Summary
Биовдохновленный эшафот изготовлен с помощью мягкой фотолитографии с использованием механически надежных и электрически проводящих гидрогелей. Гидрогели микрошаблона обеспечивают направленное выравнивание клеток кардиомиоцитов, что приводит к индивидуальному направлению привода. Гибкие микроэлектроды также интегрированы в эшафот, чтобы принести электрическую управляемость для самоактивации сердечной ткани.
Abstract
Биовдохновленные мягкие роботизированные системы, имитирующие живые организмы с помощью инженерных мышечной ткани и биоматериалов, революционизируют нынешнюю парадигму биороботов, особенно в биомедицинских исследованиях. Воссоздание искусственной динамики активации, подобной жизни, имеет решающее значение для мягкой роботизированной системы. Однако точный контроль и настройка поведения активации по-прежнему представляет собой одну из главных задач современных мягких роботизированных систем. Этот метод описывает недорогие, высокомасштабируемые и простые в использовании процедуры для изготовления электрически управляемого мягкого робота с жизнеобразными движениями, которые активируются и контролируются сокращением сердечной мышечной ткани на микрошаблонированном жале лучоподобный гидрогелев. Использование мягких методов фотолитографии позволяет успешно интегрировать несколько компонентов в мягкую роботизированную систему, в ключая микрошаблонизированные гидрогельные леса с углеродными нанотрубками (CNT) встроенными желатиновым метакрилоломом (CNT-GelMA), поли (этиленгликоль) диакрилат (PEGDA), гибкие золотые (Au) микроэлектроды и сердечная мышечная ткань. В частности, выравнивание гидрогелей и микрошаблон предназначены для имитации структуры мышц и хряща луча жала. Электрически проводящий гидрогель CNT-GelMA действует как клеточная эшафот, которая улучшает созревание и сжатие поведения кардиомиоцитов, в то время как механически надежный гидрогель PEGDA обеспечивает структурную хрящевую поддержку всего мягкого робота. Чтобы преодолеть жесткий и хрупкий характер микроэлектродов на основе металла, мы разработали серпантин шаблон, который имеет высокую гибкость и может избежать препятствуя избиение динамики кардиомиоцитов. Включенные гибкие микроэлектроды Au обеспечивают электрическую стимуляцию через мягкого робота, что облегчает управление поведением сокращения сердечной ткани.
Introduction
Современные современные мягкие роботы могут имитировать иерархические структуры и мышечную динамику многих живых организмов, таких как медузы1,2,жало луч2,осьминог3, бактерии4,и сперма5. Имитация динамики и архитектуры природных систем обеспечивает более высокие показатели как с точки зрения энергетической, так и структурной эффективности6. Это внутренне связано с мягкой природой натуральных тканей (например, кожи или мышечной ткани с модулем молодых между 104109 Па), который позволяет более высокие степени свободы и превосходной деформации и адаптации по сравнению со стандартными инженерии приводов (например, модуля молодых обычно между 1091012 Па)6. Сердечные мышцы на основе мягкой активации, особенно, показывают превосходную энергоэффективность из-за их самоактивации, а также их потенциал для авторемонта и регенерации по сравнению с механически на основе роботизированной системы7. Тем не менее, изготовление мягких роботов является сложной задачей из-за необходимости интеграции различных компонентов с различными физическими, биологическими и механическими свойствами в одну систему. Например, инженерные синтетические системы должны быть интегрированы с живыми биологическими системами, не только обеспечивая их структурной поддержкой, но и влияя на их поведение активации. Кроме того, многие методы микрофабрикации требуют суровых/цитотоксических процессов и химических веществ, которые снижают жизнеспособность и функции любых живых компонентов. Поэтому необходимы новые подходы для повышения функциональности мягких роботов, а также для контроля и модулировать их поведение.
Для успешной интеграции живых компонентов с хорошей жизнеспособностью, гидрогель на основе эшафот является отличным материалом для создания тела мягкого робота. Физические и механические свойства гидрогеля можно легко настроить для создания микросреды для живых компонентов, таких как мышечные ткани8,9. Кроме того, он может легко принять различные методы микрофабрикации, в результате чего создание иерархических структур с высокой точностью1,2,10. Гибкие электронные устройства могут быть включены в мягкого робота для управления его поведением с помощью электрической стимуляции. Например, оптогенетические методы для инженера электрогенных клеток (например, кардиомиоциты), которые показывают светозависимую электрофизиологическую активацию, были использованы для разработки полидиметилсилоксана (PDMS) на основе мягкого роботизированного жгучего луча, управляемого светом, который смог воссоздать неугодное движение рыбы in vitro2. Хотя оптогенетические методы показали отличную управляемость, представленная работа использует электрическую стимуляцию, обычный и традиционный метод моделирования. Это потому, что электрическая стимуляция с помощью гибких микроэлектродов легко и просто по сравнению с оптогенетических методов, которые требуют обширных процессов развития11. Использование гибких электронных устройств может обеспечить долгосрочную стимуляцию и стандартные/простые процессы изготовления, а также настраиваемую биосовместимость и физические и механические свойства12,13.
