Summary
Een bioinspired steiger wordt vervaardigd door een zachte fotolithografietechniek met mechanisch robuuste en elektrisch geleidende hydrogels. De micropatroon hydrogels bieden directionele cardiomyocyte cel uitlijning, wat resulteert in een op maat gemaakte richting van actuatie. Flexibele micro-elektroden zijn ook geïntegreerd in het schavot om elektrische controleerbaarheid voor een zelf-actulerend hartweefsel te brengen.
Abstract
Biogeïnspireerde zachte robotsystemen die levende organismen nabootsen met behulp van gemanipuleerd spierweefsel en biomaterialen zijn een revolutie in het huidige bioroboticaparadigma, vooral in biomedisch onderzoek. Het recreëren van kunstmatige levensachtige actuatiedynamiek is cruciaal voor een zacht-robotsysteem. Echter, de nauwkeurige controle en tuning van actuatie gedrag vertegenwoordigt nog steeds een van de belangrijkste uitdagingen van de moderne zachte robotsystemen. Deze methode beschrijft een goedkope, zeer schaalbare en gebruiksvriendelijke procedure om een elektrisch bestuurbare zachte robot te fabriceren met levensechte bewegingen die wordt geactiveerd en gecontroleerd door de samentrekking van hartspierweefsel op een micropatroonsteek ray-achtige hydrogel steiger. Het gebruik van zachte fotolithografiemethoden maakt het mogelijk om meerdere componenten succesvol te integreren in het zachte robotsysteem, waaronder op micropatroon hydrogel gebaseerde steigers met koolstofnanobuisjes (CNT's) embedded gelatine methacryloyl (CNT-GelMA), poly(ethyleenglycol) diacrylaat (PEGDA), flexibel goud (Au) micro-elektroden en hartspierweefsel. In het bijzonder zijn de hydrogels uitlijning en micropatroon ontworpen om de spier- en kraakbeenstructuur van de steekstraal na te bootsen. De elektrisch geleidende CNT-GelMA hydrogel fungeert als een celsteiger die de rijping en contractie gedrag van cardiomyocyten verbetert, terwijl de mechanisch robuuste PEGDA hydrogel structurele kraakbeen-achtige ondersteuning biedt aan de hele zachte robot. Om de harde en broze aard van op metaal gebaseerde micro-elektroden te overwinnen, ontwierpen we een serpentinepatroon dat een hoge flexibiliteit heeft en kan voorkomen dat de kloppende dynamiek van cardiomyocyten wordt belemmerd. De ingebouwde flexibele Au-micro-elektroden zorgen voor elektrische stimulatie in de zachte robot, waardoor het gemakkelijker wordt om het contractiegedrag van hartweefsel te beheersen.
Introduction
Moderne state-of-the-art zachte robots kunnen de hiërarchische structuren en spierdynamiek van vele levende organismen nabootsen, zoals de kwallen1,2,sting ray2,octopus3,bacteriën4en sperma5. Het nabootsen van de dynamiek en architectuur van natuurlijke systemen biedt hogere prestaties in termen van zowel energetische als structurele efficiëntie6. Dit is intrinsiek gerelateerd aan de zachte aard van natuurlijk weefsel (bijvoorbeeld huid- of spierweefsel met een Young's modulus tussen 104−109 Pa), wat zorgt voor een hogere mate van vrijheid en superieure vervorming en aanpassingsvermogen in vergelijking met standaard gemanipuleerde actuatoren (bijvoorbeeld een Young's modulus meestal tussen 109−1012 Pa)6. Cardiale spiergebaseerde soft-actuatoren, in het bijzonder, tonen superieure energie-efficiëntie als gevolg van hun zelfbediening en hun potentieel voor autoreparatie en regeneratie in vergelijking met een mechanisch gebaseerd robotsysteem7. Echter, de fabricage van zachte robots is een uitdaging vanwege de noodzaak van de integratie van verschillende componenten met verschillende fysieke, biologische en mechanische eigenschappen in het ene systeem. Bijvoorbeeld, ontworpen synthetische systemen moeten worden geïntegreerd met levende biologische systemen, niet alleen hen te voorzien van structurele ondersteuning, maar ook het beïnvloeden en moduleren van hun actuatie gedrag. Bovendien vereisen veel microfabricagemethoden agressieve/cytotoxische processen en chemicaliën die de levensvatbaarheid en functie van levende componenten verminderen. Daarom zijn nieuwe benaderingen nodig om de functionaliteit van de zachte robots te verbeteren en hun gedrag te controleren en te moduleren.
Om levende componenten met een goede levensvatbaarheid succesvol te integreren, is een hydrogel-gebaseerde steiger een uitstekend materiaal om het lichaam van een zachte robot te creëren. De fysieke en mechanische eigenschappen van een hydrogel kunnen eenvoudig worden afgestemd om microomgevingen te creëren voor levende componenten zoals spierweefsels8,9. Ook kan het gemakkelijk verschillende microfabricagetechnieken aannemen, wat resulteert in het creëren van hiërarchische structuren met hoge trouw1,2,10. Flexibele elektronische apparaten kunnen worden opgenomen in de zachte robot om zijn gedrag te controleren met elektrische stimulatie. Zo zijn optogenetische technieken gebruikt om elektrogene cellen te ontwikkelen (bijvoorbeeld cardiomyocyten), die een lichtafhankelijke elektrofysiologische activering vertonen, gebruikt om een op polydimethylsiloxane (PDMS)-gebaseerde zachte robotsteekstraal te ontwikkelen die wordt geleid door licht dat in staat was om de ondulatische beweging van de vis in vitro 2 opnieuw tecreëren. Hoewel optogenetische technieken een uitstekende controleerbaarheid hebben aangetoond, maakt het gepresenteerde werk gebruik van elektrische stimulatie, een conventionele en traditionele simulatiemethode. Dit komt omdat elektrische stimulatie via flexibele micro-elektroden eenvoudig en eenvoudig is in vergelijking met optogenetische technieken, die uitgebreide ontwikkelingsprocessen vereisen11. Het gebruik van flexibele elektronische apparaten kan zorgen voor langdurige stimulatie en standaard/eenvoudige fabricageprocessen, evenals tunable biocompatibiliteit en fysieke en mechanische eigenschappen12,13.
