Summary
Vi har utvecklat ett protokoll för generering och utvärdering av en humaniserad och human immunbrist virusinfekterade NOG musmodell baserad på stamcellstransplantation, intravaginal human immunbrist virus exponering, och droplet digital PCR RNA Kvantifiering.
Abstract
Humaniserade möss ger en sofistikerad plattform för att studera humant immunbristvirus (HIV) virologi och för att testa antivirala läkemedel. Detta protokoll beskriver inrättandet av ett mänskligt immunsystem hos vuxna NOG möss. Här förklarar vi alla praktiska steg från isolering av navelsträngsblod härledda mänskliga CD34 + celler och deras efterföljande intravenös transplantation i möss, till manipulering av modellen genom HIV-infektion, kombination antiretroviral terapi ( cART) och blodprov. Cirka 75.000 hCD34 + celler injiceras intravenöst i möss och nivån av mänsklig chimär, även känd som humanisering, i perifert blod uppskattas längsgående i månader av flöde cytometri. Totalt 75.000 hCD34 + celler ger 20%-50% mänskliga CD45 + celler i perifert blod. Mössen är mottagliga för intravaginal infektion med HIV och blod kan provtas en gång i veckan för analys, och två gånger i månaden under längre perioder. Detta protokoll beskriver en analys för kvantifiering av plasma virusbelastning med droppen digital PCR (ddPCR). Vi visar hur mössen effektivt kan behandlas med en standard-of-care cART regim i kosten. Leveransen av cART i form av vanlig mus chow är en betydande förfining av den experimentella modellen. Denna modell kan användas för preklinisk analys av både systemiska och aktuella pre-exponering profylax föreningar samt för testning av nya behandlingar och hiv bota strategier.
Introduction
Humant immunbristvirus (HIV) är en kronisk infektion med mer än 37 miljoner infekterade individer över hela världen1. Kombination antiviral terapi (cART) är en livräddande terapi, men ett botemedel är fortfarande motiverat. Således finns det ett behov av djurmodeller som speglar det mänskliga immunsystemet och dess svar för att underlätta fortsatt forskning inom hiv. Flera typer av humaniserade möss som kan stödja cell och vävnad engraftment har utvecklats genom att transplantera mänskliga celler i allvarligt immunodeficient möss2. Sådana humaniserade möss är mottagliga för HIV-infektion och ger ett viktigt alternativ till icke-mänskliga primat simian immunbristvirus modeller, eftersom de är billigare och enklare att använda än icke-mänskliga primater. Humaniserade möss har underlättat forskning inom hiv-virusöverföring, patogenes, förebyggande och behandling3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Vi presenterar ett flexibelt humaniserat modellsystem för HIV-forskning som utvecklats genom transplantation av navelsträngsblod som härrör från mänskliga stamceller till möss i NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) bakgrund. Förutom att vara av icke-fetalt ursprung, den praktiska biotekniken av dessa möss är mindre tekniskt krävande jämfört med microsurgical förfaranden som deltar i transplantation av blod-lever-tymus (BLT) konstruktion.
Vi visar hur man etablerar HIV-infektion genom intravaginal överföring och hur man kan övervaka plasma virusbelastning med en känslig droplet digital PCR (ddPCR)-baserade setup. Därefter beskriver vi inrättandet av standard cART ges som en del av den dagliga musdieten. Syftet med dessa kombinerade metoder är att minska stressen för djuren och underlätta storskaliga experiment där tidsförande hantering av varje djur är begränsad12.
Hos människa orsakar en CCR5Δ32/wt eller CCR5Δ32/ Δ32 genotyp minskad känslighet för HIV-infektion med sändare/grundare virus13, och vissa försiktighetsåtgärder måste vidtas när bioengineering humaniserade möss med stamceller i syfte att hiv-studier. Detta gäller särskilt i vår region eftersom naturligt förekommande varianter i CCR5-genen, särskilt Δ32-borttagningar, är vanligare i skandinaviska och baltiska inhemska populationer jämfört med resten av världen14,15. Således innehåller vårt protokoll en enkel, hög genomströmning analys för screening givare hematopoietiska stamceller för CCR5 varianter före transplantation.
För intravaginal exponering valde vi sändaren / grundaren R5 virus RHPA4259, isolerad från en kvinna i ett tidigt skede av infektion som smittades intravaginally16. Vi exponerade mössen för en virusdos som var tillräcklig för att ge framgångsrik överföring i de flesta möss, men under en 100% överföringshastighet. Att välja en sådan dos möjliggör ett tillräckligt dynamiskt omfång i överföringshastigheten så att antivirala effekter av en läkemedelskandidat kan resultera i skyddade djur i hiv-förebyggande experiment och minskad virusmängd för behandlingsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla navelblodprover erhölls i strikt överensstämmelse med lokalt godkända protokoll, inklusive informerat samtycke från föräldrarnas anonyma donation. Alla djurförsök godkändes och utfördes i strikt överensstämmelse med danska nationella bestämmelser enligt licensen 2017-15-0201-01312.