Здесь мы представляем инновационный метод для изготовления биовдохновленный мягкий робот, приведенный в действие избиение инженерии сердечной мышечной ткани и контролируется электрической стимуляции через встроенные гибкие микроэлектроды Au. Мягкий робот предназначен для имитации структуры мышц и хряща луча жала. Луч жала является организмом с относительно легко имитировать структуру и движение по сравнению с другими видами плавания. Мышцы воссозданы в пробирке путем посева кардиомиоцитов на электрически проводящем гидрогелевом микропатее. Как сообщалось ранее, включение электрически проводящих наночастиц, таких как CNT в гидрогель GelMA не только улучшает электрическое соединение сердечной ткани, но и вызывает отличную архитектуру ткани in vitro и расположение8,9. Затем суставы хряща передисмоно используют механически надежный узор гидрогеля PEGDA, который действует как механически надежный субстрат всей системы. Гибкие микроэлектроды Au с серпантином узором встроены в шаблон PEGDA, чтобы локально и электрически стимулировать сердечную ткань.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, соданными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол был одобрен институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Бригама и женской больницы.
1. Синтез Гелма
- Растворите 10 г желатина в 100 мл фосфатно-буферного сольниковых сотелей Дульбекко (DPBS) с помощью магнитного мешалки при 50 градусах Цельсия.
- Добавить 8 мл метакрилова ангидрида медленно, помешивая желатиновый преполимерный раствор при 50 градусах По Цельсию в течение 2 ч. Разбавить отреагированный желатиновый раствор с разогретым DPBS при 50 градусах Цельсия.
- Перенесите разбавленный раствор в диализные мембраны (молекулярное отсечение веса - 12-14 кДа) и поместите их в деионизированную (DI) воду. Выполните диализ при 40 градусах По Цельсию в течение примерно 1 недели.
- Фильтр диализированного раствора GelMA преполимера с помощью стерильного фильтра (размер пор - 0,22 мкм) и перенесите 25 или 30 мл раствора в трубки 50 мл и храните при -80 градусов по Цельсию в течение 2 дней.
- Заморозить-сухой замороженный раствор преполимера GelMA с помощью замораживания сушилки в течение 5 дней.
2. Приготовление поли (этиленгликоль) диакрилата (PEGDA) преполимерного раствора
- Растворите 200 мг (20% от общего раствора) ПЕГДА (МВт - 1000) с 5 мг (0,5% от общего раствора) 2-гидрокси-4-(2-гидроксиец) -2-метилпропиофенон (фото-инициатор, PI) в 1 мл DPBS.
- Инкубировать преполимерный раствор при 80 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
3. Подготовка раствора CNT с покрытием GelMA
- Растворите 80 мг GelMA (используется в качестве биосурфактанта) в 4 мл DPBS, а затем добавьте 20 мг функционализированных многостенных углеродных нанотрубок (MWCNTs) в преполимерный раствор GelMA.
- Сноватите MWCNT-ладена GelMA преполимерный раствор для 1 ч (0,66 Гц, 100 Вт).
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процесса звукоизоляции раствор должен быть погружен в водяную ванну при температуре 15 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить испарение растворителя из-за повышения температуры.
4. Приготовление 1 мг/мл CNT, содержащего 5% предполимерного раствора GelMA
- Растворите 50 мг GelMA и 5 мг (0,5% от общего раствора) PI в 0,8 мл DPBS при 80 градусах По кв. м в течение 10 мин.
- Добавьте 0,2 мл подготовленного акционерного раствора CNT (шаг 3). Вихрь и инкубировать раствор при 80 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
5. Приготовление 3-(триметоксизил) пропил-метакрилата (TMSPMA) с покрытием стеклянной горки
- Вымойте стеклянные горки (толщина 1 мм, размер 5,08 см х 7,62 см) с чистым этанолом.
- Стек очищенные слайды вертикально в 250 мл стакан и распространение 3 мл TMSPMA на них с помощью шприца. Обложка стакан с алюминиевой фольгой для предотвращения испарения TMSPMA.
- Инкубировать горки в духовке 80 градусов в течение 1 дня.
- Вымойте покрытые стеклянные слайды, окунув их в чистый этанол, а затем высохнуть.
- Храните покрытые стеклянные горки, завернутые в алюминиевую фольгу при комнатной температуре (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь свести к минимуму прикосновение к поверхностям стеклянных горок, покрытых TMSA.
6. Изготовление гибких микроэлектродов АУ
- Дизайн тени маски с помощью компьютерного дизайна(Дополнительный файл 3).
- Изготовить и купить маску теней.
- Вымойте стеклянную горку (толщина 1 мм, размер ю 3 см х 4 см) с ацетоном и высушите сжатой пневмоульной пушкой.
- Прикрепите маску тени к стеклянным субстратам с помощью двусторонней ленты, затем поместите их в e-луч испаритель и ждать, пока давление камеры достигает по крайней мере 10-6 Торр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Два куска ленты были размещены вручную на опору на достаточно коротким расстоянии, чтобы разместить стекло и достаточно большой, чтобы соответствовать всему шаблону. Этот шаг занимает около 45-60 мин. - Депозит 200 нм толщиной Au слой E-лучей испаритель (например, с Denton EE-4, вакуум No 10-6 Торр, мощность ю 2,6%, скорость 2 к /с) и сократить изготовленные микроэлектроды с помощью dicing пилы машины (электроды размером 7,38 мм х 8,9 мм х 200 нм).
