200 ميكرولتر من 0.1٪ بولي-L-ليسين (ث/v)(جدول المواد)مباشرة على الزجاج لتشكيل قطرة. انتبه واحرص على أن يبقى القطرة على سطح الزجاج دون لمس البئر لمدة 2-5 دقيقة.
- تنفيذ الخطوة 2.1.3 مرتين أكثر.
- وضع 200 ميكرولتر من خلايا التعليق (2 × 106/ مل، تعليق PBS من الخلايا اللمفاوية T الابتدائية السابقة) مباشرة على الزجاج، والسماح للخلايا البذور في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة.
- إزالة بسرعة قطرة. إضافة الطازجة 4% PFA (أعدت في PBS/0.1% TWEEN 20, درجة الحموضة 7.0, تصفية) لمدة 10 دقيقة وإصلاح الخلايا المزروعة في RT.
- غسل ثلاث مرات لمدة 5 دقيقة لكل منهما مع 0.05٪ تريتون X-100/PBS (TPBS) في RT. Permeabilize مع 0.5٪ TPBS لمدة 10 دقيقة في RT.
- قم بإجراء علاج RNase بإضافة 2.5 ميكرولتر من كوكتيل RNase(جدول المواد)في 250 ميكرولتر من PBS /well في لوحة 24-well لساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
- شطف في برنامج تلفزيوني، إضافة 20٪ الجلسرين / PBS، واحتضان بين عشية وضحاها (ON) في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أن تتراوح هذه الخطوة من 1 ساعة إلى ON. يمكن الاحتفاظ بالشرائح في 20٪ الجلسرين / PBS في 4 درجة مئوية تصل إلى 7 أيام. - تجميد الجليد الجاف (15-30 ث)، وذوبان الجليد تدريجيا في RT، ونقع في 20٪ الجلسرين / PBS. كرر الخطوة 2.1.9 آخر ثلاث مرات.
- غسل في 0.5٪ TPBS لمدة 5 دقيقة في RT. غسل في 0.05٪ TPBS، مرتين لمدة 5 دقيقة في RT. احتضان في 0.1 N HCl لمدة 12 دقيقة في RT. شطف في 2x SSC.
- احتضان في 50٪ formamide درجة الحموضة 7.0/2x SSC ON في RT.
ملاحظة: يمكن تحسين وقت الحضانة وتقليله في نهاية المطاف. يمكن الاحتفاظ بالشرائح في 50٪ formamide/2x SSC لعدة أيام.
- تثبيت الخلايا، ما قبل العلاج ونفاذية لmyoblasts الإنسان الأولية
ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب للخلايا الكبيرة، مع كمية عالية من السيتوبلازم.- تنمو myoblasts البشرية الأولية مباشرة على نظارات coverslip في لوحات 24-well في وسط النمو (متوسط النسر المعدل ة Dulbecco (DMEM) ، 20٪ مصل الأبقار الجنيني (FBS) ، 25 نانوغرام / مل عامل نمو الليفية (FGF) ، 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) ، 10 ميكروغرام / مل الأنسولين البشري ، 1x الجلوتامين، 1x البنسلين/ستريبتومسين) لمدة 24 ساعة على الأقل (تصل إلى 50-70٪ من التقاء).
ملاحظة: لتسهيل الالتصاق، يمكن استخدام الجيلاتين أو الكولاجين أو البولي L-ليسين لمعطف قسيمة الغطاء قبل البذر. - شطف الخلايا في 2-3 تغييرات من برنامج تلفزيوني. إضافة أدلى حديثا 4٪ PFA وإصلاح الخلايا لمدة 10 دقيقة في RT.
- غسل ثلاث مرات لمدة 3 دقيقة لكل منهما في 0.01٪ TPBS في RT. Permeabilize في 0.5٪ TPBS لمدة 10 دقيقة في RT.
