Summary
バイオインスパイアされた足場は、機械的に堅牢で導電性のヒドロゲルを使用した柔らかいフォトリソグラフィ技術によって製造されています。マイクロパターン化ヒドロゲルは、指向性心筋細胞細胞の位置合わせを提供し、調整された作動方向をもたらす。フレキシブルな微小電極も足場に統合され、自己作動性心臓組織の電気制御性をもたらします。
Abstract
生体に影響を与えたソフトロボットシステムは、生体組織と生体材料を用いて生物を模倣し、現在のバイオロボティクスパラダイム、特に生物医学研究に革命を起こしています。人工的な生命のような作動ダイナミクスを再現することは、ソフトロボットシステムにとって非常に重要です。しかし、動作動作の正確な制御とチューニングは、現代のソフトロボットシステムの主な課題の1つです。この方法は、マイクロパターン化された刺傷上の心筋組織の収縮によって活性化され、制御される生命のような動きを有する電気的に制御可能なソフトロボットを製造するための低コストで、非常にスケーラブルで使いやすい手順を記述する光線状のヒドロゲル足場。柔らかいフォトリソグラフィー法を使用することで、マイクロパターン化ヒドロゲルベースの足場を含むソフトロボットシステムに複数のコンポーネントをカーボンナノチューブ(CNT)組み込みゼラチンメタクリロイル(CNT-GelMA)と組み込み可能にするポリ(エチレングリコール)ジアクリレート(PEGDA)、フレキシブルゴールド(Au)微小電極、心筋組織。特に、ヒドロゲルのアライメントとマイクロパターンは、刺傷線の筋肉および軟骨構造を模倣するように設計されている。導電性CNT-GelMAヒドロゲルは、心筋細胞の成熟および収縮挙動を改善する細胞足場として機能し、機械的に堅牢なPEGDAヒドロゲルは軟骨状の構造をソフトロボット全体に支えます。金属ベースの微小電極の硬くて脆い性質を克服するために、高い柔軟性を持ち、心筋細胞の鼓動を妨げないようにできる蛇行パターンを設計しました。組み込まれた柔軟なAu微小電極は、柔らかいロボット全体に電気刺激を提供し、心臓組織の収縮行動を制御しやすくします。
Introduction
現代の最先端のソフトロボットは、クラゲ1、2、刺す光線2、タコ3、バクテリア4、精子5など、多くの生物の階層構造と筋肉ダイナミクスを模倣することができます。自然システムのダイナミクスとアーキテクチャを模倣すると、エネルギッシュで構造的な効率の両方の面でより高いパフォーマンスを提供しています6.これは、自然組織の柔らかい性質(例えば、104-109 Paの間のヤング率を有する皮膚または筋肉組織)に本質的に関連しており、標準的な設計アクチュエータと比較して、より高い自由度と優れた変形および適応性を可能にする(例えば、ヤングの係数は通常109-1012 Pa)の間である。心筋ベースのソフトアクチュエータは、特に、機械的にベースのロボットシステム7と比較して、自己作動による優れたエネルギー効率とオートリペアおよび再生の可能性を示す。しかし、ソフトロボットの製造は、異なるコンポーネントを異なる物理的、生物学的、機械的特性を持つ1つのシステムに統合する必要性のために困難です。例えば、人工合成システムは、構造サポートを提供するだけでなく、その作動行動に影響を与え、調節するだけでなく、生きている生物学的システムと統合する必要があります。さらに、多くの微細加工方法では、過酷/細胞毒性プロセスと、生きている成分の生存率と機能を低下させる化学物質が必要です。そのため、ソフトロボットの機能を強化し、その動作を制御し、調節するために、新しいアプローチが必要です。
良好な生存率で生きている部品をうまく統合するために、ヒドロゲルベースの足場は柔らかいロボットのボディを作成する優秀な材料である。ヒドロゲルの物理的および機械的特性は、筋肉組織8、9などの生体成分の微小環境を作り出すために容易に調整することができる。また、様々な微細加工技術を容易に採用でき、高忠実度1,2,10の階層構造を作成します。柔軟な電子機器をソフトロボットに組み込み、電気刺激で動作を制御できます。例えば、光依存性電気生理学的活性化を示す電気起源細胞(例えば心筋細胞)を設計する光遺伝学的技術は、ビトロ2で魚の起尿運動を再現することができた光によって導かれたポリジメチルシロキサン(PDMS)ベースのソフトロボット刺線を開発するために使用されている。光遺伝学的技術は優れた制御性を示しているが、提示された研究は、従来の従来のシミュレーション方法である電気刺激を使用する。これは、柔軟な微小電極を介した電気刺激が、光遺伝学的技術に比べて容易かつ簡便であり、広範な開発プロセス11を必要とするからである。柔軟な電子機器の使用は、長期的な刺激と標準/単純な製造プロセスだけでなく、調整可能な生体適合性および物理的および機械的特性12、13を可能にすることができます。