FÖRSIKTIGHET: Hantera HIV-exponerade möss och blod med yttersta försiktighet. Dekontaminerad alla ytor och vätskor som har varit i kontakt med HIV med ett bekräftat hiv-desinfektionsmedel (Materialtabell).
1. Isolering av mänskliga CD34+ stamceller
- Samla navelsträngsblod prover i EDTA-belagda blod insamling rör efter planerade kejsarsnitt eller vaginala födslar och enligt lokala etiska godkännanden.
- Isolera PMBCs från navelsträngsblod genom densitet-gradient separation enligt tillverkarens protokoll.
- Isolera CD34+ celler från PBMC-populationen genom att först pre-berika med antikroppar mot vanliga markörer för mogna celler, vilket inducerar korslänkning av celler av oönskade härstamningar med röda blodkroppar. Detta följs av CD34 + cell anrikning med magnetiska pärlor, enligt tillverkarens protokoll.
- Bestäm levande cellantal genom standardtrypan blå uteslutning genom att omavbryta 10 μL cellsuspension i 90 μl trypanblått. Tillsätt 10 μL av denna lösning till en hemacytometer och räkna icke-blå celler, enligt tillverkarens protokoll.
- Viably cryopreserve CD34 + celler i 1 ml av 10% DMSO i fetala nötkreatur serum (FBS) fram till dagen för mus transplantation.
- Viably cryopreserve en liten del av både isolerade (CD34+) och genomströmningceller (CD34-) separat för bedömning av CD34 + stamceller renhet (~ 30.000 celler i varje prov). Alternativt kan du testa renheten på nyberikade celler (se steg 2 nedan).
- Frys en bråkdel av icke-pelleterat genomströmning (CD34-) för bestämning av CCR5Δ32-status. Celler kan frysas direkt utan konditionerad fryslösning, men närvaron av röda blodkroppar i pelleten kan hämma den efterföljande PCR om genomströmningen pelleteras.
2. Bedömning av CD34+ stamcellsrenhet via flödescytometri
- Tina de isolerade cellerna (CD34+) och flödegenomceller (CD34-). Tvätta cellerna genom att omfördela cellerna från varje injektionsflaska i 9 ml rumstemperatur (RT) FACS buffert, bestående av 2% fetala nötkreatur serum (FBS) i fosfat-buffrad salin (PBS).
- Centrifug i 5 min vid 300 x g vid RT till pelletsceller.
- Häll av supernatant, omfördela cellerna i den återstående vätskan och överför till FACS rör. Upprepa tvättsteget med 3 ml FACS-buffert. Efter den andra centrifugeringen, häll av supernatanten och omblandas cellerna i den återstående vätskan.
- Tillsätt 5 μL fc receptorblockerande lösning(Materialtabell)och låt stå i 10 min vid RT. Tvätta inte bort fc-receptorns blockerande lösning.
- Tillsätt blandningen som innehåller förutbestämda volymer antikroppar mot human cd3 (klon SK7) BUV395, CD34 (klon AC136), FITC och CD45 (klon 2D1) APC (tabell 1). Lämna cellerna i 30 min på RT i mörkret. Fluoroforerna måste väljas baserat på parametrar som kan bedömas med tillgängliga flödescytometrar utan att det krävs en kompensationsmatris.
- Tvätta cellerna med 3 ml FACS-buffert.
- Centrifug i 5 min vid 300 x g vid RT för att pelletcellerna.
- Häll av supernatanten och omblanda cellerna i den återstående vätskan.
- Upprepa detta tvättsteg 2x för att säkerställa att alla obundna antikroppar har tagits bort.
- Registrera proverna på flödescytometern(Materialförteckning)och utför dataanalys med lämplig programvara. Gating-strategin presenteras i figur 1A–F.
3. Genetisk screening för CCR5Δ32-varianter i navelsträngsblod
- Inkubera 1,25 μL icke pelleterat genomströmning med 11,25 μL PCR-blandning innehållande 200 μM dNTP-blandning, 0,01 U/μL high fidelity DNA-polymeras och de främre och omvända grundfärger som beskrivs i tabell 2.
- Justera volymen med nucleasefritt vatten till cirka 12,5 μL för varje PCR-reaktion.
- Förstärka genomiska fragment med PCR cykelprogram som beskrivs i tabell 3.
- Separera PCR-produkterna på en 2% agarose gel13.