Hier presenteren we een innovatieve methode om een biogeïnspireerde zachte robot te fabriceren, bediend door het slaan van gemanipuleerd hartspierweefsel en gecontroleerd door elektrische stimulatie door ingebedde flexibele Au-micro-elektroden. De zachte robot is ontworpen om de spier- en kraakbeenstructuur van de steekstraal na te bootsen. De steekstraal is een organisme met een relatief eenvoudig aan te bootsen structuur en beweging in vergelijking met andere zwemsoorten. De spieren worden in vitro nagemaakt door cardiomyocyten te zaaien op een elektrisch geleidend hydrogelmicropatroon. Zoals eerder gemeld, verbetert de integratie van elektrisch geleidende nanodeeltjes zoals CNT in de GelMA hydrogel niet alleen de elektrische koppeling van het hartweefsel, maar induceert het ook een uitstekende architectuur van in vitro weefsel en regeling8,9. De kraakbeengewrichten worden vervolgens nagebootst met behulp van een mechanisch robuust PEGDA hydrogel patroon dat fungeert als het mechanisch robuuste substraat van het hele systeem. Flexibele Au-micro-elektroden met een serpentinepatroon zijn ingebed in het PEGDA-patroon om lokaal en elektrisch het hartweefsel te stimuleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en Het gebruik van Proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door het institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik (IACUC) van brigham en vrouwenziekenhuis.
1. GelMA-synthese
- Los 10 g gelatine op in 100 mL van Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) met behulp van een magnetische roerstaaf bij 50 °C.
- Voeg 8 mL methacryl anhydride langzaam toe terwijl u de gelatineprepolymeeroplossing bij 50 °C gedurende 2 uur roert. Verdun de gereageerde gelatineoplossing met voorverwarmde DPBS bij 50 °C.
- Breng de verdunde oplossing over in dialysemembranen (moleculaire gewichtscutoff = 12-14 kDa) en plaats ze in gedeïoniseerd (DI) water. Voer dialyse uit bij 40 °C gedurende ongeveer 1 week.
- Filtreer de dialyzed GelMA prepolymeeroplossing met behulp van een steriel filter (poriegrootte = 0,22 μm) en breng 25 of 30 mL van de oplossing over in 50 mL-buizen en bewaar 2 dagen bij -80 °C.
- Vries de bevroren GelMA prepolymeeroplossing 5 dagen droog met een vriesdroger.
2. Bereiding van poly(ethyleenglycol) diacrylaat (PEGDA) prepolymeeroplossing
- Los 200 mg (20% van de totale oplossing) pegda (MW = 1.000) op met 5 mg (0,5% van de totale oplossing) van 2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (foto-initiator, PI) in 1 mL DPBS.
- Incubeer de prepolymeeroplossing bij 80 °C gedurende 5 min.
3. Bereiding van met GelMA gecoate CNT-oplossing voor verspreide voorraden
- Los 80 mg GelMA (gebruikt als biosurfactant) op in 4 mL DPBS en voeg vervolgens 20 mg COOH gefunctionaliseerde multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) toe aan de GelMA prepolymeeroplossing.
- Sonicate de MWCNT-beladen GelMA prepolymeer oplossing voor 1 uur (0,66Hz, 100 Watt).
OPMERKING: Tijdens het sonaiproces moet de oplossing bij ~15 °C in een waterbad worden ondergedompeld om verdamping van oplosmiddel als gevolg van de temperatuurstijging te voorkomen.
4. Bereiding van 1 mg/mL CNT met 5% GelMA prepolymeeroplossing
- Los 50 mg GelMA en 5 mg (0,5% van de totale oplossing) PI op in 0,8 mL DPBS bij 80 °C gedurende 10 min.
- Voeg 0,2 mL van de voorbereide CNT-voorraadoplossing (stap 3) toe. Vortex en incubeer de oplossing bij 80 °C gedurende 10 min.
5. Bereiding van een 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylaat (TMSPMA) gecoate glazen schuif
- Was de glazen platen (dikte = 1 mm, maat = 5,08 cm x 7,62 cm) met pure ethanol.
- Stapel de gereinigde glijbanen verticaal in een bekerglas van 250 mL en spreid 3 mL TMSPMA er met een spuit over. Bedek de beker met aluminiumfolie om verdamping van TMSPMA te voorkomen.
- Incubeer de glijbanen in een oven van 80 °C gedurende 1 dag.
- Was de gecoate glazen glijbanen door ze te dompelen in pure ethanol, dan drogen.
- Bewaar de gecoate glazen platen verpakt in aluminiumfolie op kamertemperatuur (RT).
OPMERKING: Probeer het aanraken van de oppervlakken van de met TMSPMA gecoate glazen glijbanen tot een minimum te beperken.
6. Fabricage van de flexibele Au-micro-elektroden
- Ontwerp een schaduwmasker met behulp van computer-aided design(Aanvullende Bestand 3).
- Fabriceer en koop een schaduwmasker.