- قم بإجراء علاج RNase بإضافة 2.5 ميكرولتر من كوكتيل RNase(جدول المواد)في 250 ميكرولتر من PBS /well في لوحة 24-well لساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
- شطف في برنامج تلفزيوني، إضافة 20٪ الجلسرين / برنامج تلفزيوني، واحتضان على في RT.
ملاحظة: يمكن أن تتراوح هذه الخطوة من 1 ساعة إلى ON. يمكن الاحتفاظ بالشرائح في 20٪ الجلسرين / PBS في 4 درجة مئوية تصل إلى 7 أيام. - تجميد الجليد الجاف (15-30 ث)، وذوبان الجليد تدريجيا في RT، ونقع في 20٪ الجلسرين / PBS. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- يغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما في برنامج تلفزيوني. احتضان في 0.1 N HCl لمدة 5 دقيقة في RT. شطف في 2x SSC.
- احتضان في 50٪ formamide درجة الحموضة 7.0/2x SSC ON في RT.
ملاحظة: يمكن تحسين وقت الحضانة وتقليله في نهاية المطاف. يمكن الاحتفاظ بالشرائح في 50٪ formamide/2x SSC لعدة أيام. - الشرائح التوازنية (أبقى في 50٪ formamide/2x SSC) في SSC 2x لمدة 2 دقيقة. ثم، equilibrate في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقيقة.
- علاج مع 0.01 N HCl/0.0025% البيبسين من بضع ثوان تصل إلى 5 دقائق, اعتمادا على نوع الخلية. خلال هذه الخطوة ، لاحظ الخلايا تحت المجهر البصري ووقف التفاعل (الخطوة 2.2.11) بمجرد أن تكون النوى خالية من السيتوبلازم ، مع الحفاظ على هيكلها سليمة (على سبيل المثال ، لا تزال النيوكليولية مرئية وسليمة).
- تعطيل البيبسين عن طريق الغسيل مرتين لمدة 5 دقيقة لكل منهما في 50 م م م MgCl2/PBS.
- بعد الإصلاح في 1٪ PFA / PBS لمدة 1 دقيقة غسل لمدة 5 دقيقة في برنامج تلفزيوني. غسل مرتين لمدة 5 دقيقة لكل منهما في 2x SSC، ثم إضافة 50٪ formamide/2x SSC لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- تنمو myoblasts البشرية الأولية مباشرة على نظارات coverslip في لوحات 24-well في وسط النمو (متوسط النسر المعدل ة Dulbecco (DMEM) ، 20٪ مصل الأبقار الجنيني (FBS) ، 25 نانوغرام / مل عامل نمو الليفية (FGF) ، 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) ، 10 ميكروغرام / مل الأنسولين البشري ، 1x الجلوتامين، 1x البنسلين/ستريبتومسين) لمدة 24 ساعة على الأقل (تصل إلى 50-70٪ من التقاء).
3. 3D متعدد الألوان التهجين الحمض النووي الأسماك
- تشويه المجسات عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة، ثم وضعها بسرعة على الجليد.
- تحميل تحقيقات التهجين على شريحة المجهر نظيفة. بدوره غطاء مع الخلايا رأسا على عقب على قطرة من المجسات التهجين.
- ختم غطاء مع الاسمنت المطاط. دع الأسمنت المطاطي يجف تمامًا. ثم ضع الشرائح على كتلة التدفئة وتشوه في 75 درجة مئوية لمدة 4 دقيقة.
ملاحظة: يمكن زيادة توقيت التسخ ودرجة حرارة التسخ، حتى 80 درجة مئوية. - هجين عند 37 درجة مئوية في صندوق معدني يطفو في حمام مائي.
ملاحظة: لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، يمكن أن ترتفع درجة حرارة التهجين إلى 42 درجة مئوية. - قشر قبالة الاسمنت المطاطي، تزج الشرائح في 2x SCC، وتجريد قبالة غطاء الزجاج ونقله إلى SSC 2x في لوحة 6-جيدا.