- PCR-produkter från de vilda typallelerna och Δ32-allelerna ger PCR-fragment av 196 baspar respektive 164 basparband, vilket gör dem lätt åtskanliga genom gelelektrofores13 (figur 1G).
4. Intravenös stamcellstransplantation
OBS: Att ha en person förbereda cellerna i laboratoriet och en annan person förbereda möss och arbetsyta för transplantationer är ett effektivt tillvägagångssätt.
- I en djuranläggning, 4–6 h före den planerade transplantationen av stamcellerna, bestrålar 6–7 veckor gamla kvinnliga NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac (NOG) möss(Table of Materials)med 0,75 Gy med en Cs137 källa. Den bästa förkonditioneringdosen kan variera beroende på musålder, strålkälla och andra faktorer. Denna process villkorar djuren för lyckad engraftment med människa stamceller.
- I en djuranläggning förbereder du flödesbänkens arbetsyta och alla reagenser innan mössen eller cellerna förs in på arbetsytan.
- Placera en steril blå dyna för att täcka flödesbänkens arbetsyta. Förbered steril gasväv och en behållare för vassa föremål.
- Placera en värmelampa desinficerad med 70% etanol i flödesbänken med en tom steril musbur under värmen.
- I laboratoriet, tina isolerade CD34+ celler och späd dem i 9 ml av 37 °C vanligt RPMI.
- Centrifug cellerna vid 350 x g i 5 min vid RT, kassera supernatanten genom aspiration och omfördela pelleten i 1 ml vanlig RPMI vid 37 °C.
- Bestäm cellantalet med trypanblå uteslutning och justera volymen till 200 μL per mus. Gör extra för att ta hänsyn till eventuell förlust på grund av de efterföljande hanteringsstegen.
- Förbered transplantation 75.000 CD34 + celler per 200 μL i varje mus.
- Cellerna kan förvaras vid 4 °C under transport till djuranläggningen före transplantationen. Undvik att hålla cellerna på is för att minska aggregering eller klumpa ihop sig.
- I djuranläggningen, ta buren med mössen i flödesbänken och överföra mössen till buren under värmelampan för att vidga blodkärlen. Lämna ena änden av buren bort från värmekällan så att mössen kan röra sig bort från värmen när de blir varma. Möss som har flyttat till slutet av buren, bort från värmekällan, är tillräckligt varma för en lyckad svansven injektion.
- Fyll på en 1 ml smord spruta ovanför 800 μL-märket med suspenderade CD34+-celler. Med hjälp av en smord 1 ml spruta kommer dramatiskt underlätta intravenös injektion och öka precisionen i denna teknik.
- Fäst en nål på 30 G 13 mm och förbered nålen och sprutan för injektion. Denna driftordning gör det möjligt att ladda sprutan snabbare samtidigt som den skyddar cellernas integritet som kan transplanteras med tanke på de eventuella skador som kan uppstå under den snabba aspirationen hos celler genom en så liten mätare nål. Fyll nålnavet med vätska genom att trycka kolven och ta bort vätskan ner till nålens 200 μL-märke.
- Placera en uppvärmd mus (steg 4.6) i ett återhållfasthet som används för att ge IV injektioner. Injicera försiktigt 200 μL av cellsuspensionen i musens svansven. Tillbringa 2 s utför doppet och hålla nålen insatt i ca 2 s efter avslutad injektion. Detta säkerställer att cellerna har migrerat tillräckligt långt från injektionsstället innan nålen avlägsnas.
- Vid behov, torka mussvansen med steril gasväv för att avlägsna synligt blod. Sätt tillbaka musen i sin icke-uppvärmda hembur. Upprepa injektionsproceduren med de återstående mössen.
5. Blodinsamling och bearbetning för analys
OBS: Human cell engraftment i perifert blod kan utvärderas via flödecytometri 3-5 månader efter humanstamcellstransplantation.
- Dra blodprov från mössen med hjälp av lokala IACUC-godkända tekniker.
- Samla in högst 70–100 μL totalt blod i sterila PCR-mikrocentrifugrör innehållande 10 μL på 0,5 M EDTA (pH = 8.0) för att undvika koagulation av blod.
6. Utvärdering av human tympning via flödescytometri
- Överför 40–50 μL blod till FACS-rör.
- Tillsätt 5 μL Fc Receptor blockerande lösning för att förhindra icke-specifik bindning av antikroppar och låt stå i 10 min vid RT.
- Lägg till musanti-human antikroppsblandning som innehåller CD4 (klon SK3) BUV 496, CD8 (klon RPA-T8) BV421, CD3 (klon OKT3) FITC, CD19 (klon sj25c1) PE-Cy7, CD45 (klon 2D1) APC (tabell 4) och låt fläcka i mörkret vid RT i 30 min. Fluoroforer måste väljas baserat på parametrar som kan bedömas med tillgängliga flödescytometrar utan att det krävs en matriskompensation.