7. Изготовление микроэлектродной комплексной микроэлектронной гидрогеля Au
ПРИМЕЧАНИЕ: Результатом этой процедуры является мембрана, где микрошаблонированный гидрогель PEGDA находится в нижнем слое, микрошаблонный гидрогель CNT-GelMA находится на вершине, и микроэлектроды Au находятся между двумя слоями. Эта конфигурация обеспечивает лучшую гибкость электрода и ограничивает риск разрушения.
- Дизайн и изготовление двух фотомасок для создания микрошаблоньированных PEGDA(1-й фотомаска) и CNT-GelMA гидрогель(2-й фотомаски) слоев. Смотрите Дополнительный файл 2-3. Конструкция может быть выполнена с помощью программного обеспечения CAD.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 2B, E. - Поместите 50 мкм прокладки, сделанные путем укладки одного слоя коммерческой невидимой ленты (Толщина: 50 мкм) на TMSPMA покрытием стекла. Налейте 15 зл 20% p3dA преполимерный раствор поверх стекла с покрытием TMSPMA, а затем накройте золотым микроэлектродом. Поместите первую фотомаску для стеклянной горки (микропаттернPEG PEGDA) поверх золотого микроэлектрода и подвергните всю конструкцию ультрафиолетовому свету (200 Вт ртутного пара короткой дуговой лампы с фильтром 320-390 нм) при интенсивности 800 мВт и 8 см расстояния 110 сс.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1A. - Добавить DPBS окружить стеклянный слайд и отделить микрошаблонированный гидрогель PEGDA вместе с микроэлектродами Au из непокрытого стеклянного субстрата тщательно после 5-10 мин, чтобы получить стеклянную горку, которая имеет микрошаблоньированный гидрогель PEGDA с Au микроэлектроды.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1B. Благодаря покрытию TMSPMA конструкция передается из непокрытого стеклянного субстрата в тМС- Отсоедините тщательно, потому что микроэлектроды Au могут легко сломаться во время этого шага(рисунок 3). - Поместите 100 мкм прокладки, сделанные путем укладки двух слоев коммерческой прозрачной ленты (толщина 50 мкм) на дне чашки Петри. Депозит капли 20 Л CNT-GelMA преполимерный раствор между прокладками, а затем переверните стеклянную горку, полученную в 7.3 и зафиксировать его на блюдо с клейкой лентой.
- Поверните устройство вверх дном и поместите2-ю фотомаску поверх стеклянной горки. Выставляй под ультрафиолетовым светом на 800 мВт интенсивности и 8 см на расстоянии 200 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1C. Выравнивание второй маски имеет важное значение. - Вымойте полученные эшафот с DPBS и с клеточной культуры среды, которая включает в себя 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS).
- Оставьте их на ночь в инкубаторе 37 градусов по Цельсию перед посевом клеток.
8. Изоляция и культура неонатального крысиного кардиомиоцита
- Изолировать сердца от 2-дневного Sprague-Dawley крыс следующие протоколы, утвержденные Комитетом Института по уходу за животными8.
- Положите кусочки сердца на шейкер на ночь (около 16 ч) в 0,05% трипсин без EDTA в HBSS в холодной комнате.
- Соберите части сердца с пипеткой пушки и свести к минимуму количество трипсина, а затем положить их в 50 мл трубки с 10 мл теплых сердечных носителей (10% FBS, 1% P / S, 1% L-глутамин).
- Вихрь медленно (60 об/мин) в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 7 мин. Удалите средства массовой информации тщательно из трубки с 10 мл пипетки и оставить части сердца в трубке.
- Добавьте 7 мл из 0,1% коллагеназа типа 2 в HBSS и закружите в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
- Смешайте с 10 мл пипетки 10x осторожно, чтобы нарушить части сердца. Удалите носители из трубки с помощью пипетки 1 мл.
- Добавьте 10 мл коллагеназа типа 2 в HBSS и быстро закружайтесь (120–180 об/мин) в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем проверьте, растворяются ли части сердца.
- Смешайте с 10 мл пипетки, а затем повторить с 1 мл пипетка, чтобы разбить последние части сердца.
- Как только раствор выглядит однородным, поместите 70 мкм ячейки ситечко на новую трубку 50 мл и пипетки раствор 1 мл в то время, на ситечко.
- Центрифуги раствор клеток сердца при 180 х г в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если Есть еще некоторые части сердца или слизи, которые не растворяются, повторите шаги 8,7-8,9 снова. - Тщательно удалите всю жидкость над клеточной гранулой и повторно наденьте клетки в 2 мл сердечных носителей.
- Добавьте 2 мл сердечных носителей от стенки трубки тщательно, чтобы повторно приостановить клетки и избежать их разрушения.