- اغسل في 2x SSC ثلاث مرات لمدة 5 دقيقة لكل منها في 37 درجة مئوية، وتهتز عند 90 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة. يغسل في 0.1x SSC ثلاث مرات لمدة 5 دقيقة لكل منهما في 60 درجة مئوية، تهتز في 90 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة. شطف لفترة وجيزة في 4x SSC/0.2% TWEEN 20.
4. 3D الكشف عن الحمض النووي متعدد الألوان الأسماك
ملاحظة: بالنسبة للتحقيقات المسماة مباشرة، تخطي الخطوتين 4.1 و4.2.
- كتلة في 4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% بوملين مصل البقر (BSA) لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية في لوحة 24-جيدا, تهتز في 20 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة.
- احتضان مع التركيز المناسب لمكافحة digoxygenin (1:150)، و / أو ستريبتفيفيدين (1:1،000)(جدول المواد)المخفف في 4x SSC/0.2٪ TWEEN 20/4٪ BSA لمدة 35 دقيقة في غرفة مظلمة ومبللة في 37 درجة مئوية.
- يغسل في 4x SSC/0.2% TWEEN 20 ثلاث مرات لمدة 5 دقيقة لكل منهما في 37 درجة مئوية, تهتز في 90 دورة في الدقيقة في لوحة 6-well في شاكر حاضنة.
- Equilibrate في برنامج تلفزيوني وما بعد الإصلاح في 2 ٪ الفورمالديهايد / برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة في RT في لوحة 24 جيدا.
ملاحظة: لا تحتاج المسابير المسماة مباشرة إلى تثبيت بعد. - غسل 5x لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني. وصمة عار مع 1 نانوغرام / مل DAPI (4،6-diamidino-2-phenylindole)/PBS لمدة 5 دقيقة في RT.
- غسل 5x لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني. جبل مع حل antifade(جدول المواد).
5. 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك المجهر والتحليل
- الحصول على صور ثلاثية الأبعاد مع نظام المجهر.
ملاحظة: هنا، يتم استخدام مجهر واسع الحقل بمسافة محورية تبلغ 0.2-0.25 ميكرومتر بين المقاطع المتتالية(الشكل 1B). - تحليل أكوام الصور ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج وأدوات مختلفة (هنا ، NuCLаD أو محدد مواقع الاتصالات النووية في 3D).
ملاحظة: وقد وضعت أداة NuCLεD من أجل تحليل تلقائيا 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك في خلية مضان صورة z-مداخن. NuCLεD يعيد بناء النوى من أكوام صورة الخلية في 3D وكذلك يكتشف وتوطين البقع 3D الفلورسنت. وهو يقيس تحديد المواقع النسبية للبقع في النواة (على سبيل المثال، المسافة من مركز النوى و / أو محيط النوى) والحد الأقصى لنصف قطر لكل نواة ومسافات بين البقع. يتم وصف الأداة والخوارزمية المستخدمة بالكامل في Cortesi et al.16. - تحليل البيانات (على سبيل المثال، المسافات ثلاثية الأبعاد بين موضع الجينوم المحدد وترددات الوسط النووي وترددات الاتصال) التي يتم استردادها بواسطة NuCLεD.