- Tillsätt 2 ml av en lämplig röd blodcelllysning buffert till varje rör för att lysa de röda blodkropparna. Använd en lysbuffert som är särskilt formulerad för antikroppsfärgning före rödblodslys (ett lämpligt exempel ges i materialförteckningen). Vortex kort för att säkerställa lika fördelning av cellerna i lysningslösningen och lämna i 10 min vid RT. Lika fördelning av cellerna är viktigt.
- Lägg till 2 ml FACS-buffert för att stoppa lysreaktionen.
- Centrifug i 5 min vid 300 x g vid RT för att pelletcellerna.
- Häll av supernatant och virvel försiktigt tills cellerna är resuspended.
- Tillsätt 3 ml FACS-buffert och centrifug i 5 min vid 300 x g vid RT.
- Häll av supernatanten och omblandas cellerna.
- Registrera proverna på en lämplig flödescytometer och analysera med lämplig programvara (Table of Materials). Representativ analys och resultat avbildas i figur 2 och figur 3.
7. Intravaginal HIV-exponering
OBS: Det virus som används för intravaginal exponering av mössen kan produceras med hjälp av tidigare publicerade protokoll17. Viruset hålls vid -80 °C och transporteras mellan platser medan de lagras på torris enligt lokalt godkända protokoll. Viruset lagras på torris tills omedelbart före mössens exponering. Viruset kan spädas ut i vanlig RPMI (undvik RPMI som har antibiotika eller serumtillsatser) för att uppnå lämplig koncentration omedelbart före exponering (21 400 IUs användes för denna IVAG-exponering). När det har genererats, hålla det utspädda beståndet på våt is under hela förfarandet för att undvika frys-tina cykler som skulle uppstå om det utspädda viruset placerades tillbaka på torris en gång tinade.
- Förbered all utrustning och flödesbänkarbetsyta enligt figur 4 innan mössen eller viruset förs in i flödesbänken (liknande steg 4.2).
- Placera värmelampans fokus i mitten av arbetsytan där musen kommer att placeras under hiv-exponeringsproceduren. Värmelampan säkerställer ingen minskning av mössens kroppstemperatur. Annan utrustning som styr temperaturen kan också användas (t.ex. en uppvärmd geldyna eller en cirkulerande varmvattenfilt, enligt lokala IACUC-föreskrifter18).
- Ta sterila 20 μL pipettspetsar och en lämplig pipett i bänken. Placera en behållare med flytande desinfektionsmedel(Materialförteckning)i bänken för omedelbar inaktivering av material och vätskor som har varit i kontakt med viruset.
- Placera en mus i en kammare med 3% isoflurane gas och pappershanddukar. Denna andel av gasen kommer att minska djuren inom 2–4 min. Som med alla andra material som används med immunodeficient möss, måste anestesi apparaten vara korrekt desinficeras före användning.
- När sats, överför musen till en steril blå pad under värmelampan. För in mussnaran i en mask som levererar kontinuerlig 3% isoflurane gas för att upprätthålla anestesi. Håll musen vid basen av svansen, magen vänd uppåt, med handen som stöder musen tillbaka som avbildas i figur 4.
- Med en steril pipettspets, stimulera könsorganen genom att försiktigt strök uppåt mot anus för att framkalla tömning av ändtarmen, lindra trycket på slidan.
- Försiktigt blotta vaginal öppning genom att linda musen svansen över fingrarna så att vulva naturligt öppnas, kanske med liten knuffande med hjälp av en steril pipett spets.
- Ändra pipettspetsen och pipetten 20 μl virus atraumatiskt i musslidan utan att skapa bubblor. Sätt inte in spetsen djupt in i slidan. Snarare, med vulva öppnas, placera pipettspetsen på nivån för vaginal öppning, undvika att gå djupare för att eliminera risken för skrubbsår under inympningsprocessen, släpp viruset och låt gravitationen dra viruset in i slidan. Alternativt kan du använda en 22 G 1,25 mm trubbigt, rak nål,enligt beskrivningen i Veselinovic m.fl.
- Behåll musen i denna position med slidan uppåt i 5 min efter exponering för att undvika gravitation-inducerad läckage av viruset suspensionen.
- Placera försiktigt musen i hemburen, var noga med att placera musen på ryggen.
8. Bearbetning av blodprov före viral lastanalys
- Samla blod enligt beskrivningen i avsnitt 5 ovan.
- Centrifug blodproverna i 5 min vid 500 x g vid RT för att separera plasma och celler.