ここでは、バイオインスパイア型ソフトロボットを作製する革新的な方法を提示し、操作された心筋組織の鼓動によって作動し、埋め込まれた柔軟なAu微小電極を介して電気刺激によって制御される。柔らかいロボットは刺す光線の筋肉そして軟骨の構造を模倣するように設計されている。刺線は、他の水泳種と比較して構造と動きを模倣しやすい生物です。筋肉は、導電性ヒドロゲルマイクロパターン上に心筋細胞を播種することによって、インビトロで再現される。既に報告したように、CNTなどの導電性ナノ粒子をGelMAヒドロゲルに組み込むことは、心臓組織の電気的結合性を向上させるだけでなく、優れたインビトロ組織構造および配置8、9を誘導する。軟骨接合部は、システム全体の機械的に堅牢な基板として機能する機械的に堅牢なPEGDAヒドロゲルパターンを使用して模倣されます。サーペンチンパターンを有する柔軟なAu微小電極は、心臓組織を局所的および電気的に刺激するためにPEGDAパターンに埋め込まれる。
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Protocol
この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に厳密に従って行われました。この議定書は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院の動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. ゲルマ合成
- 50°Cの磁気攪拌機を用いて、100 mLのDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)にゼラチン10gを溶かします。
- ゼラチンプレポリマー溶液を50°Cで2時間攪拌しながら、8mLのメタクリル無水物をゆっくりと加え、反応したゼラチン溶液を予熱したDPBSで50°Cで希釈します。
- 希釈した溶液を透析膜(分子量カットオフ = 12~14 kDa)に移し、脱イオン(DI)水に入れます。40°Cで透析を1週間程度行います。
- 滅菌フィルター(細孔サイズ= 0.22 μm)を使用して透析ゲルマプレポリマー溶液をろ過し、溶液の25または30 mLを50 mLチューブに移し、-80°Cで2日間保存します。
- 凍結乾燥したGelMAプレポリマー溶液を凍結乾燥乾燥し、5日間凍結乾燥した。
2. ポリ(エチレングリコール)ジアクリレート(PEGDA)プレポリマー溶液の調製
- PegDA の 200 mg (MW = 1,000) を 2-ヒドロキシ-4-(2-ヒドロキシエトキシ) -2-メチルプロピオフェノン (写真イニシエーター、PI) の 5 mg (MW = 1,000) を DPBS の 1 mL に溶解します。
- プレポリマー溶液を80°Cで5分間インキュベートする。
ゲルマコーティングCNT分散ストック溶液の3.
- DPBSの4 mLに80mgのGelMA(バイオサーファクタントとして使用)を溶解し、20mgのCOOH官能化された多壁カーボンナノチューブ(MWCNT)をGelMAプレポリマー溶液に加えます。
- MWCNT を含んだ GelMA プレポリマー溶液を 1 時間 (0.66Hz、100 ワット) で超音波処理します。
注:超音波処理プロセス中、溶液は温度の上昇による溶媒の蒸発を防ぐために〜15°Cの水浴に浸す必要があります。
4. 5%ゲルマプレポリマー溶液を含有する1mg/mL CNTの調製
- 80°Cで0.8 mLのDPBSで10分間、50mgのGelMAと5mg(総溶液の0.5%)を溶解します。
- 準備したCNTストック溶液の0.2mLを加えます(ステップ3)。80°Cで10分間溶液をインキュベートした。
5.3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート(TMSPMA)コーティングされたガラススライドの調製
- 純粋なエタノールでガラスのスライド(厚さ= 1ミリメートル、サイズ= 5.08 cm x 7.62 cm)を洗浄します。
- クリーニングされたスライドを250 mLビーカーに垂直に積み重ね、シリンジを使用してTMSPMAの3 mLをその上に広げます。TMSPMAの蒸発を防ぐために、ビーカーをアルミホイルで覆います。
- スライドを80°Cのオーブンで1日間インキュベートします。
- コーティングされたガラススライドを純粋なエタノールに浸して洗い、乾燥させます。
- アルミ箔で包まれたコーティングされたガラススライドを室温(RT)に保存します。
メモ:TMSPMAでコーティングされたガラススライドの表面に触れるのを最小限に抑えるようにしてください。
6. 柔軟なAu微小電極の製造
- コンピュータ支援設計 (補足ファイル 3)を使用して、シャドウ マスクをデザインします。
- シャドーマスクを製作し、購入する。
- ガラススライド(厚さ= 1 mm、サイズ = 3 cm x 4 cm)をアセトンで洗浄し、圧縮空気銃で乾燥させます。