- Was de glazen schuif (dikte = 1 mm, grootte = 3 cm x 4 cm) met aceton en droog met een persluchtpistool.
- Bevestig het schaduwmasker aan de glazen substraten met behulp van dubbelzijdige tape, leg ze vervolgens in een E-beam verdamper en wacht tot de kamerdruk ten minste 10-6 Torr bereikt.
OPMERKING: De twee stukken tape werden handmatig op de steun geplaatst op een afstand kort genoeg om het glas te hosten en groot genoeg om het hele patroon te passen. Deze stap duurt ongeveer 45-60 min. - Dep een 200 nm dikke Au-laag door E-beam verdamper (bijvoorbeeld met Denton EE-4, vacuüm = 10-6 Torr, vermogen = 2,6%, snelheid = 2 Å/s) en snijd de gefabriceerde micro-elektroden met behulp van een zagenmachine (elektrodengrootte = 7,38 mm x 8,9 mm x 200 nm).
7. Fabricage van een Au micro-elektrode-geïntegreerde micropatroon multilayered hydrogel steiger
OPMERKING: Het resultaat van deze procedure is een membraan waarbij een micropatroon PEGDA hydrogel in de onderste laag zit, een micropatroon CNT-GelMA hydrogel bevindt zich bovenop en de Au micro-elektroden tussen de twee lagen. Deze configuratie zorgt voor een betere flexibiliteit van de elektrode en beperkt het risico van breken.
- Ontwerp en fabriceer twee fotomaskers om de micropatroon PEGDA(1e fotomasker) en de CNT-GelMA hydrogel (2e photomask) lagen te maken. Zie Aanvullend bestand 2–3. Het ontwerp kan worden gedaan met behulp van CAD-software.
LET OP: Zie figuur 2B, E. - Plaats 50 μm spacers gemaakt door het stapelen van een laag commerciële onzichtbare tape (Dikte: 50 μm) op een TMSPMA gecoatglas. Giet 15 μL van 20% PEGDA prepolymeer oplossing op de top van de TMSPMA gecoate glas, dan bedekken met goud micro-elektrode. Plaats het 1e fotomasker voor de glazen schuif (micropatroon PEGDA) op de top van de gouden micro-elektrode en stel de hele constructie bloot aan UV-licht (200 W kwikdamp korte booglamp met 320-390 nm filter) op 800 mW intensiteit en 8 cm afstand voor 110 s.
LET OP: Zie figuur 1A. - Voeg DPBS toe om de glazen schuif te omringen en maak de micropatroon PEGDA hydrogel met de Au-microelektroden na 5-10 min voorzichtig los van het ongecoate glassubstraat om de glazen schuif te verkrijgen die de micropatroon PEGDA hydrogel met de Au heeft micro-elektroden.
LET OP: Zie figuur 1B. Door de TMSPMA coating wordt de constructie overgebracht van het ongecoate glassubstraat naar de TMSPMA-gecoate. Maak voorzichtig los omdat de Au-micro-elektroden gemakkelijk kunnen breken tijdens deze stap(figuur 3). - Plaats 100 μm afstandhouders gemaakt door het stapelen van twee lagen van commerciële transparante tape (dikte = 50 μm) op de bodem van een Petri schotel. Dep een druppel van 20 μL CNT-GelMA prepolymeer oplossing tussen de afstandhouders en draai vervolgens de glazen schuif verkregen in 7.3 en bevestig het op de schotel met plakband.
- Draai het apparaat ondersteboven en plaats het2e fotomasker bovenop de glazen schuif. Bloot onder UV-licht bij 800 mW intensiteit en 8 cm afstand gedurende 200 s.
LET OP: Zie figuur 1C. Uitlijning van het 2e masker is belangrijk. - Was het verkregen schavot met DPBS en met celkweekmedium dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat.
- Laat ze 's nachts in de 37 °C incubator voordat het zaaien van de cellen.
8. Neonatale rat cardiomyocyten isolatie en cultuur
- Isoleer harten van 2-dagen oude Sprague-Dawley ratten volgens protocollen goedgekeurd door het Institute's Committee on Animal Care8.
- Zet de hartstukken 's nachts op de shaker (ongeveer 16 uur) in 0,05% trypsine zonder EDTA in HBSS in een koude ruimte.
- Verzamel de hartstukken met een pipetgun en minimaliseer de hoeveelheid trypsine, stop ze vervolgens in een 50 mL buis met 10 mL warme hartmedia (10% FBS, 1% P/S, 1% L-glutamine).
- Wervel langzaam (~ 60 rpm) in een waterbad van 37 °C gedurende 7 min. Verwijder de media voorzichtig uit de buis met een 10 mL pipet en laat de hartstukken in de buis.
- Voeg 7 mL collageen type 2 toe in HBSS en wervel gedurende 10 m in een waterbad van 37 °C.
- Meng met een 10 mL pipet 10x voorzichtig om de hartstukken te verstoren. Verwijder de media uit de buis met een 1 mL pipet.
- Voeg 10 mL van 0,1% collageen type 2 in HBSS en wervel snel (~ 120-180 rpm) in een 37 °C waterbad voor 10 min, controleer dan of de hartstukken oplossen.
- Meng met een 10 mL pipet en herhaal met een pipet van 1 mL om de laatste hartstukken te breken.
- Zodra de oplossing er homogeen uitziet, plaatst u een 70 μm celzeef op een nieuwe buis van 50 mL en pipett de oplossing 1 mL tegelijk op zeef.
- Centrifugeer de hartceloplossing op 180 x g gedurende 5 min bij 37 °C.