- Samla in 40 μL plasma för mätning av virusbelastning i ett nytt sterilt PCR-godkänt mikrocentrifugrör och förvara svarat på -80 °C i minst 1 timme tills vidare bearbetning. Det är viktigt att frysa alla prover före RNA-extraktion en för att undvika risken för bias från att jämföra RNA-nivåer i prover som inte har frysts före RNA-isolering till prover som frystes före RNA-isolering.
- Justera blodvolymen till den ursprungliga volymen genom att tillsätta 40 μL suspensionsmedia (PBS med 2,5 % albumin av nötkreatur, 50 U/ml penicillin G och streptomycin och 10 U/ml DNase, sterilt filtrerat vid 0,22 μm).
- Överför 15 μL av den justerade blodvolymen till ett nytt PCR-godkänt mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1 ml 1x RBC lyslösning (Table of Materials), virvel och inkubera i 10 min vid RT.
- Centrifug i 1 min vid 9 600 x g vid RT till pelletsceller.
- Aspirera supernatant och lämna endast den lilla vita cellpelleten, eftersom röda blodkroppar kontaminering kan hämma PCR.
- Förvara pelleten vid -80 °C i minst 1 timme tills vidare bearbetning.
OBS: Alternativt kan eventuellt återstående blod från steg 8.4 användas för flödescytometrianalys, enligt beskrivningen ovan i steg 6.
9. DNA-extraktion med hjälp av en proteinas K extraktionsmetod
- Extraktet DNA från perifera cellpellets (som genereras i steg 8.8) med hjälp av en proteinas K-extraktionsmetod enligt beskrivningen nedan. Denna metod har visat sig extrahera den högsta DNA-avkastningen från en liten mängd blod som krävs för de seriella blodsamlingar som används i denna studie19.
- Tillsätt 25 μL proteinas K (20 μg/ml) till 1 ml av 0,1 M Tris buffert.
- Vortex proteinasen K-lösning kort.
- Tillsätt 50 μL av proteinasEn K-lösningen till varje cellpellet som ska smältas.
- Blanda genom att pipetta upp och ner och bekräfta återfjädringen av cellpelleten.
- Skaka på en thermoshaker(Materialtabell)vid 400 varv/min (beroende på instrumentet) vid 56 °C i 1 h. Tejprör ner för att hålla dem på plats, om det behövs.
- Omedelbart och i samma thermoshaker, inaktivera proteinas K med en temperaturförskjutning till 95 °C medan skakningen fortsätter i ytterligare 20 min.
- Virvel varje prov.
- Placera varje prov vid -80 °C i minst 30 minuter.
- Tina, sedan centrifuge proverna på 17.000 x g i 1 min på RT till pellet oönskade cellulära fragment.
- Placera DNA-innehållande supernatant i ett nytt mikrocentrifugrör.
- DNA-mallen är klar för PCR. DNA-mallarna kan förvaras vid -80 °C.
10. RNA-extraktion, cDNA-syntes och ddPCR-kvantifiering av viralt RNA
- Isolera RNA från tinad musplasma med ett VIRUS RNA-isoleringssats enligt tillverkarens protokoll (Table of Materials).
- Efter tillsats av provet i kolumnen, tillsätt en on-column DNase behandlingssteg för att säkerställa avlägsnande av allt DNA i plasmaprovet.
- För varje prov, tillsätt 95 μL RNase-fri DNase-lösning (blanda 2 μL RNAse-fri DNase och 98 μL reaktionsbuffert) till kolonnen och inkubera i 15 min vid RT.
- Förvara RNA-proverna vid -80 °C i minst 1 timmar före vidare bearbetning. Det är viktigt att frysa alla prover efter att RNA-extraktionen undviker risken för bias när prover som inte har frysts med prover som frystes.
- Synthesize cDNA med hjälp av en omvänd transkriptas steg med hjälp av reagenser som beskrivs tidigare20. Se till att lägga till 0,5 μL av en RNase-hämmare till cDNA-reaktionen för att undvika nedbrytning av RNA.
- Utför cDNA-syntes med det program som beskrivs i tabell 5.
- Förvara cDNA-proverna vid -80 °C i minst 1 timmar. Det är viktigt att frysa alla prover efter cDNA-syntes undvika risken för bias när man jämför prover som inte har frysts med prover som frystes.
- Förbered prover för ddPCR enligt följande20:
- Blanda 3 μL av cDNA-provet med 11 μL av ddPCR-sondblandningen (ingen dUTP)20,250 nM mindre spårbindningssond och 900 nM av var och en av de främre och omvända grundlägearna enligt tabell 6.
- Justera den totala PCR-volymen till 22 μL med nucleasefritt vatten.