- 両面テープを使用してガラス基板にシャドーマスクを取り付け、Eビームエバポレーターに入れ、チャンバー圧力が少なくとも10-6トルに達するまで待ちます。
注:2つのテープは、ガラスをホストするのに十分な距離とパターン全体に収まるほどの大きさで、サポートに手動で配置されました。このステップは45〜60分かかります。 - Eビームエバポレーターで200nmの厚いAu層を堆積させる(例えば、デントンEE-4、真空=10-6トール、電力=2.6%、レート=2Å/s)、ダイシングソーマシンを使用して製造された微小電極を切断する(電極サイズ= 7.38 mm x 8.9mm x 200nm)。
7. Au微小電極組み込み型微小パターン化多層ヒドロゲル足場の製造
注:この手順の結果は、マイクロパターン化されたPEGDAヒドロゲルが底層にあり、マイクロパターン化されたCNT-GelMAヒドロゲルが上にあり、Au微小電極が2つの層の間にある膜です。この構成は電極へのよりよい柔軟性を保障し、壊れる危険を制限する。
- 2つのフォトマスクを設計し、作成して、マイクロパターン化されたPEGDA(1番目のフォトマスク)とCNT-GelMAヒドロゲル(第2フォトマスク)層を作成します。「補足ファイル 2–3」を参照してください。CADソフトウェアを使用して設計を行うことができます。
メモ:図 2B、 Eを参照してください。 - TMSPMAコーティングガラスに、市販の目に見えないテープ(厚み:50μm)を1層積み重ねて作られた50μmのスペーサーを置きます。TMSPMAコーティングガラスの上に20%PEGDAプレポリマー溶液を15μL注ぎ、金の微小電極で覆います。ガラススライド用の第1のフォトマスク(マイクロパターンPEGDA)を金のマイクロ電極の上に置き、110sの強度800 mW、8 cmの距離でUV光(320~390 nmフィルタの200W水銀蒸気短いアークランプ)に全体の構成物を露出させます。
メモ:図 1Aを参照してください。 - DPBSを追加してガラススライドを囲み、マイクロパターン化されたPEGDAヒドロゲルを5〜10分後にコーティングされていないガラス基板からAuマイクロ電極と一緒に取り外し、マイクロパターン化されたPEGDAヒドロゲルをAuで持つガラススライドを得るために慎重に電極。
メモ:図 1Bを参照してください。TMSPMAコーティングにより、コンストラクトはコーティングされていないガラス基板からTMSPMAコーティングされた基板に移されます。このステップで Au マイクロ電極が簡単に切断されるため、慎重に取り外します (図 3)。 - ペトリ皿の底に、市販の透明テープ(厚さ=50μm)を2層積み重ねて作った100μmのスペーサーを置きます。スペーサー間に20 μL CNT-GelMAプレポリマー溶液を塗布し、7.3で得られたガラススライドを反転させ、粘着テープで皿に固定します。
- デバイスを上下逆に回転させ、2つめのフォトマスクをスライドの上に置きます。200 sの強度の800 mWおよび8 cmの間隔の紫外線の下で露出する。
メモ:図 1Cを参照してください。2番目のマスクのアライメントが重要です。 - 得られた足場をDPBSと10%ウシ胎児血清(FBS)を含む細胞培養培地で洗浄する。
- 細胞を播種する前に37°Cのインキュベーターに一晩放置してください。
8. 新生児ラット心筋細胞の分離と培養
- 動物ケアに関する研究所の委員会によって承認されたプロトコルに従って、2日齢のスプレイグ・ドーリーラットから心臓を分離する8.
- 冷たい部屋でHBSSでEDTAなしで0.05%トリプシンで一晩(約16時間)シェーカーに心臓片を置きます。
- ピペットガンで心臓片を集め、トリプシンの量を最小限に抑え、10 mLの温かい心臓媒体(10%FBS、1%P/S、1%L-グルタミン)を50mLチューブに入れます。
- 37 °Cの水浴中でゆっくりと旋回(~60rpm)7分間、10mLピペットでチューブから慎重にメディアを取り出し、心臓の破片をチューブに残します。
- HBSSに0.1%コラゲナーゼタイプ2の7 mLを加え、37°Cの水浴で10分間旋回します。
- 10 mLピペット10倍と軽く混ぜ、心臓の破片を混乱させる。1 mLピペットでチューブからメディアを取り出します。
- HBSSに0.1%コラゲアーゼタイプ2の10mLを加え、37°Cの水浴で10分間素早く旋回し(約120~180rpm)、心臓片が溶解しているかどうかを確認します。
- 10 mLピペットと混ぜ、1 mLピペットで繰り返して最後の心臓片を壊します。
- 溶液が均一に見えたら、新しい50 mLチューブに70μmの細胞ストレーナーを置き、ストレーナーに一度に溶液1 mLをピペットします。
- 37°Cで5分間180 x gで心臓細胞溶液を遠心分離する。
注: まだいくつかの心臓の部分や粘液が溶解しなかった場合は、手順 8.7~8.9 を再度繰り返します。 - 慎重に細胞ペレットの上のすべての液体を除去し、心臓媒体の2 mLで細胞を再懸濁.