LET OP: Als er nog wat hartstukken of slijm zijn dat niet is opgelost, herhaal dan opnieuw stappen 8.7–8.9. - Verwijder zorgvuldig alle vloeistof boven de celpellet en bretel de cellen in 2 mL cardiale media.
- Voeg 2 mL cardiale media van de buiswand zorgvuldig om de cellen opnieuw op te schorten en te voorkomen dat ze breken.
- Voeg de zwevende cellen toe aan een T175-kolf met warme cardiale media druppel voor druppel. Doe de kolf gedurende 1 uur in een couveuse van 37 °C om cardiale fibroblasten aan de bodem te bevestigen.
OPMERKING: Bij deze voorbereidende stap zullen de cardiale fibroblasten aan de kolf hechten, terwijl de cardiomyocyten in het suspensiemedium blijven. - Verzamel de media uit de kolf die de cardiomyocyten bevat en zet het in een 50 mL buis.
- Tel de cellen en centrifugeer op 260 x g gedurende 5 min bij 37 °C.
- Resuspend en zaad van de cellen op de top van de vervaardigde zachte robot in stap 7. Giet specifiek volume van cardiale media met de cardiomyocyten bij een concentratie van 1,95 × 106 cel/mL druppel voor druppel op het gehele oppervlak van het apparaat.
- Incubeer de monsters bij 37 °C en verander de media met 5 mL celkweekmedia met 2% FBS en 1% L-glutamine op de eerste en tweede dag na het zaaien. Verander de media elke keer dat de kleur van de media verschuift.
9. Celkleuring voor uitlijningsanalyse
- Verwijder de media en was met DPBS gedurende 5 min bij RT.
- Fix de cellen met behulp van 4% paraformaldehyde (PFA) voor 20 min bij RT. Was dan met DPBS voor 5 min bij RT.
- Incubeer de cellen met 0,1% triton in DPBS bij RT gedurende 1 uur. Was 3x met PBS gedurende 5 min bij RT.
- Incubeer de cellen met 10% geitenserum in DPBS bij RT gedurende 1 uur.
- Bebroed de cellen met een primair antilichaam (sarcomeric α-actinine en connexin-43) in 10% geitenserum in DPBS bij 4 °C voor ~14-16 uur.
- Was 3x met DPBS gedurende 5 min bij RT. Incubeer de cellen met het secundaire antilichaam in 10% geitenserum in DPBS bij RT gedurende 1 uur.
- Was 3x met DPBS voor 5 min bij RT, dan counterstain cellen met 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in DI water (1:1,000) voor 10 min bij RT. Was 3x met DPBS voor 5 min bij RT.
- Neem fluorescentiebeelden met behulp van een omgekeerde laser scanning confocale microscoop.
10. Actuator testen en gedragsevaluatie
- Spontaan slaan van de cardiomyocyten op de zachte robot
- Incubeer biogeïnspireerde actuatoren bij 37 °C gedurende 5 dagen en ververs de media op dag 1 en 2 en indien nodig (d.w.z. wanneer de media geel worden). Gebruik een omgekeerde optische microscoop om dagelijks beelden te maken (5x en/of 10x). Neem celbewegingen op met behulp van videocapturesoftware op het live venster van de microscoop voor 30 s bij 20 frames per seconde (5x en/of 10x) wanneer de contractiele activiteit begint (over het algemeen rond dag 3).
- Los op dag 5 de membranen los door voorzichtig met een afdekplaat van de rand te tillen.
OPMERKING: Als de cellen een sterk kloppend gedrag vertonen, zullen de membranen zich losmaken door de mechanische werking van de weeën.
- Bulk elektrische signaalstimulatie
- Met behulp van een PDMS van 3 cm in de ruimte als houder, breng je twee koolstofstaafelektroden met platina (Pt) draad aan in een petrischaal van 6 cm gevuld met cardiale media. Breng vervolgens voorzichtig de zachte robot over in de petrischaal.
- Breng een vierkante golfvorm aan met een pulsbreedte van 50 ms, DC-offsetwaarde 0 V en piekspanningsamplitude tussen 0,5 en 6 V. De frequentie varieert tussen 0,5, 1,0 en 2,0 Hz met een duty cycle tussen respectievelijk 2,5%, 5% en 10%. Neem macroschaalcontracties op met een commercieel beschikbare camera.
- Elektrische stimulatie met de Au micro-elektroden
- Na de fabricage van Au micro-elektrode-geïntegreerde multilayered hydrogel steiger, bevestig twee koperen draden aan de Au elektroden al een externe vierkante poort met behulp van zilver pasta.
- Bedek de zilveren pasta met een dunne laag PDMS vooruitgehard op 80 °C gedurende 5 min. Zet de monsters vervolgens op een hete plaat op 45 °C gedurende 5 uur om de PDMS volledig te kruisen.