ملاحظة: بالنسبة للمسافات ثلاثية الأبعاد بين موضع الجينوم المحدد والمركزية النووية، يمكنك تطبيع المسافات على الحد الأقصى لنصف قطر كل نواة وتمثل هذه البيانات كتوزيعات ترددية للمسافات العادية من السنت رويد النووي. بالنسبة لدراسات التفاعلات بعيدة المدى، من المفترض أن تكون ترددات الاتصال في حدود 10-20%21 مع عتبة بين المسافة يمكن أن تختلف ويمكن وضعها حول 2 ميكرومتر35.- لإجراء التحليل الإحصائي، تحليل ما يقرب من 100 نواة لكل تكرار البيولوجية. تمثل المسافات ثلاثية الأبعاد بين موضع الجينوم المحدد كتوزيعات تردد تراكمية للمسافات التي تقع تحت العتبة بين المسافات المحددة وتستخدم اختبار tلتقييم أهمية الاختلافات في التوزيعات. أيضا، حساب النسبة المئوية للنواة إيجابية للتفاعلات التي هي تحت عتبة بين المسافة المحددة، واستخدام اختبار فيشر الدقيق لتقييم أهمية الاختلافات في النسب المئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
طريقة 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك المذكورة في هذه المقالة يسمح التصور المعاصر للloci الجينوم مختلفة داخل النوى 3D المحفوظة(الشكل 1B). يسمح هذا البروتوكول بقياس المسافات بين الأليس، ومختلف المواقع الجينومية من أجل تقييم قربها المكاني، وتقييم موقعها داخل الفضاء النووي (على سبيل المثال، مسافة loci من الوسطأو محيط النوى)16. ومع ذلك، هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يجب إعدادها بدقة وتحديداً لكل نوع خلية مستخدمة; فمن المستحسن أن تولي اهتماما خاصا للخطوات التالية لنجاح 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك.
لإعداد مسبار الحمض النووي، تحقق من حجم المسبار هو < 200 bp(الشكل 1A). هذا الحجم يضمن إجراء ناجح ة من 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك(الشكل 1B). يمكن هضم تحقيقات الحمض النووي دون الأمثل التي تنتجها ترجمة نك جزئيا(الشكل 2A)أو أكثر من هضمها(الشكل 2B). مع المجسات المهضومة جزئيًا ، لن يكون للإجراء أي إشارة في الخلايا ، بسبب عدم قدرة المسبار على دخول النوى والتهجين بشكل صحيح إلى loci الجينومي التكميلي. أكثر من المجسات المهضومة سوف تؤدي إلى إشارة غير محددة، وذلك بسبب فقدان التحديد في التهجين وما يترتب على ذلك من زيادة في الخلفية. ويرد مثال تمثيلي لأكثر من المجسات المهضومة في الشكل 3A بالمقارنة مع التحقيق الأمثل مهضوم في الشكل 3B.
لإزالة البروتين والبيبسيين، اتبع هذه الخطوات وفقا لنوع الخلية. على وجه الخصوص ، تأخذ في الاعتبار الحجم النووي ووفرة السيتوبلازم. بالنسبة للخلايا اللمفاوية والخلايا اللمفاوية المعزولة في الجهاز النووي النواة الصغيرة والمضغوطة للغاية والسيتوبلازم الوفير المنخفض ، فإن إزالة البروتين ة HCl أمر بالغ الأهمية. العلاج مع 0.1 N HCl لمدة 5 دقيقة ليست كافية لتصور الحمض النووي الأسماك. 0.1 يوصى بعلاج N HCl لمدة 12 دقيقة لتعزيز إمكانية وصول النوى إلى تحقيقات الحمض النووي والحفاظ على السلامة النووية(الشكل 4A). ليس هناك حاجة إلى هضم البيبسين من السيتوبلازم للحصول على إشارة جيدة من الحمض النووي الأسماك(الشكل 4B).
بالنسبة للأوفيستيات والخلايا الأساسية البشرية التي تحتوي على نواة كبيرة وسيتوبلازم وفير ، فإن خطوة البيبسيينة أساسية. والقدرة قصيرة ودون المستوى الأمثل من الهيكل الخلوي تعوق دخول التحقيق في النوى(الشكل 4C),تنتهي في عدم وجود إشارة الحمض النووي السمك. ومع ذلك ، إذا كانت الخلايا أكثر من pepsinized ، لن تبقى النوى سليمة(الشكل 4D)، وفقدان هيكلها ثلاثي الأبعاد. مثال على نجاح 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك في الشكل 4E.