- 慎重に細胞を再懸濁し、それらを壊さないようにチューブ壁から心臓媒体の2 mLを追加します。
- 中断した細胞をT175フラスコに加え、温かい心臓培地を一滴ずつドロップします。フラスコを37°Cのインキュベーターに1時間入れて、心臓線維芽細胞を底部に付着させる。
注:この前めっきステップでは、心臓線維芽細胞はフラスコに付着し、心筋細胞は懸濁液中に残ります。 - 心筋細胞を含むフラスコから培地を収集し、50 mLチューブに入れます。
- 細胞を数え、37°Cで5分間260 x gで遠心分離する。
- ステップ7で作製したソフトロボットの上に細胞を再サスペンドし、播種する。心筋細胞の特定の体積を1.95×106細胞/mLの濃度で装置の全面に滴下する。
- 37°Cでサンプルをインキュベートし、播種後1日目と2日目に2%FBSおよび1%L-グルタミンを用いて5mL細胞培養培地で培地を変更した。メディアの色が変わるたびにメディアを変更します。
9. アライメント解析のための細胞染色
- メディアを取り出し、RTで5分間DPBSで洗います。
- RTで20分間4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して細胞を固定します。その後、RTで5分間DPBSで洗浄します。
- DPBSで0.1%トリトンの細胞を1時間RTで1時間洗浄し、PBSで3倍の洗浄を行い、RTで5分間インキュベートします。
- DPBSで1時間のRTで10%ヤギ血清を有する細胞をインキュベートする。
- DPBSの10%ヤギ血清中の10%ヤギ血清中の一次抗体(肉腫α-アクチニンおよびコネキシン-43)を用いて細胞を4°C〜14〜16時間インキュベートする。
- RTでDPBSで3倍を5分間洗浄し、DPBSの10%ヤギ血清中の二次抗体を1時間1時間培養します。
- RTでDPBSで3倍を5分間洗浄し、次にDI水中4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を含むカウンターステイン細胞(1:1,000)をRTで10分間洗浄し、DPBSでDPBSを5分間洗浄します。
- 逆レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて蛍光画像を撮影します。
10. アクチュエータのテストと行動評価
- ソフトロボット上の心筋細胞の自然拍動
- 37 °Cで5日間のバイオインスピレーションアクチュエータをインキュベートし、1日目と2日目に必要な場合(メディアが黄色に変わったら)メディアをリフレッシュします。反転光学顕微鏡を使用して、毎日(5xおよび/または10x)画像を撮影します。収縮活動が始まると(一般的に3日目頃)、30秒/秒(5xおよび/または10x)で30秒の顕微鏡のライブウィンドウでビデオキャプチャソフトウェアを使用して細胞の動きを記録します。
- 5日目に、カバースライドでエッジから静かに持ち上げて膜を取り外します。
注:細胞が強い鼓動を示す場合、膜は収縮の機械的作用のために、膜自体によって剥離します。
- バルク電気信号刺激
- ホルダーとして3cm間隔のPDMSを使用して、心臓媒体を充填した6cmペトリ皿に2つのカーボンロッド電極を白金(Pt)ワイヤーで貼付します。その後、慎重にペトリ皿にソフトロボットを転送します。
- 50 msのパルス幅、DCオフセット値0V、ピーク電圧振幅0.5~6Vの平方波形を適用します。周波数は0.5、1.0、2.0 Hzの間で変動し、デューティサイクルはそれぞれ2.5%、5%、10%の間です。市販カメラを使用してマクロスケールの収縮を記録します。
- Au微小電極による電気刺激
- Au微小電極積層多層ヒドロゲル足場の製造後、2つの銅線を、銀ペーストを用いた外部の正方形のポートを用いてAu電極に取り付けます。
- 銀ペーストを80°Cで5分間前治したPDMSの薄い層で覆います。その後、PDMSを完全に架橋するために、サンプルを45°Cのホットプレートに5時間置いた。
- 心筋細胞をシーディングした後、DC オフセット値 1 V、ピーク電圧振幅 1.5 ~ 5 V、周波数 0.5、1.0、および 2.0 Hz の周波数を持つ銅線に、方形波の電気刺激を適用します。
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Representative Results
Au微小電極組込バイオインスパイアソフトロボットの開発ステップのフロー図
ソフトロボットの設計の目的は、最小限の複雑さで泳ぐ動きを作動させることができる膜を構築することであった。構造は、時間の経過とともに繰り返し強い屈曲を維持することができなければならない (約 1 Hz) 強い鼓動を達成しながら、その形状を維持することができる.フォトマスクを用いてポリマーを選択的に光架橋することにより、マイクロパターン化PEGDAヒドロゲル層、柔軟なAu微小電極層、およびマイクロパターン化CNT-GelMAヒドロゲル層からなる階層構造の足場を作製しました。プロトコルに記載されているソフトロボットの製造手順の概略図と実際の画像を図1に示す。簡単に言うと、埋め込まれたAu微小電極を有するバイオインスパイアソフトロボットの3つの主要な製造ステップがあった:まず、組み込まれたAu微小電極を有する微小パターン化PEGDAヒドロゲルを、第1フォトマスクを用いたUV架橋法により得られた(図1A、B)。第2に、Au微小電極から構成される多層構造体、マイクロパターン化CNT-GelMA、およびPEGDAヒドロゲルを、第2フォトマスクを用いてUV架橋で製造した(図1C)。最後に、心筋細胞を、ソフトロボットに作動させるために作製された3層構造上に種をまいた(図1D)。