- Добавьте взвешенные клетки в колбу T175 с теплой сердечной каплей.капля за каплей. Положите колбу в инкубатор 37 градусов по Цельсию на 1 ч, чтобы сердечные фибробласты прикрепиться ко дну.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе preplating, сердечные fibroblasts прикрепляют сярторную колбу пока cardiomyocytes останут в средстве подвески. - Соберите носители из колбы, которая содержит кардиомиоциты и положить его в трубку 50 мл.
- Подсчитайте клетки, затем центрифуги на 260 х г в течение 5 мин при 37 градусах По Цельсию.
- Resuspend и семян клетки на вершине изготовлены мягкий робот в шаге 7. Налейте определенный объем сердечных носителей с кардиомиоцитами в концентрации 1,95 и 106 клеток / мл падение за каплей на всю поверхность устройства.
- Инкубировать образцы при 37 градусах Цельсия и изменить средства массовой информации с 5 мл клеточной культуры средств массовой информации с 2% FBS и 1% L-глютамин на первый и второй дней после посева. Изменяйте средства массовой информации каждый раз, когда цвет носителя меняется.
9. Клеточное окрашивание для анализа выравнивания
- Удалите средства массовой информации и мыть с DPBS в течение 5 минут на RT.
- Исправьте клетки с помощью 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин на RT. Затем мыть с DPBS в течение 5 минут на RT.
- Инкубировать клетки с 0,1% тритон в DPBS на RT для 1 ч. Вымойте 3x с PBS в течение 5 мин на RT.
- Инкубировать клетки с 10% козьей сыворотки в DPBS на RT в течение 1 ч.
- Инкубировать клетки с первичным антителом (саркомерик и коннексин-43) в 10% козьей сыворотки в DPBS при 4 кс для 14-16 ч.
- Вымойте 3x с DPBS в течение 5 мин на RT. Инкубировать клетки со вторичным антителом в 10% козьей сыворотки в DPBS на RT в течение 1 ч.
- Вымойте 3x с DPBS в течение 5 минут на RT, затем противопотаные клетки с 4',6-диамидино-2-фенилинол (DAPI) в воде DI (1:1,000) в течение 10 минут на RT. Вымойте 3x с DPBS в течение 5 минут на RT.
- Возьмите флуоресценции изображения с помощью перевернутого лазерного сканирования конфокальный микроскоп.
10. Тестирование и оценка поведения актуаторов
- Спонтанное избиение кардиомиоцитов на мягком роботе
- Инкубировать биовдохновленные приводы при 37 градусах по Цельсию в течение 5 дней и обновлять носители в день 1 и 2 и при необходимости (т.е. когда средства массовой информации желтеют). Используйте перевернутый оптический микроскоп для ежедневного получения изображений (5x and/or 10x). Запись движения клеток с помощью программного обеспечения захвата видео на живом окне микроскопа для 30 с на 20 кадров в секунду (5x и / или 10x), когда сократительная активность начинается (как правило, около дня 3).
- На 5-й день отсоедините мембраны, аккуратно подняв с края крышку горкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки показывают сильное поведение избиения, мембраны будут отделяться сами по себе из-за механического действия сокращений.
- Массовая электрическая стимуляция сигнала
- Используя 3 см расположены PDMS в качестве держателя, прикрепите два электрода углеродного стержня с платиновой (Pt) проволокой в 6-сантиметровом чашке Петри, наполненной сердечными носителями. Затем осторожно перенесите мягкого робота в чашку Петри.
- Нанесите квадратную форму волны с шириной 50 мс, dc смещение значение 0 V, и пиковое напряжение амплитуда между 0,5 и 6 V. Частота варьируется от 0,5, 1,0 и 2,0 Гц с циклом пошлины между 2,5%, 5% и 10%, соответственно. Запись макромасштабных сокращений с помощью коммерчески доступной камеры.
- Электрическая стимуляция с микроэлектродов АУ
- После изготовления АУ микроэлектродов интегрированных многослойных гидрогель эшафот, прикрепить два медных проводов к Электродам Au, хотя внешний квадратный порт с использованием серебряной пасты.
- Обложка серебряной пасты с тонким слоем PDMS предваряется при 80 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Затем положите образцы на горячую тарелку при 45 градусах по Цельсию в течение 5 ч, чтобы полностью перекрестные PDMS.