- Na het zaaien van cardiomyocyte, breng een vierkante golf elektrische stimulus op de koperen draden met DC offset waarde 1 V, piekspanning amplitude tussen 1,5 en 5 V, en frequenties van 0,5, 1,0, en 2,0 Hz respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stroomdiagram van de stappen voor de ontwikkeling van de Au micro-elektrode-geïntegreerde biogeïnspireerde zachte robot
Het doel van het zachte robotontwerp was om een membraan te bouwen dat in staat is om een zwembeweging met minimale complexiteit te bedienen. De structuur moet in staat zijn om sterke flexie herhaaldelijk te ondersteunen na verloop van tijd (ongeveer 1 Hz) en in staat zijn om zijn vorm te behouden, terwijl het bereiken van een sterke afstraffing. Door selectief foto crosslinking van het polymeer met behulp van fotomaskers, vervaardigden we een hiërarchisch gestructureerde steiger bestaat uit een micropatroon PEGDA hydrogel laag, een flexibele Au micro-elektroden laag, en een micropatterned CNT-GelMA hydrogel laag. Een schematisch diagram en de werkelijke beelden van de fabricageprocedure van de zachte robot zoals beschreven in het protocol worden weergegeven in figuur 1. Kortom, er waren drie belangrijke fabricagestappen voor de biogeïnspireerde zachte robot met ingebedde Au micro-elektroden: Ten eerste, een micropatroon PEGDA hydrogel met opgenomen Au micro-elektroden werd verkregen door UV crosslinking met behulp van de 1e fotomasker (Figuur 1A, B). Ten tweede, een meerlaagse constructie bestaande uit Au micro-elektroden, de micropatroon CNT-GelMA, en de PEGDA hydrogels werd vervaardigd door UV crosslinking met behulp van de 2e fotomasker (Figuur 1C). Ten slotte werden cardiomyocyten gezaaid op de gefabriceerde drielaagse constructie om actuatie te bieden aan de zachte robot(figuur 1D).
Verschillende ontwerpen van de zachte robot
Met betrekking tot de vorm van de zachte robot, in het begin, ontwierpen we twee biogeïnspireerde vormen door biomimicking de patronen van twee verschillende waterdieren. Het eerste ontwerp is geïnspireerd op het verschijnen van een caraibic zeester (Figuur 2A, B, C), omdat de zeester kan worden vereenvoudigd tot een tweedimensionaal (2D) object, heeft een harde ruggengraat, en heeft een flexibel deel dat samenvoegt om te bewegen in het water, het minimaliseren van de vereiste beweging. Het tweede apparaat was gebaseerd op de vorm van een mantarog(figuur 2D, E, F)die gemakkelijk te reproduceren is in een 2D-apparaat. De mantastraal kan snel zwemmen met unieke bewegingen. We schetsten de mantarog met behulp van elementaire geometrische vormen met verminderde complexiteit te worden gekruist tijdens de photomask stap. De elektrode, geplaatst langs de middellijn van de structuur, is ontworpen met een golvend patroon, waardoor een betere spreiding van elektrische pulsen en flexibiliteit(figuur 2D). Om de biogeïnspireerde zachte robot te ontwikkelen, werd de mantastraalgeïnspireerde vorm geselecteerd en grondig getest in deze studie.
De uitdaging van het inbedden van de Au micro-elektroden tussen CNT-GelMA en PEGDA hydrogels
De inkapseling van 200 nm dikke Au-micro-elektroden in het gefabriceerde robotlichaam kan de constructie lokaal controleren door elektrische stimulatie te bieden. Hoewel de UV-crosslinking van zowel de CNT-GelMA als pegda hydrogelpatronen direct op het elektrodeoppervlak de delaminatie van de elektroden belemmerde, garandeerde het de succesvolle opname van de elektrode in de zachte robot. Echter, na de overdracht van de Au elektrode op de PEGDA hydrogels, de Au elektrode met een rechthoekige vorm en brede breedte (>1 mm) was gemakkelijk gebroken tijdens het fabricageproces als gevolg van de zwelling van de PEGDA hydrogel (Figuur 3A, B, C). Daarom moesten we ervoor zorgen dat de micro-elektroden met succes werden overgebracht naar de PEGDA hydrogel en ingebed tussen de CNT-GelMA en PEGDA hydrogels terwijl ze intact zijn. Daarom werden Au-micro-elektroden met een serpentinepatroon (dikte = 200 μm) ontworpen en vervaardigd met zachte lithografie. Fase contrast microscoop foto's met verschillende vergrotingen en stadia werden genomen om tekenen van breuk op de elektrode te inspecteren na transport op de micropatroon PEGDA hydrogels(Figuur 3D, E, F).
De optimalisering van de afstand tussen hydrogelmicropatronen
De cardiomyocyte gezaaidE CNT-GelMA laag vertoonde verschillende afstraffingsgedrag volgens het patroon afstanden(Figuur 4A, B). Dit kan worden toegeschreven aan de verschillende manieren waarop cellen aan het oppervlak van het membraan zijn bevestigd, afhankelijk van de afstanden van de lijnen. In het geval van de 50 μm afstand waren de cellen te vol en hadden ze niet de gewenste georganiseerde configuratie. De gedeeltelijk onderling verbonden en niet uitgelijnde cellen op de vleugels droegen niet allemaal tegelijkertijd bij aan de zwembeweging. Vandaar dat de kracht gegenereerd door de cardiomyocyte was niet genoeg om de vleugels te buigen. Op een afstand van 150 μm waren de cellen zeer goed uitgelijnd. Echter, ze zaten voornamelijk in de groef en er waren weinig onderlinge verbanden tussen cellen in de bovenste lagen, wat resulteert in een zwakke afstraffing. Op een afstand van 75 μm werden de cellen uitgelijnd in het onderste deel en met elkaar verbonden in het bovenste deel, met de sterkste afstraffing. Bovendien hebben we, om onomkeerbare volledige rollen van de zachte robot tijdens het dynamisch slaan van de cardiomyocyten te voorkomen, de patroonafstand van de PEGDA hydrogel-steunlaag geoptimaliseerd tot 300 μm (figuur 4C). Ten slotte hebben we na dit parameterisatieproces besloten om ons meer te richten op het mantastraalvormige membraan met PEGDA-patronen van 300 μm afstand en CNT-GelMA-patronen van 75 μm. Hartweefsel op micropatroon PEGDA- en CNT-GelMA patronen werd ook getoond door fase / contrast beelden en F-actine / DAPI confocale beelden (Figuur 4B).