أثناء التهجين، ختم قسيمة الغطاء بدقة؛ خلاف ذلك، فإن التحقيق تفريق والجافة. يجب أن يتم تنفيذ خطوات التهجين والتهجين بسرعة بحيث لا يكون المسبار والحمض النووي الجينومي reanneal. يمكن زيادة مدة التسخ.
الشكل 1: تحقيقات الحمض النووي التمثيلية وثلاثية الألوان المتعددة الحمض النووي FISH. (A)نيكو مترجمة DNA تحقيقات من الحجم الأمثل تشغيل على 2.2٪ أغاروز هلام (حارة 1، 2)، 50 علامة BP (M). (ب)ممثل 3D نواة الحمض النووي متعدد الألوان الأسماك باستخدام خرائط المسابير إلى 3q11.2 المنطقة (الخضراء)، 10q26.3 المنطقة (الأحمر) و 8q24.13 المنطقة (أرجواني) في myoblasts الإنسان الأولية. ومضادة النوى مع DAPI (الأزرق). تكبير 63x. مقياس شريط = 5 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أمثلة على تحقيقات الحمض النووي FISH غير المهضومة على النحو الأمثل. (أ)غير مهضوم (حارة 1، 2) أو هضمجزئيا (حارة 3) نيكولا مسجلات الحمض النووي المترجمة تعمل على هلام agarose 2.2٪، علامة 2log (M). (B)أكثر من هضم نك مترجمة سجلات الحمض النووي تشغيل على هلام agarose 2.2٪ ، علامة 2log (M). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك باستخدام تحقيقات دون الأمثل أو الأمثل الحمض النووي الأسماك. (أ)ممثل ثلاثي الأبعاد نواة الحمض النووي متعدد الألوان FISH باستخدام أكثر من مسح التحقيق المهضوم إلى منطقة 8q24.13 (أرجواني) في myoblasts الأولية البشرية. ومضادة النوى مع DAPI (الأزرق). تكبير 63x. مقياس شريط = 10 μm.(B)ممثل 3D نواة الحمض النووي متعدد الألوان الأسماك باستخدام رسم الخرائط التحقيق هضمها على النحو الأمثل إلى منطقة 8q24.13 (أرجواني) في myoblasts الإنسان الأولية. ومضادة النوى مع DAPI (الأزرق). تكبير 63x. مقياس شريط = 10 μm. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج المحتملة لخطوات إزالة البروتينة والإنبيب دون المستوى الأمثل على نتائج الحمض النووي متعدد الألوان ثلاثية الأبعاد. (أ)ممثل ثلاثي الأبعاد نواة الحمض النووي متعدد الألوان للخلايا اللمفاوية T الإنسان الأولية تعامل لمدة 5 دقيقة (يسار) أو 12 دقيقة (يمين) مع 0.1 N HCl، وذلك باستخدام رسم خرائط التحقيق إلى منطقة 8q24.13 (الأخضر). ومضادة النوى مع DAPI (الأزرق). تكبير 100x. مقياس شريط = 10 μm.(B)ممثل 3D نواة الحمض النووي متعدد الألوان من الخلايا الليمفاوية T الأولية البشرية تعامل لمدة 12 دقيقة مع 0.1 N HCl (يسار) أو مقرونة 0.01 N HCl/0.0025% البيبسين لمدة 2 دقيقة (يمين)، وذلك باستخدام رسم خرائط التحقيق إلى منطقة 8q24.13 (الأخضر). ومضادة النوى مع DAPI (الأزرق). تكبير 100x. مقياس شريط = 10 μm.(C)ممثل 3D نواة الحمض النووي متعدد الألوان FISH من myoblasts الإنسان الأولية تعامل مع البيبسيينج قصيرة ودون المستوى الأمثل، وذلك باستخدام رسم الخرائط التحقيق إلى المنطقة 8q24.13 (أرجواني). ومضادة النوى مع DAPI (الأزرق). تكبير 63x. مقياس شريط = 10 μm.