- После посева кардиомиоцитов нанесите квадратный волновой электрический стимул на медные провода с компенсационным значением DC 1 V, амплитуда пикового напряжения между 1,5 и 5 В и частотами 0,5, 1,0 и 2,0 Гц соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Диаграмма потока шагов для развития Au микроэлектродов-инкорпорированных биовдохновленный мягкий робот
Целью мягкого робота была построение мембраны, способной активировать плавательное движение с минимальной сложностью. Структура должна быть в состоянии поддерживать сильные сгибания неоднократно с течением времени (около 1 Гц) и быть в состоянии сохранить свою форму при достижении сильного избиения. Избирательно сращивая полимер с помощью фотомаски, мы изготовили иерархически структурированную эшафот, состоящую из микроунитарного слоя гидрогеля PEGDA, гибкого слоя микроэлектродов Au и микроузорного слоя гидрогеля CNT-GelMA. Схематическая диаграмма и фактические изображения процедуры изготовления мягкого робота, описанные в протоколе, показаны на рисунке 1. Короче говоря, было три основных этапа изготовления для биовдохновленный мягкий робот со встроенными микроэлектродами Au: Во-первых, микрошаблонированный гидрогель PEGDA с включенными микроэлектродами Au был получен путем перекрестного уфимца с помощью 1-й фотомаски(рисунок 1A, B). Во-вторых, многослойная конструкция, состоящая из микроэлектродов Au, микропаттернированных CNT-GelMA и гидрогелей PEGDA, была изготовлена с помощью УФ-кроссуля с помощью 2-й фотомаски(рисунок 1C). Наконец, кардиомиоциты были посеяны на изготовленной трехслойной конструкции, чтобы обеспечить активацию мягкого робота(рисунок 1D).
Различные конструкции мягкого робота
Что касается формы мягкого робота, то в начале мы разработали две биовдохновленные формы, биомимимикрируя узоры двух разных водных животных. Первый дизайн был вдохновлен появлением караибных морских звезд(рисунок 2A, B, C), потому что морские звезды могут быть упрощены в двумерный (2D) объект, имеет жесткий позвоночник, и имеет гибкую часть, которая объединяется, чтобы двигаться в воде, сводя к минимуму необходимое движение. Второе устройство было основано на форме манта-лучей(рисунок 2D, E, F), который легко воспроизвести в 2D-устройстве. Манта луч может плавать быстро, используя уникальные движения. Мы набросали манта-луч, используя основные геометрические фигуры с уменьшенной сложностью, чтобы быть перекрестными во время шага фотомаски. Электрод, расположенный вдоль средней линии структуры, был разработан с волнистым узором, что позволяет лучше распространять электрические импульсы и гибкость(рисунок 2D). Для разработки биовдохновленный мягкий робот, манта лучей вдохновили форму была выбрана и тщательно протестирована в этом исследовании.
Задача внедрения микроэлектродов АУ между гидрогелями CNT-GelMA и PEGDA
Инкапсуляция 200 нм толщиной Au микроэлектродов в изготовленном корпусе робота может локально контролировать конструкцию, обеспечивая электрическую стимуляцию. Хотя уф-перекрестные соединения как моделей CNT-GelMA, так и PEGDA гидрогеля непосредственно на поверхности электрода препятствовали делеаминации электродов, это гарантировало успешное включение электрода в мягкого робота. Однако, после передачи электрода Au на гидрогели PEGDA, электрод Au с прямоугольной формой и широкой шириной (1 мм) был легко сломан во время процесса изготовления из-за отека гидрогеля PEGDA (Рисунок 3A, B, C). Таким образом, мы должны убедиться, что микроэлектроды были успешно переданы в гидрогель PEGDA и встроенные между CNT-GelMA и PEGDA гидрогелей в то время как нетронутыми. Таким образом, АУ микроэлектроды с серпантином узором (толщина 200 мкм) были разработаны и изготовлены с помощью мягкой литографии. Фазовый контрастный микроскоп изображения с различными увеличениями и этапами были приняты для того, чтобы проверить признаки перелома на электроде после транспортировки на микропаттернированных гидрогелях PEGDA(Рисунок 3D, E, F).
Оптимизация интервалов между микрошаблонами гидрогеля
Кардиомиоцитпосеянный слой CNT-GelMA показал различное избиение поведения в зависимости от расстояния шаблона(Рисунок 4A, B). Это может быть связано с различными способами клетки, прикрепленные к поверхности мембраны в зависимости от расстояний линий. В случае расстояния 50 мкм клетки были слишком упакованы и не имели желаемой организованной конфигурации. Частично взаимосвязанные и не выровненные клетки на крыльях не все одновременно способствовали плаванию движения. Следовательно, силы, генерируемой кардиомиоцитом, было недостаточно, чтобы согнуть крылья. На расстоянии 150 мкм клетки были очень хорошо выровнены. Тем не менее, они в основном сидели в паз и было мало взаимосвязей между клетками в верхних слоях, в результате чего слабые избиения. На расстоянии 75 мкм клетки были выровнены в нижней части и взаимосвязаны в верхней части, показывая сильнейшее избиение. Кроме того, чтобы предотвратить необратимый полный прокат мягкого робота во время динамического избиения кардиомиоцитов, мы оптимизировали интервал между узором слоя поддержки гидрогеля PEGDA до 300 мкм(рисунок 4С). Наконец, после этого процесса параметризации, мы решили сосредоточиться больше на манта лучеобразной мембраны с 300 мкм расстояние PEGDA моделей и 75 мкм расстояние CNT-GelMA моделей. Сердечная ткань на микрошаблонах PEGDA- и CNT-GelMA также была показана фазовые/контрастные изображения и F-актин/DAPI конфокальные изображения(рисунок 4B).