De analyse van de beweging van het hartweefsel op pegda- en CNT-GelMA hydrogels met micropatroon
Om de beweging van de actuator te analyseren, namen we video's van het membraan zonder de Au-micro-elektroden terwijl we een elektrisch veld toepasten met behulp van een koolstofstaafelektrode. Figuur 4D toont enkele frames uit de contractierecords. Het was duidelijk zichtbaar dat de manta straalvormige actuator was het buigen van de vleugels zoals verwacht. De staart balanceerde de structuur door een beetje recht te zetten en de vleugels sloten sterk in het midden. Sommige van de membranen vertoonden een roterende beweging tijdens het samentrekken als gevolg van verkeerd uitgelijnde micropatroon CNT-GelMA en PEGDA hydrogels (figuur 4E en Video 1). In dit geval was de beweging minder gedefinieerd in vergelijking met de vorige, maar de samentrekking was nog steeds sterk genoeg om actuatie van een roterende beweging mogelijk te maken. De totale tijd om een hele cirkel te voltooien was ongeveer 45 s.
De karakterisering van de cardiomyocyten op de gelaagde zachte robot en de controle van het kloppend gedrag door elektrische stimulatie
Na het zaaien en rijpen van cardiomyocyten op het biogeïnspireerde robotsysteem(figuur 5A),werd de uitlijning van het hartweefsel langs de richting van de CNT-GelMA-patronen waargenomen(figuur 5B-E)door zowel F-actin/DAPI als sacromerische/connexine-43/DAPI immunostaining. Confocale fluorescentiebeelden toonden goed langwerpige en uitgelijnde cardiomyocyten op het CNT-GelMA hydrogel patroon(figuur 5B, C). Gedeeltelijke uniaxiale sarcomere uitlijning en onderling verbonden sarcomere structuur werd waargenomen op de patroongebieden(figuur 5D). Goed met elkaar verbonden sarcomerestructuren van hartweefsels die zich direct boven de micro-elektroden bevinden, werden ook waargenomen (figuur 5E). Om de biogeïnspireerde zachte robot te beoordelen, ontdekten we zijn functie met behulp van twee methoden: Ten eerste hebben we een bifasische elektrische puls toegepast op de zachte robot, hoewel koolstofstaafelektroden voor kunstmatige afstemming en het regelen van het kloppend gedrag. Ten tweede hebben we twee koperen draden aangesloten op het buitenste uiteinde van de Au-elektrode voor het genereren van een elektrisch signaal door de hele robotconstructie. Toen we een elektrische stimulatie toepasten via de externe koolstofelektrode of koperdraad die is aangesloten op de Au-elektrode, was de opwindingsdrempelspanning bij verschillende frequenties anders (0,5, 1,0 en 2,0 Hz, figuur 5F).
Figuur 1: Schematisch diagram en werkelijke beelden die het fabricageproces van de biogeïnspireerde multilayered zachte robot weergeven die elektrisch wordt aangestuurd door elektrische signalen via de integratie van flexibele Au-micro-elektroden. (A) Patroon en crosslinking van de PEGDA hydrogel met behulp van de1e fotomasker. (B) Micropatterned PEGDA hydrogel met de ingekapselde Au micro-elektroden op het TMSPMA glas verkregen na stap (A). (C) Crosslinking van de CNT-GelMA patroon hydrogel met behulp van de2e fotomasker. (D) Zaaien van de cardiomyocyten op de meerlaagse constructie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Ontwerp van de biogeïnspireerde zachte robots. (A) Echte zeesterren beeld en verschillende opvattingen van de drie-dimensionale (3D) CAD-model wijzen op de componenten en strepen. (B) Masker ontwerp voor CNT-GelMA patroon, PEGDA patroon, en Au micro-elektroden voor de zeesterren vorm. (C) Optische microscoop beeld van de micropatterned CNT-GelMA en PEGDA patronen voor de zeesterren vorm. (D) Echte manta ray foto en verschillende opvattingen van de 3D CAD-model wijzen op de componenten. (E) Masker ontwerp voor CNT-GelMA patroon, PEGDA patroon, en Au micro-elektroden voor de manta ray vorm, aangepast met toestemming van Su Ryon et al.10. (F) Optische microscoop beeld van de micropatterned CNT-GelMA en PEGDA patronen voor de manta ray vorm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Ontwerp van de flexibele Au-micro-elektroden. (A) Foto van gefabriceerde Au-elektroden met rechthoekige vormen en brede breedtes. (B en C) Optische microscoopbeelden van Au-elektroden die niet overkonden worden op de PEGDA hydrogels. (D) Wavy Au micro-elektroden voor en na (E en F) worden overgebracht op de micropatroon PEGDA hydrogel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: De optimalisatie van pegda- en CNT-GelMA-hydrogels met micropatroon en bewegingsanalyse van zachte robots. (A) Optische beelden van cardiomyocyten op het CNT-GelMA hydrogel patroon met 50, 75 en 150 μm afstand. (B) Optische beelden en F-actine/DAPI-kleuring van cardiomyocyten op respectievelijk de PEGDA- en CNT-GelMA hydrogelpatronen met een afstand van 300 μm en 75 μm. (C) De rollende morfologieën van de biogeïnspireerde constructies met en zonder de micropatroon PEGDA hydrogel met 300 μm afstand. (D) Frames van de vrijstaande biogeïnspireerde zachte robot video opgenomen tijdens de toepassing van de elektrische stimulus. (E) Collage van vier verschillende frames uit de video die de roterende beweging van de zachte robot opneemt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Karakterisering