- Emulgering PCR blandas med Droplet Generation Oil för sonder på en droppgenerator enligt tillverkarens protokoll och tidigare beskrivningar20.
- Kör PCR-programmet enligt tabell 7.
OBS: Primer / sond sekvenser och PCR-program som visas här har utformats och optimerats för känslig upptäckt av HIV-stam RHPA4259. Primer och sond sekvenser kan lätt justeras för att upptäcka andra HIV-stam val. - Upptäck droplet fluorescens från proverna på en droppläsare och analysera resultaten med lämplig programvara enligt tillverkarens protokoll.
11. Behandling med cART-innehållande chow
- Foder möss med pellets som innehåller en standard cART-regim som innehåller 4 800 mg/kg raltegravir (RAL), 720 mg/kg tenofovirdisoproxilfumarat (TDF) och 520 mg/kg emtricitabin (FTC)21 (tabell 8). Dessa doser fastställdes förutsatt att en mus väger 25 g och äter 4 g chow per dag. Detta motsvarar en daglig dos på 768 mg/kg RAL, 2,88 mg/kg TDF och 83 mg/kg FTC21.
- Använd en cART-diet som har utarbetats av en extern leverantör (se materialtabell)av receptbelagda läkemedel. Andra företag skulle potentiellt också kunna producera denna regim. Använd en cART diet färgad röd för att enkelt skilja den från vanliga mus chow.
- Producera en kontroll chow diet utan cART i en standard brun färg för enkel åtskillnad.
- För inledande av cART, förbereda sterila musburar med tillsats av cART-innehållande chow diet, och sedan överföra möss från den gamla buren till den nya buren.
- Övervaka mössens vikter och konsumtion av cART-innehållande käk genom visuell inspektion för att säkerställa att mössen anpassar sig till förändringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating-strategin för analys av stamcellers renhet avbildas i figur 1. Figur 1A–C visar den renade CD34+-populationen och figur 1D–F cd34-flödet som används för att illustrera att den minimala mängden cd34+-populationen går förlorad i isoleringsprocessen. Renheten hos isolerade CD34+ stamceller var mellan 85–95 % med mindre än 1 % T-cellskontaminering. Figur 1G visar CCR5-band från en vuxen människa kontroll givare med CCR5Δ32 /wt genotyp, följt av band från två CCR5wt / wt och en CCR5Δ32 /wt stamcellsgivare. Frekvensen av genotyp CCR5Δ32/wt i en grupp på 19 givare var 15, 8%(figur 1H). Detta är i samförstånd med större epidemiologiska studier14,15 rapporterar genotyp i upp till 23,6% av undersökta personer i Danmark.
Mänskliga CD45+ nivåer hos möss perifert blod bedömdes via flödescytometri 3–5 månader efter transplantation av mänskliga CD34+ stamceller. Gating-strategin presenteras i figur 2A–E. Figur 3A och figur 3B illustrerar variabiliteten mellan 10 och 16 enskilda möss som tar emot stamceller från två olika donatorer. Transplantation av 75.000 hCD34 + celler gav 20%-50% mänskliga CD45 + i perifert blod. Alla möss utvecklade mänskliga B- och T-celler, inklusive både CD4- och CD8+ T-celler.
För atraumatisk intravaginal exponering, den setup avbildas i figur 4 användes. Möss var satsats i en sluten kammare och hölls under anestesi under exponeringen. Möss hölls med slidan vänd upp i 5 min efter exponering för att säkerställa viruslösning engagemang med slemhinnor ytor.
Figur 5A visar den 64% hiv-överföring framgång observeras med hjälp av denna modell. Möss utmanades med 21.400 infektiösa enheter (IE) av RHPA4259 intravaginally. Denna dos resulterade i att 64% av mössen blev HIV-infekterade efter vaginal exponering. Som jämförelse ingår data från två olika kohorter av möss som exponeras via en intravenös rutt. Som väntat blev 100% av mössen HIV + med liknande doser av RHPA och en ytterligare stam (YU2) med denna rutt.
Figur 5B visar representativa resultat från tre möss som var infekterade med HIV och bytte till en diet som innehåller standard cART. Möss byttes tillbaka till vanlig mus chow efter 40 dagar av cART. I denna analys inställning var gränsen för virusbelastning detektering 725 kopior / ml. Virusbelastningar var alla under detektionsgränsen efter 4 veckor av cART. Efter upphörande av cART, återhämtade sig viruset, spegling kliniska data22. Möss på cART tolererade förändringen i kosten samt anges i figur 5C.