ソフトロボットの異なるデザイン
ソフトロボットの形状については、最初は2つの異なる水生動物のパターンをバイオミミシンすることによって2つのバイオインスピレーション形状を設計しました。最初のデザインは、ヒトデを2次元(2D)オブジェクトに単純化し、硬い骨格を持ち、水の中を移動するために結合する柔軟な部分を持ち、必要な動きを最小限に抑えるため、キャライビックヒトデ(図2A、B、C)の外観に触発されました。2番目の装置は、2D装置で再現しやすいマンタ(図2D、E、F)の形状に基づいていました。マンタは独特の動きを使って素早く泳ぐことができます。基本的な幾何学的形状を使用してマンタをスケッチし、フォトマスクのステップ中に架橋する複雑さを低減しました。電極は、構造の正線に沿って配置され、波状パターンで設計され、電気パルスと柔軟性のより良い広がりを可能にしました(図2D)。バイオインスパイア型ソフトロボットを開発するために、マンタにインスパイアされた形状を選択し、この研究で徹底的にテストしました。
CNT-GelMAとPEGDAヒドロゲルの間にAu微小電極を埋め込む挑戦
製造されたロボット本体の厚さ200nmのAu微小電極のカプセル化は、電気刺激を提供することによって構造を局所的に制御することができた。電極表面上の直接のCNT-GelMAとPEGDAヒドロゲルパターンのUV架橋は電極の剥離を妨げたが、電極をソフトロボットに取り込むことに成功した。しかし、PEGDAヒドロゲル上でAu電極を転写した後、PEGDAヒドロゲルの膨潤により、製造過程で形状と幅(>1mm)のAu電極が壊れやすい(図3A、B、C)。したがって、微小電極が正常にPEGDAヒドロゲルに移され、CNT-GelMAとPEGDAヒドロゲルの間に埋め込まれたが、そのままであることを確認する必要がありました。従って、蛇行パターン(厚さ=200μm)のAu微小電極をソフトリソグラフィで設計し、製作した。異なる倍率および段階を有する位相比顕微鏡写真を撮影し、マイクロパターン化されたPEGDAヒドロゲル上の輸送後の電極上の破壊の徴候を検査するために撮影された(図3D、E、F)。
ハイドロゲルマイクロパターン間の間隔の最適化
心筋細胞播種CNT-GelMA層は、パターン距離に応じて異なる拍動挙動を示した(図4A、B)。これは、線の距離に応じて細胞が膜の表面に付着するさまざまな方法に起因する可能性があります。50 μmの距離の場合、細胞はパックされすぎて、所望の組織構成を持っていませんでした。部分的に相互接続され、翼上に整列していない細胞は、すべて同時に水泳の動きに寄与していなかった。したがって、心筋細胞によって発生する力は、翼を曲げるには十分ではありませんでした。150μmの距離で、細胞は非常によく整列した。しかし、彼らは主に溝に座り、上層の細胞間の相互接続がほとんどなく、弱い鼓動を生じた。75μmの距離で、細胞を底部に整列させ、上部に相互接続し、最も強い鼓動を示した。また、心筋細胞の動的拍動時にソフトロボットの不可逆的な完全な転動を防止するため、PEGDAヒドロゲル支持層のパターン間隔を300μmに最適化した(図4C)。最後に、このパラメータ化プロセスに従って、300 μm距離 PEGDA パターンと 75 μm 距離 CNT-GelMA パターンを持つマンタ型膜に焦点を当てることにしました。マイクロパターン化されたPEGDA-およびCNT-GelMAパターン上の心臓組織も、位相/対照画像およびF-アクチン/DAPI共焦点画像によって示された(図4B)。
マイクロパターン化PEGDA-およびCNT-ゲルマヒドロゲル上の心臓組織の動きの分析
アクチュエータの動きを解析するために、カーボンロッド電極を用いて電界を印加しながら、Au微小電極を使わない膜の映像を撮影しました。図4Dは、収縮記録から取られたいくつかのフレームを示しています。マンタの形をしたアクチュエータが翼を期待通り曲げていたことがはっきりと見えた。尾は少しまっすぐにして構造のバランスをとっていて、翼は真ん中で強く閉じ込められていた。一部の膜は、微小パターン化されたCNT-GelMAおよびPEGDAヒドロゲルの不整列による収縮中の回転運動を示した(図4Eおよびビデオ1)。この場合、動きは前の動きに比べてあまり定義されていませんでしたが、収縮はまだ回転運動の作動を可能にするのに十分強かった。円全体を完成するための合計時間は約45sでした。
多層型軟質ロボット上の心筋細胞の特徴付けと電気刺激による打ち上げ挙動の制御