van cardiomyocyten op Au micro-elektrode-opgenomen zachte robot en controle van het kloppend gedrag door elektrische stimulatie. (A) Optische microscoop beeld van de gekweekte cardiomyocyten op de Au micro-elektroden ingekapseld tussen PEGDA en CNT-GelMA hydrogels. (B) F-actin/DAPI fluorescentie beeld met de goed langwerpige en uitgelijnde cardiomyocyten op de CNT-GelMA hydrogel micropatroon. (C-E) Confocale fluorescentie beelden met sarcomere uitlijning en onderling verbonden sarcomere structuren op de vervaardigde zachte robot: (C en D) gekweekte cardiomyocyten op de CNT-GelMA hydrogel micropatroon, en (E) in de buurt van de Au micro-elektroden. (F) Vereiste excitatiedrempelspanning bij verschillende frequenties (0,5, 1,0 en 2,0 Hz) bij het aanbrengen van elektrische stimulatie via koolstofstaafelektrode en ingebedde Au-microelektroden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend dossier 2. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend dossier 3. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van deze methode konden we met succes een batoïde visachtige biogeïnspireerde zachte robot fabriceren met een geïntegreerd zelf-actulerend hartweefsel op een meerlaags gestructureerd schavot dat wordt gecontroleerd door ingebedde Au-micro-elektroden. Door twee verschillende micropatroon hydrogel lagen gemaakt van PEGDA en CNT-GelMA hydrogels, de bio-geïnspireerde steiger toonde een goede mechanische stabiliteit en ideale cel uitlijning en rijping. De PEGDA patroonlaag, die dient als kraakbeengewricht van de skeletarchitectuur in een steekstraal, biedt mechanische ondersteuning voor het hele robotlichaam. Specifiek, het handhaafde mechanische stabiliteit tijdens hartweefsel samentrekking en ontspanning, terwijl het toestaan van efficiënte afstraffing toe te schrijven aan zijn capaciteit om de membraanspanning na samentrekking vrij te geven. Bovendien konden ze door de nanometrische dikte van de micro-elektroden (200 nm) en hun serpentinepatroon flexibel genoeg zijn om de samentrekking van het hartweefsel niet te belemmeren of te beïnvloeden(figuur 2). Om eenvoudig micro-elektroden op het hydrogeloppervlak zonder breuk over te brengen, werden Au-micro-elektroden op het glas vervaardigd zonder hechtingslaag, zoals titanium, dat vaak wordt gebruikt om een sterke hechting tussen het glas en Au te creëren. Ondertussen werd de CNT-GelMA-laag, die ondersteuning biedt voor cardiomyocytenbevestiging en uitlijning, gemaakt met patronen die loodrecht staan op de oriëntatie van het PEGDA hydrogelpatroon(figuur 3). Na de rijping zorgden de cardiomyocyten op de bovenste laag voor zelfbediening voor het hele schavot. Door de lokale elektrische stimulatie van de ingebouwde Au flexibele micro-elektroden, konden we de kloppende frequentie van de robot moduleren zonder het hartweefsel erop te beschadigen. Hoewel deze fabricagemethode gemakkelijk te leren en te reproduceren is, zijn er nog een paar technisch uitdagende stappen in het fabricageproces die moeten worden benadrukt.
Er zijn vijf kritieke stappen voor de fabricage van de zachte biorobot: 1) correcte verspreiding van de CNR's in de GelMA hydrogel; 2) succesvolle UV-crosslinking van de PEGDA en CNT-GelMA hydrogels op het met TMSPMA gecoate glas; 3) overdracht van de Au-micro-elektroden van het steunglas naar het hydrogelpatroon; 4) het correct loskoppelen van de actuator van de ondersteunende glazen schuif; 5) het creëren van goed elektrisch contact tussen de Au micro-elektroden en de draden die worden gebruikt voor de verbinding met de golfvorm generator.
Vergeleken met ongerepte GelMA substraten, de integratie van CNTs biedt de GelMA hydrogel met verbeterde mechanische eigenschappen en geavanceerde elektrofysiologische functies die bijdragen aan hogere spontane synchrone slagsnelheden en een lagere excitatie drempel van myocardiale weefsel9. Het probleem van de cytotoxiciteit van CNT wordt niet alleen voorkomen door gebruik te maken van oppervlaktegefunctionaliseerde CNT's, maar ook door de nanostructuren in de GelMA hydrogelmatrix op te nemen tot een concentratie van 5,0 mg/mL9. In feite leidt de interactie tussen de hydrofobe segmenten van de GelMA hydrogel met de CNTs zijwanden tot de inkapseling van CNT's in de hydrogelporeuze matrix14. Dit voorkomt niet alleen dat ze potentieel giftige aggregaten vormen, maar het verbetert ook de oplosbaarheid van CNT's in zoutoplossingsoplossingen (bijvoorbeeld DPBS of celkweekmedium).
Om de Au-micro-elektroden tussen de PEGDA en CNT-GelMA hydrogels succesvol op te nemen, moet specifieke aandacht worden besteed aan de UV-crosslinking van elke enkele laag. Met name om de Au-micro-elektroden op de PEGDA hydrogellaag over te brengen, moet ervoor worden gezorgd dat de hydrogeloplossing het gehele elektrodegebied bedekt om de breuk van de elektroden tijdens de peelingstap te voorkomen. Daarom is de kwaliteit van de TMSPMA-glascoating van fundamenteel belang om een optimale hechting van de PEGDA hydrogel op het glassubstraat te garanderen, waardoor het onthechting tijdens de overdrachtsstap van de micro-elektroden wordt voorkomen.