Figur 1: Strategi för representativflödescytometri för validering av stamcellsrenhet och CCR5-status för givarvariant. (A–C) Den gating strategi som används för den isolerade CD34 + cellpopulationen. Dubinor och skräp är undantagna i panel A respektive B (FSC-A vs FSC-H och FSC-A vs SSC-A). (C)Frekvensen av CD34+ stamceller och CD3+ T-cellkontaminering. (D–F) CD34- flow-through gating strategi. Procentsatser i grindar beräknas som en bråkdel av moderpopulationen. (G)Resultaten av en CCR5Δ32/wt PCR-analys. Körfält 1: DNA från en human CCR5Δ32/wt givare, körfält 2 och 3: två CCR5wt /wt mänskliga stamceller givare, körfält 4: En CCR5Δ32 /wt mänskliga stamceller givare. (H) Frekvensen av genotyp CCR5Δ32 /wt i vår grupp av 19 stamcellsprover är 15,8%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Flödescytometri gating strategi för validering av mänskliga cell engraftment och differentiering. Den totala mononukleära cellpopulationen från humaniserade möss analyserades via flödescytometri. (A)Andelen mänskliga CD45+ celler fastställdes som en bråkdel av de totala registrerade händelserna. (B) Dubbelmynt uteslöts därefter på grundval av FSC-A/FSC-H gating. (C) Den verkliga lymfocytpopulationen definierades baserat på storlek och granularitet. (D) Lymfocyter karakteriserades sedan som antingen CD3+ (T-celler) eller CD19+ (B-celler). (E) CD3+ T-celler var antingen CD4+ T-celler eller CD8+ T-celler. Procentsatser i grindar beräknades som en bråkdel av moderpopulationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativhumaniseringsnivåer 4–5 månader efter stamcellstransplantation med cellsubtypfraktioner för 10 och 16 möss som genereras från två olika mänskliga donatorer. (A)Den mononukleära cellpopulationen (MNC) från 10 ochB) analyserades 16 humaniserade möss via flödescytometri och gated s. i figur 2. Fraktionen av celler i CD45+ hos mänskliga CD45 visas som %hCD45 (av totala MNC- och %B- och %T-celler som en bråkdel av hCD45. T-celler delades senare in i %CD4 och %CD8. Varje datapunkt representerar en mus. Data presenteras som medelvärde ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Experimentell labbbänk inställning för intravaginal exponering av möss. Experimentell inställning för HIV-exponering av humaniserade möss genom intravaginal agens. Proceduren utförs i en flödesbänk där alla reagenser och ytor har steriliserats före användning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Frekvensen av överföring av hiv-stam genom olika exponeringsvägar och effekt och säkerhet för cART-innehållande chow i virussuppression. (A) Humaniserade NOG möss framgångsrikt smittats med två olika stammar av HIV genom antingen intravaginal eller intravenös väg. Möss utsattes med 21.400 IUs av RHPA4259 intravaginally, 5.157 IUs IV med RHPA4259, eller 3.000 IUs IV med YU2. Detaljer om IV exponering av humaniserade möss ingår inte i detta protokoll. HIV-infektioner behandlades framgångsrikt med en cART regim levereras genom mus chow. (B) Virusbelastningen minskade till under detektion för alla tre mössen på cART och rebound uppstod efter det att cART upphört. Den prickade linjen anger kvantifieringsgränsen vid 725 kopior/ml. Möss matas med cART chow hade liknande viktutveckling som möss inrymt på icke-cART chow under samma tidsperiod, vilket tyder på ingen smak-preferens eller biverkningar av cART diet. (C) Vikter presenteras som vikförändring jämfört med början av cART. Varje datapunkt representerar medelvärdet av tre djur ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antikroppsmål | Klon | Fluorofor |
| CD3 (CD3) | klon SK7 | BuV395 (på 1995) |
| CD34 (cd34) | klon AC136 | Fitc |
| CD45 (cd45) | klon 2D1 | Apc |
Tabell 1: Antikroppar som används för bestämning av stamcellers renhet. Föreslagna multicolor flöde cytometri panel för utvärdering av stamceller renhet. Listad är antikroppsmålet, klonen och fluoroforen.
| IDENTIFIERING AV CCR5Δ32 | Grundfärger |
| Framåt primer | 5'CTTCATTACACCTGCAGCT'3 |
| Omvänd primer | 5'TGAAGATAAGCCTCACAGCC'3 |
Tabell 2: CCR5Δ32 variant detektering PCR primers. Framåt och omvänd primers som används för detektion av 32 bp-borttagningen i CCR5-genen.
| Nej. av cykler | 1 | 45 | 1 | ∞ |
| Temperatur (°C) | 98 | 98/63/72 | 72 | 10 |
| Tid | 30 s | 10 s/30 s/15 s | 5 min ( 5 min ) | ∞ |
Tabell 3: PCR-programmet FÖR variantdetektering av CCR-variant. PCR cykelprogram som används för förstärkning av CCR5 genen.