バイオインスパイア型ロボットシステム上の心筋細胞の播種と成熟(図5A)の後、F-Actin/DAPIとサクロメリック/コネキシン43/DAPI免疫染色の両方によってCNT-GelMAパターンの方向に沿った心臓組織の整列(図5B-E)が観察された。共焦点蛍光画像は、CNT-GelMAヒドロゲルパターン上に良好に伸長し、整列した心筋細胞を示した(図5B、C)。パターン領域上で部分的な一軸サルコメアアライメントと相互接続されたサルコメア構造が観察された(図5D)。微小電極の真上に位置する心臓組織の相互接続されたサルコメア構造も観察された(図5E)。バイオインスパイアソフトロボットを評価するために、我々は2つの方法を使用してその機能を検出しました:まず、我々は人工的なチューニングと打ちの行動を制御するためにカーボンロッド電極を使用して、ソフトロボットに二分電気パルスを適用しました。次に、2本の銅線をAu電極の最も外側の端に接続し、ロボット構築全体を通して電気信号を生成しました。Au電極に接続された外部カーボン電極または銅線を介して電気刺激を行った場合、励起閾値電圧は周波数によって異なっていました(0.5、1.0、2.0 Hz、図5F)。
図1:バイオインスパイアされた多層型ソフトロボットの製造過程を描写した概略図と実際の画像は、柔軟なAu微小電極の統合を介して電気的に電気的に制御される。(A)1番目のフォトマスクを用いたPEGDAヒドロゲルのパターン化と架橋。(B) ステップ後に得られた TMSPMA ガラス上にカプセル化された Au 微小電極を用いたマイクロパターン化 PEGDA ヒドロゲル (A).(C)第2フォトマスクを用いたCNT-GelMAパターンヒドロゲルの架橋。(D) 多層構造上の心筋細胞の播種。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:バイオインスピレーションソフトロボットの設計(A)実在ヒトデの絵と、コンポーネントとストライプを指摘する3次元(3D)CADモデルの異なるビュー。(B) ヒトデ形状のCNT-GelMAパターン、PEGDAパターン、およびAu微小電極のマスク設計。(C)ヒトデ形状の微細パターンCNT-GelMAおよびPEGDAパターンの光学顕微鏡像。(D) コンポーネントを指摘する3D CADモデルの実マンタの写真と異なるビュー。(E) CNT-GelMAパターン用マスク設計、PEGDAパターン、およびマンタ線形状のAu微小電極は、Su Ryonらの許可を得て10.(F) マンタ線形状の微細パターンCNT-GelMAおよびPEGDAパターンの光学顕微鏡像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:柔軟なAu微小電極の設計(A) 長方形と幅の広い形状を有するAu電極の製作写真。(BおよびC) PEGDAヒドロゲルへの転写に失敗したAu電極の光学顕微鏡像。(D) マイクロパターン化されたPEGDAヒドロゲル上に転送される前後の波状Au微小電極(EおよびF)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マイクロパターン化されたPEGDAおよびCNT-GelMAヒドロゲルの最適化とソフトロボットの移動解析(A) 50、75、および 150 μm 間隔の CNT-GelMA ヒドロゲル パターン上の心筋細胞の光学画像。(B) 300 μmと75 μmの間隔をそれぞれ有するPEGDA-およびCNT-GelMAヒドロゲルパターン上の心筋細胞の光学画像およびF-アクチン/DAPI染色。(C) 300 μm間隔のマイクロパターン化された PEGDA ヒドロゲルの有無に関するバイオインスピレーションコンストラクトのローリング形態。(D) 電気刺激を施しながら記録した自立型バイオインスパイアソフトロボット映像のフレーム。(E) ソフトロボットの回転運動を記録したビデオから撮影した4つの異なるフレームのコラージュ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:Au微小電極組込ソフトロボット上の心筋細胞の特徴付けと電気刺激による打ち上げ挙動の制御(A) PEGDAとCNT-GelMAヒドロゲルの間に封入されたAu微小電極上の培養された心筋細胞の光学顕微鏡像。(B) CNT-GelMA ヒドロゲルマイクロパターン上の良好に細長く、整列した心筋細胞を示す F-アクチン/DAPI 蛍光画像。(C-E)作製されたソフトロボット上のサルコメアアライメントと相互接続されたサルコメア構造を示す共焦点蛍光画像:CNT-GelMAヒドロゲルマイクロパターン上のCおよびD培養心筋細胞、および(E)Au微小電極の近く。(F) カーボンロッド電極および組込み型Auマイクロ電極を介して電気刺激を行う場合、異なる周波数(0.5、1.0、2.0Hz)で必要な励起閾値電圧。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法を用いて、組み込まれたAuマイクロ電極によって制御される多層構造の足場に統合された自己作動性心臓組織を備えたバチドフィッシュのようなバイオインスピレーションソフトロボットの製造に成功しました。PEGDAおよびCNT-GelMAヒドロゲルで作られた2つの異なるマイクロパターン化ヒドロゲル層により、バイオインスパイア足場は良好な機械的安定性と理想的な細胞の整列と成熟を示した。刺す光線の骨格の建築の軟骨の接合として機能するPEGDAパターン層は、ロボット本体全体に機械的なサポートを提供します。