(D)ممثل 3D نواة الحمض النووي متعدد الألوان FISH من myoblasts الإنسان الأولية تعامل مع خطوة البيبسيينلة لفترات طويلة، وذلك باستخدام رسم الخرائط التحقيق إلى منطقة 8q24.13 (أرجواني). ومضادة النوى مع DAPI (الأزرق). تكبير 63x. مقياس شريط = 5 μm.(E)ممثل 3D نواة الحمض النووي متعدد الألوان FISH من myoblasts الإنسان الأولية تعامل مع ظروف HCl / pepsin الأمثل باستخدام رسم الخرائط التحقيق إلى منطقة 8q24.13 (أرجواني). ومضادة النوى مع DAPI (الأزرق). تكبير 63x. مقياس شريط = 25 ميكرون. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الكواشف الترجمة من نك | التركيز الأولي | التركيز النهائي |
| dNTPs (C-G-A) | 0.5 متر متر | 0.05 م.م |
| dTTP | 0.1 متر متر | 0.01 م.م |
| البيوتين / حفر / Cy3 dUTP | 1 م. م | 0.02 م.م |
| تريس HCl درجة الحموضة 7.8 | 1 متر | 50 م. م. |
| MgCl2 | 100 م.م.م | 5 مليمتر |
| α-mercaptoethanol | 100 م.م.م | 10 مليمتر |
| جيش صرب البوسنه | 100 نانوغرام/ميكرولتر | 10 نانوغرام/ميكرولتر |
| الحمض النووي بول الأول | 10 يو/ميكرولتر | 0.1 U/μL |
| DNase الأول | 1 U/μL | 0.002 U/μL |
| الحمض النووي 2 ميكروغرام | x | x |
| ddH2O | ما يصل إلى 50 ميكرولتر |
الجدول 1: ترجمة نك. جدول يصف جميع الكواشف، وتركيزها والتوقيت المقترح لرد فعل الترجمة نك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف الطريقة الحالية بروتوكولًا خطوة بخطوة لتنفيذ الحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان FISH على مجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية. على الرغم من أن الحمض النووي FISH هو تقنية في الاستخدام الواسع ، فإن الحمض النووي ثلاثي الأبعاد FISH على النوى ثلاثية الأبعاد المحفوظة لا يزال من الصعب القيام به في العديد من المختبرات ، ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى خصائص العينات المستخدمة23،24.
تحقيق سرقة الترجمة هو خطوة أساسية لنجاح 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك; يمكن استخدام العديد من الركائز المختلفة (BAC ، fosmid ، plasmid ، منتجات PCR) لهذا التفاعل ، ويمكن تعديل توقيت التفاعل وتركيز الإنزيم وفقًا لذلك فيما يتعلق بطول الركيزة. هضم المجس السليم أمر أساسي(الشكل 1)، حيث أن المسابير غير المثلى(الشكل 2)ستؤدي إلى عدم وجود إشارة أو إشارة غير محددة(الشكل 3A). Permeabilization، إزالة البروتين، والخطوات المنبهة هي الممرات الحاسمة التي تعتمد بشدة على نوع الخلية المستخدمة. الخلايا مع نواة صغيرة ووفرة منخفضة الخلوي, مثل الجسم الحي السابق عزل الخلايا الليمفاوية T, تتطلب إزالة البروتينمع العلاج لفترات طويلة 0.1 N HCl. أيضا، يُسَلّس في برنامج تلفزيوني مع نسب مئوية أعلى من تريتون X-100 يمكن أن يساعد في دخول التحقيق في نواة هذه الخلايا. على العكس من ذلك ، في المختبر المستزرع ة البشرية myoblasts الأولية التي تقدم نواة أكبر ، مع نسبة عالية من الهيكل الخلوي ، تحتاج إلى هضم الهياكل الخلايا مع البيبسين. يمكن تطبيق هذه الأدوار العامة على مجموعة واسعة من الخلايا ، والجمع في نهاية المطاف بين الخطوات المختلفة اعتمادا على الخصائص الخلوية المحددة.