Анализ движения сердечной ткани на микроунистированных гидрогелях PEGDA- и CNT-GelMA
Для анализа движения привода мы сняли на видео мембрану без микроэлектродов АУ при применении электрического поля с помощью электрода углеродного стержня. На рисунке 4D показаны некоторые кадры, взятые из записей о сокращении. Было ясно видно, что манта лучеобразной формы сгибателя изгиб крылья, как ожидалось. Хвост балансировал структуру, выпрямляясь немного, и крылья сильно закрывались посередине. Некоторые из мембран показали вращающееся движение при контракте из-за неправильного микрошаблона CNT-GelMA и PEGDA гидрогели(Рисунок 4E и видео 1). В этом случае движение было менее определенным по сравнению с предыдущим, но сжатие было еще достаточно сильным, чтобы позволить активации вращающегося движения. Общее время завершения всего круга составило около 45 с.
Характеристика кардиомиоцитов на многослойном мягком роботе и контроль избиения поведением с помощью электрической стимуляции
После посева и созревания кардиомиоцитов на биовдохновленной роботизированной системе(рисунок 5А),выравнивание сердечной ткани по направлению моделей CNT-GelMA наблюдалось(Рисунок 5B-E) как F-актин/DAPI, так и сакромерика/коннексина-43/DAPI иммуностоина. Конфокальные флуоресценции изображения показали хорошо вытягиванные и выровненные кардиомиоциты на CNT-GelMA гидрогель шаблон(Рисунок 5B, C). Частичное выравнивание одноаксового саркомера и взаимосвязанную структуру саркомера наблюдалось на узорчатых участках(рисунок 5D). Также наблюдались хорошо взаимосвязанные саркомереные структуры сердечных тканей, расположенных непосредственно над микроэлектродами(рисунок 5E). Чтобы оценить биовдохновленный мягкий робот, мы обнаружили его функцию с помощью двух методов: Во-первых, мы применили бифазный электрический импульс для мягкого робота, хотя углеродные электроды стержня для искусственного настройки и контроля избиения поведения. Во-вторых, мы соединили два медных провода с внешним концом электрода Au для генерации электрического сигнала через всю конструкцию робота. Когда мы применили электрическую стимуляцию через внешний углеродный электрод или медную проволоку, подключенную к электроду Au, напряжение порога возбуждения было различным на разных частотах (0,5, 1,0 и 2,0 Гц, Рисунок 5F).
Рисунок 1: Схематическая диаграмма и фактические изображения, изображающие процесс изготовления биовдохновленного многослойного мягкого робота, электрически управляемого электрическим сигналом через интеграцию гибких микроэлектродов Au. (A) Узорикинг и перекрестные ссылки гидрогеля PEGDA с помощью1-й фотомаски. (B) Микропаттернированный гидрогель PEGDA с инкапсулированными микроэлектродами Au на стекле TMSPMA, полученном после шага(A). (C) Перекрестное соединение узорчатого гидрогеля CNT-GelMA с помощью2-й фотомаски. (D) Посев кардиомиоцитов на многослойной конструкции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Дизайн биовдохновленных мягких роботов. (A) Реальная картина морских звезд и различные виды трехмерной (3D) CAD модели указывая на компоненты и полосы. (B) Маска дизайн для CNT-GelMA шаблон, PEGDA шаблон, и Au микроэлектродов для формы морских звезд. (C) Оптический микроскоп изображение микропаттернированных моделей CNT-GelMA и PEGDA для формы морских звезд. (D) Реальный манта лучей изображения и различные виды 3D CAD модели указывая на компоненты. (E) Маска дизайн для CNT-GelMA шаблон, PEGDA шаблон, и Au микроэлектродов для формы манта лучей, адаптированы с разрешения Су-Рион и др.10. (F) Оптический микроскоп изображение микропатнезорных моделей CNT-GelMA и PEGDA для формы манта-лучей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Дизайн гибких микроэлектродов АУ. (A) Фотография изготовленных электродов Au с прямоугольными формами и широкой шириной. (B и C) Оптический микроскоп изображения Au электродов, которые не смогли передать в гэгель PEGDA. (D) Wavy Au микроэлектродов до и после (E и F) передается на микрошаблоне PEGDA гидрогеля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Оптимизация микрошаблонов PEGDA и CNT-GelMA гидрогелей и анализ движения мягких роботов. (A) Оптические изображения кардиомиоцитов на узоргидрогеля CNT-GelMA с интервалом 50, 75 и 150 мкм. (B) Оптические изображения и F-актин / DAPI окрашивание кардиомиоцитов на PEGDA- и CNT-GelMA гидрогель моделей с 300 мкм и 75 мкм интервал, соответственно. (C) Подвижное морфологии биовдохновленных конструкций с и без микрошаблона гидрогеля PEGDA с интервалом 300 мкм. (D) Кадры автономных биовдохновленный мягкий робот видео, записанное при применении электрического стимула. (E) Коллаж из четырех различных кадров, взятых из видеозаписи вращающегося движения мягкого робота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Характеристика кардиомиоцитов на АУ микроэлектродов включены мягкий робот и контроль избиения поведение электрической стимуляции. (A) Оптический микроскоп изображение культивируемых кардиомиоцитов на микроэлектродов АУ инкапсулированных между PEGDA и CNT-GelMA гидрогели. (B) F-актин / DAPI флуоресценции изображение, показывающее хорошо выдержанные и выровнены кардиомиоцитов на CNT-GelMA гидрогель микропаттерн. (C-E) Конфокальные флуоресценции изображения, показывающие саркомер выравнивания и взаимосвязанных структур саркомера на изготовленном мягком роботе: (C и D) культивированные кардиомиоциты на CNT-GelMA гидрогель микрошаблон, и (E) вблизи Au микроэлектродов. (F) Требуемое возбуждение пороговое напряжение на разных частотах (0,5, 1,0 и 2,0 Гц) при применении электрической стимуляции с помощью электрода углеродного стержня и встроенных микроэлектродов Au. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный файл 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный файл 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя этот метод, мы смогли успешно изготовить батоидный рыбоподобный биовдохновленный мягкий робот с интегрированной самоактивирующейся сердечной тканью на многослойной структурированной эшафоте, которая контролируется встроенными микроэлектродами Au. Благодаря двум различным микроунитарным слоям гидрогеля, изготовленным из гидрогелей PEGDA и CNT-GelMA, биовдохновленный эшафот показал хорошую механическую стабильность и идеальное выравнивание и созревание клеток. Слой шаблона PEGDA, который служит хрящевым соединением скелетной архитектуры в жгучем луче, обеспечивает механическую поддержку всего тела робота. В частности, он поддерживал механическую стабильность во время сокращения и релаксации сердечной ткани, обеспечивая при этом эффективное избиение из-за его способности освободить мембранное напряжение после сокращения. Кроме того, нанометрическая толщина микроэлектродов (200 нм), а также их серпантинный узор позволили им быть достаточно гибкими, чтобы не препятствовать или влиять на сокращение сердечной ткани(рисунок 2). Чтобы легко передавать микроэлектроды на поверхность гидрогеля без каких-либо полований, микроэлектроды Au были изготовлены на стекле без каких-либо стекол, таких как титан, который обычно используется для создания сильной стыковки между стеклом и Au. Между тем, слой CNT-GelMA, который обеспечивает поддержку для присоединения кардиомиоцитов и выравнивания, был сделан с шаблонами перпендикулярно к ориентации шаблона гидрогеля PEGDA (Рисунок 3). После созревания кардиомиоциты на верхнем слое обеспечивают самоактивацию всего эшафота. С помощью местной электрической стимуляции объединенных Au гибких микроэлектродов, мы могли бы модулировать частоту избиения робота, не нанося вреда сердечной ткани на нем. Хотя этот метод изготовления легко изучить и воспроизвести, Есть еще несколько технически сложных шагов в процессе изготовления, которые необходимо подчеркнуть.
Есть пять критических шагов для изготовления мягкого биоробота: 1) правильное рассеивание CNTs в гидрогеле GelMA; 2) успешное перекрестное соединение ультрафиолетовых лучей гидрогелей PEGDA и CNT-GelMA на стекле с покрытием TMSPMA; 3) перенос микроэлектродов АУ из опорного стекла на гидрогелевую узор; 4) правильное отслоение свитого от опорной стеклянной горки; 5) создание хорошего электрического контакта между микроэлектродами Au и проводами, используемыми для подключения к генератору волновой формы.
По сравнению с нетронутыми субстратами GelMA, включение CNT обеспечивает гидрогель GelMA с улучшенными механическими свойствами и передовыми электрофизиологическими функциями, которые способствуют более высокой спонтанной синхронной скоростью избиения и более низкому порогу возбуждения ткани миокарда9. Проблема цитотоксичности CNT предотвращается не только с помощью поверхностных функционализированных CNT, но и путем включения наноструктур в матрицу гидрогеля GelMA до концентрации 5,0 мг/мл9. В самом деле, взаимодействие между гидрофобных сегментов гидрогеля GelMA с CNTs боковины привести к инкапсуляции CNTs в гидрогеле пористых матрицы14. Это не только предотвращает их образование потенциально токсичных агрегатов, но и повышает растворимость CNT s seline solutions (например, DPBS или среды клеточной культуры).
Для успешного включения микроэлектродов Au между гидрогелями PEGDA и CNT-GelMA необходимо уделять особое внимание ультрафиолетовым перекрестным соединениям каждого одного слоя. В частности, для передачи микроэлектродов АУ на слой гидрогеля PEGDA необходимо обеспечить, чтобы раствор гидрогеля покрывал всю область электрода, чтобы избежать разрыва электродов во время шага пилинга. Таким образом, качество стеклянного покрытия TMSA имеет основополагающее значение для обеспечения оптимального примыкания гидрогеля PEGDA на стеклянный субстрат, тем самым предотвращая его отслоение во время переноса микроэлектродов.
Другим важным шагом метода является отрыв биоактатора от опорной стеклянной горки. Эта проблема может быть легко решена, когда спонтанное избиение сердечных тканей является синхронным и достаточно сильным, чтобы естественно очистить поддерживающий гидрогель от стеклянной горки. По этой причине, как сообщалось ранее, принципиально необходимо оптимизировать модели гидрогеля, чтобы вызвать определенное выравнивание клеток, благоприятное для организации функциональной и синхронной сердечной ткани.