具体的には、心臓組織の収縮および弛緩時の機械的安定性を維持し、収縮後の膜張力を解放する能力による効率的な叩きが可能である。さらに、微小電極(200nm)のナノメートルの厚さ、ならびにそれらの蛇行パターンは、心臓組織の収縮を妨げたり影響を及ぼしたりしないほど柔軟にすることを可能にした(図2)。ヒドロゲル表面に破損のない微小電極を容易に伝達するために、Au微小電極は、ガラスとAuの間に強い接着を作り出すために一般的に使用されるチタンのような接着層なしでガラス上に製造された。一方、心筋細胞の付着およびアライメントをサポートするCNT-GelMA層は、PEGDAヒドロゲルパターンの向きに対して垂直なパターンで作られた(図3)。成熟後、最上層の心筋細胞は、足場全体に自己作動を提供した。組み込まれたAu柔軟な微小電極の局所的な電気刺激を通して、我々はそれに心臓組織を傷つけずにロボットの鼓動頻度を調節することができた。この製造方法は簡単に習得でき、再現できますが、製造プロセスには、まだ技術的に難しい手順がいくつか残っています。
ソフトバイオロボットの製造には5つの重要なステップがあります:1)GelMAヒドロゲル中のCNTの正しい分散;2)TMSPMAコーティングガラス上のPEGDAおよびCNT-GelMAヒドロゲルのUV架橋に成功した。3)支持ガラスからヒドロゲルパターンへのAu微小電極の転写;4)支持ガラスのスライドからのアクチュエータの正しい剥離;5)Au微小電極と波形発生器への接続に使用されるワイヤとの間の良好な電気的接触の作成。
自然のままのGelMA基質と比較して、CNTsの組み込みは、より高い自発的な同期拍動速度および心筋組織9のより低い励起閾値に寄与する強化された機械的特性および高度な電気生理学的機能を有するGelMAヒドロゲルを提供する。CNT細胞毒性の問題は、表面官能化CNTを用いるだけでなく、ゲルマヒドロゲルマトリックス中のナノ構造を5.0mg/mL9の濃度まで組み込むことによっても防止される。実際には、GelMAヒドロゲルの疎水性セグメントとCNTs側壁との相互作用は、ヒドロゲル多孔質マトリックス14中のCNTのカプセル化につながる。これは、潜在的に有毒な凝集体を形成するのを防ぐだけでなく、生理食液(例えば、DPBSまたは細胞培養培地)におけるCNTsの溶解性を高める。
PEGDAとCNT-GelMAヒドロゲルの間にAu微小電極をうまく組み込むには、各単一層のUV架橋に特に注意を払う必要があります。具体的には、PEGDAヒドロゲル層上にAu微小電極を転写するには、剥離工程中の電極の破裂を回避するために、ヒドロゲル溶液が電極面積全体を覆うことを確認する必要がある。したがって、TMSPMAガラスコーティングの品質は、ガラス基板上のPEGDAヒドロゲルの最適な接着を保証するための基本であり、それによってマイクロ電極の転写工程中にその剥離を防止する。
この方法のもう一つの重要なステップは、支持するガラススライドからのバイオアクチュエータの剥離である。この問題は、心臓組織の自発的な拍動が同期しており、ガラススライドから支持ヒドロゲルを自然に剥がすのに十分な強度がある場合に容易に解決できる。このため、前に報告されるように、機能および同期心臓組織の組織に有利な特定の細胞配向を誘導するためにヒドロゲルパターンを最適化することが基本である。
マイクロ電極を波形発生器に電気的に接続するには、マイクロ電極上に電気接続を作成する必要があります。このステップでは、細胞傷害性の影響を避けるために、マイクロ電極を銅線に接触させるために使用される銀の接着剤を完全に封入することが重要です。これは、電気的接触の上にPDMSの薄い滴を堆積させることによって正常に達成される。
この方法は、複雑な製造プロセス、長い製造時間、光遺伝学的ツールの潜在的な毒性などの既存の光遺伝学的技術の限界を克服するだけでなく、細胞ベースの性能を強く向上させることができました。低コストで扱いやすい技術を使用してリアルタイム刺激につながるアクチュエータ。現在のバイオインスパイア型アクチュエータの設計では前方推進力を生み出せませんでしたが、自律型細胞ベースのロボットの分野での成功は多くの関心を集める可能性があります。この方法は、ロボット本体全体に対するワイヤレス給埋パッチの開発にも寄与する可能性があります。この方法は、ヒドロゲルベースの足場に直接柔軟なRF回路を統合するが、ソフトバイオロボットの将来の無線電気刺激への道を開く。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する財政的利益を持っていないと宣言する。
Acknowledgments
この論文は、国立衛生研究所(R01AR074234、R21EB026824、R01 AR073822-01)、ブリガム研究所ステッピング強力なイノベーター賞、およびAHA革新的プロジェクト賞(19IPLOI34660079)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Beaker | PYREX | 1000-250CNEa | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Milipore | M6514 | |