ويُقترح بقوة استخدام المواد البيولوجية الطازجة، والحلول الطازجة (ولا سيما المنظفات)، والكواشف الفلورية: PFA المصفاة عند درجة الحموضة 7.0؛ والمواد الفلورية المشبعة بالفلور في درجة الحموضة 7.0؛ وPFA المنتفية عند درجة الحموضة 7.0؛ وPFA المنتفية عند درجة الحموضة 7.0؛ وPFA المنتفية عند درجة الحموضة 7.0؛ وPFA المنتفية في درجة الحموضة 7.0؛ وPFA الأوتوكلاف وتصفيتها 20x SSC في درجة الحموضة 7.0؛ شكل مرشح في درجة الحموضة 7.0؛ nuclease المياه المجانية؛ وaliquots المتاح من UTP المعدلة. الحضانة لفترات طويلة مع 20٪ الجلسرين / PBS، أو 50٪ formamide/2x SSC يمكن أن تسهل التهجين. يمكن زيادة HCl و / أو علاج البيبسين. ويمكن تعديل توقيت التهجين، وكمية المسابير، وتركيز وتوقيت حضانة مضادات الديجوكسيجينين وستريبتافيفيدين لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
يمثل الحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان FISH أداة مكملة لتقنيات C ، وهي الطريقة القياسية للتحقق من صحة النتائج المستندة إلى C. إذا اقترنت مع المجهر ثلاثي الأبعاد والتحليل، يمكن للحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان FISH مراقبة القرب بين موضع الجينوم وتوزيعها الطوبولوجي داخل الفضاء النووي على مستوى خلية واحدة. يمكن دمج الحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان FISH مع منهجيات أخرى مثل RNA FISH و الفلورالمناعي للحصول على نظرة شاملة على الديناميكيات والتفاعلات بين loci الجينومي ، RNAs (رسول RNA أو RNA غير الترميز التنظيمي) ومجموعة واسعة من البروتينات ، وتوفير فرصة فريدة لتصور الهيكل النووي والتحقيق في الآليات اللاجينية التي subtend الهوية الخلوية.
على الرغم من التحسن الهائل في تقنيات FISH مع الدقة الفائقة25،26، تصوير الخلية الحية27،28،36، اكتشاف جزيء واحد37، والتصور المعاصر لأهداف متعددة مع صفائف oligonucleotide مثل Oligopaint37،38 مع 3D النهج عالية الإنتاجية39، ويبقى الحد من التكنولوجيا عدد منفصل من loci الجينوم محددة سلفا التي يمكن أن تكون تصور. وهذا يحول دون إجراء تحليل واسع النطاق للبنية النووية. وقد وصفت العديد من الدراسات مؤخرا طرق متتابعة من التهجين لمعالجة تنظيم الجينوم في خلايا واحدة مثل الباركود الحمض النووي FISH40،41،42،43. وستكون هناك حاجة إلى بذل مزيد من الجهود للزوجين بين طبيعة الخلية الواحدة للحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان FISH بخصائص الجينوم الواسعة لتصور عدم تجانس العمارة النووية على نطاق واسع مع تقنيات التصوير ، حيث سيزداد عدد loci التي يمكن اختبارها في كل مرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
يقر المؤلفون بالمساعدة التقنية التي يقدمها مرفق التصوير INGM (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM)، ميلانو، إيطاليا)، ولا سيما C. Cordiglieri، للحصول على المساعدة خلال صور الحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان اقتناء. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية إلى B.B.: برنامج EPIGEN الإيطالي الرائد ، جمعية Française contre les Myopathies (AFM-Telethon ، منحة NR 18754) وجيوفاني رايسركاتوري ، وزارة الصحة الإيطالية (GR-2011-02349383). وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنحة التالية لF.M.: فوندازيون كاريبلو (باندو جيوفاني، منحة NR 2018-0321).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, Pt 2 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , Chapter 4, Unit 4 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