Een andere kritieke stap van de methode is het losmaken van de bioactuator van de ondersteunende glasdia. Dit probleem kan gemakkelijk worden opgelost wanneer het spontaan kloppen van de hartweefsels synchroon en sterk genoeg is om de ondersteunende hydrogel van de glasplaat op natuurlijke wijze te pellen. Om deze reden, zoals eerder gemeld, is het van fundamenteel belang om de hydrogel patronen te optimaliseren om een specifieke cel uitlijning gunstig voor de organisatie van een functioneel en synchroon hartweefsel induceren.
Om de micro-elektroden elektrisch aan te sluiten op de golfvormgenerator, moeten elektrische aansluitingen op de micro-elektroden worden gecreëerd. Tijdens deze stap is het belangrijk om de zilveren lijm die wordt gebruikt voor het contact met de micro-elektroden op de koperdraad volledig in te kapselen om cytotoxische effecten te voorkomen. Dit wordt met succes bereikt door het deponeren van een dunne druppel PDMS op de top van het elektrische contact.
Deze methode kon niet alleen de beperkingen van bestaande optogenetische technieken overwinnen, zoals ingewikkelde fabricageprocessen, lange fabricagetijden en potentiële toxiciteit van optogenetische gereedschappen, maar ook de prestaties van celgebaseerde actuatoren die leiden tot real-time stimulatie met behulp van goedkope en gemakkelijk te hanteren technieken. Hoewel het ontwerp van onze huidige biogeïnspireerde actuatoren geen voorwaartse voortstuwing kon genereren, kan het succes ervan op het gebied van autonome celgebaseerde robots veel belangstelling wekken. Deze methode kan ook mogelijk bijdragen aan de ontwikkeling van draadloos aangedreven implanteerbare patches voor een hele robot lichaam. Deze methode maakt de weg vrij voor toekomstige draadloze elektrische stimulatie van soft-biorobots, hoewel de integratie van flexibele RF-circuits direct in het hydrogel-gebaseerde schavot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit document werd gefinancierd door de National Institutes of Health (R01AR074234, R21EB026824, R01 AR073822-01), het Brigham Research Institute Stepping Strong Innovator Award, en AHA Innovative Project Award (19IPLOI34660079).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Beaker | PYREX | 1000-250CNEa | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Milipore | M6514 | |
| 37° Water bath | VWR | W6M | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | |
| 80° incubator | VWR | 1370GM | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Anti-Connexin 43/GJAI antibody | Abcam | ab11370 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Sarcomeric α-actinin | Abcam | ab9465 | Mouse monoclonal |
| Benchtop Freeze Dryers | Labconco | 77500-00 K | |
| Biosafety cabinet | Sterilgard | A/B3 | |
| Carbon rod electrodes | SGL Carbon Group | 6971105 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| CO2 incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Collagenase, Type II, Powder | Gibco | 17-101-015 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| COOH Functionalized Carbon Nanotubes | NanoLab | PD30L5-20-COOH | |
| Dicing saw machine | Giorgio Technology | DAD-321 | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11-965-118 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-144 | |
| E-beam evaporator | CHA | 57367 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10-437-028 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B, 300 bloom from porcine skin |
| Glass slide | VWR | 48382-180 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-079 | |
| Inverted optical microscope | Olympus | CK40 | |
| Magnetic hotplate | Corning | PC-420 | |
| methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276695 | Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor |
| Nunc EasYFlask 175cm2 | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| Olicscope | Siglent | SDS1052DL+ | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PDMS SYLGARD 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| Photomask | Mini micro stencil inc | ||
| Platinum wire | Alfa Aesar | AA43014BU | |
| Polyethylene glycol dimethcrylate | Polysciences Inc. | 15178-100 | |
| Regenerated Cellulose Dialysis Tubing | Fisherbrand | 21-152-14 | |
| Silver Epoxy Adhesive | MG Chemicals | 8330S | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | S2GPU02RE | |
| Ultra sonicator | Qsonica | Q500 | |
| UV Curing System | OmniCure | S2000 | |
| Vortex mixer | Scientific Industry | SI-0246A | |
| Waveform generator | Agilent | 33500B | |
| Wrap Aluminium foil | Reynolds | N/A |
References
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nature Biotechnology. 30 (8), 792-797 (2012).
- Park, S. J., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Laschi, C., et al. Soft Robot Arm Inspired by the Octopus. Advanced Robotics. 26 (7), 709-727 (2012).
- Alapan, Y., et al. Soft erythocyte-based bacterial microswimmers for cargo delivery. Science Robotics. 3 (17), 4423 (2018).
- Magdanz, V., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Development of a Sperm-Flagella Driven Micro-Bio-Robot. Advanced Materials. 25 (45), 6581-6588 (2013).
- Rus, D., Tolley, M. T. Design, fabrication and control of soft robots. Nature. 521 (7553), 467-475 (2015).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16 (18), 3473-3484 (2016).
- Shin, S. R., et al. Aligned Carbon Nanotube–Based Flexible Gel Substrates for Engineering Biohybrid Tissue Actuators. Advanced Functional Materials. 25 (28), 4486-4495 (2015).
- Shin, S. R., et al. Carbon-nanotube-embedded hydrogel sheets for engineering cardiac constructs and bioactuators. ACS Nano. 7 (3), 2369-2380 (2013).
- Shin, S. R., et al. Electrically Driven Microengineered Bioinspired Soft Robots. Advanced Materials. 30 (10), 1704189 (2018).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
- Jia, Z., et al. Stimulating cardiac muscle by light: cardiac optogenetics by cell delivery. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (5), 753-760 (2011).
- Shin, S. R. Carbon Nanotube Reinforced Hybrid Microgels as Scaffold Materials for Cell Encapsulation. ACS Nano. , (2013).