| 37° Water bath | VWR | W6M | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | |
| 80° incubator | VWR | 1370GM | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Anti-Connexin 43/GJAI antibody | Abcam | ab11370 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Sarcomeric α-actinin | Abcam | ab9465 | Mouse monoclonal |
| Benchtop Freeze Dryers | Labconco | 77500-00 K | |
| Biosafety cabinet | Sterilgard | A/B3 | |
| Carbon rod electrodes | SGL Carbon Group | 6971105 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| CO2 incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Collagenase, Type II, Powder | Gibco | 17-101-015 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| COOH Functionalized Carbon Nanotubes | NanoLab | PD30L5-20-COOH | |
| Dicing saw machine | Giorgio Technology | DAD-321 | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11-965-118 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-144 | |
| E-beam evaporator | CHA | 57367 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10-437-028 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B, 300 bloom from porcine skin |
| Glass slide | VWR | 48382-180 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-079 | |
| Inverted optical microscope | Olympus | CK40 | |
| Magnetic hotplate | Corning | PC-420 | |
| methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276695 | Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor |
| Nunc EasYFlask 175cm2 | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| Olicscope | Siglent | SDS1052DL+ | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PDMS SYLGARD 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| Photomask | Mini micro stencil inc | ||
| Platinum wire | Alfa Aesar | AA43014BU | |
| Polyethylene glycol dimethcrylate | Polysciences Inc. | 15178-100 | |
| Regenerated Cellulose Dialysis Tubing | Fisherbrand | 21-152-14 | |
| Silver Epoxy Adhesive | MG Chemicals | 8330S | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | S2GPU02RE | |
| Ultra sonicator | Qsonica | Q500 | |
| UV Curing System | OmniCure | S2000 | |
| Vortex mixer | Scientific Industry | SI-0246A | |
| Waveform generator | Agilent | 33500B | |
| Wrap Aluminium foil | Reynolds | N/A |
References
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