Для электрического подключения микроэлектродов к генератору волновой формы, электрические соединения должны быть созданы на микроэлектроде. Во время этого шага, важно, чтобы полностью инкапсулировать серебряный клей, используемый для контакта микроэлектродов с медной проволоки, чтобы избежать цитотоксического воздействия. Это успешно достигается путем депонирования тонкой капли PDMS на верхней части электрического контакта.
Этот метод мог не только преодолеть ограничения существующих оптогенетических методов, таких как сложные процессы изготовления, длительные сроки изготовления и потенциальную токсичность оптогенетических инструментов, но и значительно повысить производительность клеточных приводы, ведущие к стимуляции в режиме реального времени с использованием недорогих и простых в обращении методов. Хотя дизайн наших нынешних биовдохновленных приводов не мог генерировать вперед двигатель, его успех в области автономных роботов на основе клеток может привлечь большой интерес. Этот метод также потенциально может способствовать разработке беспроводных имплантируемых патчей для всего тела робота. Этот метод прокладывает путь для будущей беспроводной электрической стимуляции мягкой биороботов, хотя интеграция гибких схем RF непосредственно в гидрогель основе эшафот.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта статья была профинансирована Национальными институтами здравоохранения (R01AR074234, R21EB026824, R01 AR073822-01), Бригамским научно-исследовательским институтом, премией инновационного новатора и премией AHA Innovative Project Award (19IPLOI34660079).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Beaker | PYREX | 1000-250CNEa | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Milipore | M6514 | |
| 37° Water bath | VWR | W6M | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | |
| 80° incubator | VWR | 1370GM | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Anti-Connexin 43/GJAI antibody | Abcam | ab11370 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Sarcomeric α-actinin | Abcam | ab9465 | Mouse monoclonal |
| Benchtop Freeze Dryers | Labconco | 77500-00 K | |
| Biosafety cabinet | Sterilgard | A/B3 | |
| Carbon rod electrodes | SGL Carbon Group | 6971105 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| CO2 incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Collagenase, Type II, Powder | Gibco | 17-101-015 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| COOH Functionalized Carbon Nanotubes | NanoLab | PD30L5-20-COOH | |
| Dicing saw machine | Giorgio Technology | DAD-321 | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11-965-118 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-144 | |
| E-beam evaporator | CHA | 57367 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10-437-028 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B, 300 bloom from porcine skin |
| Glass slide | VWR | 48382-180 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-079 | |
| Inverted optical microscope | Olympus | CK40 | |
| Magnetic hotplate | Corning | PC-420 | |
| methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276695 | Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor |
| Nunc EasYFlask 175cm2 | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| Olicscope | Siglent | SDS1052DL+ | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PDMS SYLGARD 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| Photomask | Mini micro stencil inc | ||
| Platinum wire | Alfa Aesar | AA43014BU | |
| Polyethylene glycol dimethcrylate | Polysciences Inc. | 15178-100 | |
| Regenerated Cellulose Dialysis Tubing | Fisherbrand | 21-152-14 | |
| Silver Epoxy Adhesive | MG Chemicals | 8330S | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | S2GPU02RE | |
| Ultra sonicator | Qsonica | Q500 | |
| UV Curing System | OmniCure | S2000 | |
| Vortex mixer | Scientific Industry | SI-0246A | |
| Waveform generator | Agilent | 33500B | |
| Wrap Aluminium foil | Reynolds | N/A |
References
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nature Biotechnology. 30 (8), 792-797 (2012).
- Park, S. J., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Laschi, C., et al. Soft Robot Arm Inspired by the Octopus. Advanced Robotics. 26 (7), 709-727 (2012).
- Alapan, Y., et al. Soft erythocyte-based bacterial microswimmers for cargo delivery. Science Robotics. 3 (17), 4423 (2018).
- Magdanz, V., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Development of a Sperm-Flagella Driven Micro-Bio-Robot. Advanced Materials. 25 (45), 6581-6588 (2013).
- Rus, D., Tolley, M. T. Design, fabrication and control of soft robots. Nature. 521 (7553), 467-475 (2015).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16 (18), 3473-3484 (2016).
- Shin, S. R., et al. Aligned Carbon Nanotube–Based Flexible Gel Substrates for Engineering Biohybrid Tissue Actuators. Advanced Functional Materials. 25 (28), 4486-4495 (2015).
- Shin, S. R., et al. Carbon-nanotube-embedded hydrogel sheets for engineering cardiac constructs and bioactuators. ACS Nano. 7 (3), 2369-2380 (2013).
- Shin, S. R., et al. Electrically Driven Microengineered Bioinspired Soft Robots. Advanced Materials. 30 (10), 1704189 (2018).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
- Jia, Z., et al. Stimulating cardiac muscle by light: cardiac optogenetics by cell delivery. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (5), 753-760 (2011).
- Shin, S. R. Carbon Nanotube Reinforced Hybrid Microgels as Scaffold Materials for Cell Encapsulation. ACS Nano. , (2013).