| Antikroppsmål | Klon | Fluorofor |
| CD4 (CD4) | Sk3 (på 1960 | Buv 496 (på 1990-) |
| CD8 (cd8) | RPA-T8 (på 1960-) | Bv421 (på 1990-år) |
| CD3 (CD3) | OKT3 (okt3) | Fitc |
| CD19 (på 1960-talet | sj25c1 (på 4777) | PE-Cy7 (på 1960-) |
| CD45 (cd45) | 2D1 (2D1) (på 4 | Apc |
Tabell 4: Antikroppar som används för bestämning av mushumanisering. Föreslagen multicolor flöde cytometri panel för humanisering. Listad är antikroppsmålet, klonen och fluoroforen.
| Nej. av cykler | 1 | 1 | ∞ |
| Temperatur (°C) | 51 | 80 | 4 |
| Tid | 45 min ( 45 min ) | 15 min ( 15 min ) | ∞ |
Tabell 5: cDNA-förstärkningsprogram. Program som används för förstärkning av kompletterande sträng DNA till viralRNA.
| Hiv-kvantifiering | Grundfärger |
| Framåt primer | 5'AGGGCAGCATAGAGCAAAAA'3 |
| Omvänd primer | 5'CAAAGGAATGGGGGTTCTTT'3 |
| FAM-sond | 5'ATCCCCACTTCAACAGATGC'3 |
Tabell 6: HIV ddPCR primers. Primers och sonder som används för ddPCR förstärkning av viral cDNA.
| Nej. av cykler | 1 | 39 | 1 | ∞ |
| Temperatur (°C) | 95 | 95/54.5 | 98 | 4 |
| Tid | 10 min ( 10 min ) | 30 s/1 min | 10 min ( 10 min ) | ∞ |
Tabell 7: Hiv ddPCR-programmet. PCR cykelprogram som används för förstärkning av viralRNA.
| Raltegravir (RAL) | 4800 mg/kg |
| Tenofovirdisoproxilfumarat (TDF) | 720 mg/kg |
| Emtricitabin (FTC) | 520 mg/kg |
Tabell 8: Mus cART chow diet. Mus chow diet formulerades som tidigare publicerade21. Den chow diet gjordes på en bas av standard mus chow, och efter produktion, maten var γ-bestrålade med 25 kGy och dubbel-packas. Käket förvarades vid -20 °C tills användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den allvarligt immunkomprometterade mus stam NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) är extremt väl lämpad för transplantation av mänskliga celler och vävnader. Både medfödda och adaptiva immunvägar hos dessa möss äventyras. NOG och NSG möss hysa en Prkdcscid mutation som resulterar i defekta T och B cell funktion. Dessutom saknar dessa möss en funktionell interleukin-2-receptor γ-kedja (gemensam gammakedja, IL2rg) som är oumbärlig i bindningskomplexen hos många nyckelcytokiner som IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 och IL-21. Immunbristmöss, såsom NOG, transplanteras med ett mänskligt immunsystem är ett kraftfullt verktyg för studier av hiv-överföring och immunologi. Bidrag inom dessa områden som gjorts med humaniserade möss har genomgått omfattande granskning2,23,24,25,26. Användningen av dessa möss för att studera mänskliga medfödda immunsvar får också ökad uppmärksamhet27,28.
Syftet med detta manuskript är att tillhandahålla ett omfattande protokoll av mus och ddPCR förfaranden för att gå från en naiv mus till hiv-överföring och behandlingsdata. Vårt system använde ddPCR för kvantifiering av viralRNA och DNA. I en ddPCR-reaktion är reaktanterna upp till 20 000 droppar, var och en innehållande en enda, separat mikro PCR-reaktion. Förstärkningen av ett mål inuti en droppe leder till en positiv fluorescerande signal för droppen. Avläsningen är således binär och genom att tillämpa Poissons statistiska analyser kan antalet positiva reaktioner översättas direkt till ett antal mallkopior i det ursprungliga provet. Fördelen med ddPCR ligger i dess förmåga att direkt kvantifiera ett mål oberoende av en standardkurva. Detta är särskilt attraktivt när man analyserar RNA-prover som är utmanande att använda som PCR standard kurvor på grund av deras labile natur29. Genom att analysera flera repliker av samma prov och slå samman de enskilda datapunkterna för den slutliga exempelkvantifieringen gör ddPCR:s binära karaktär det möjligt att sänka detekteringsgränsen för mallkopior per ml prov29. Detta är särskilt viktigt i en humaniserad musinställning, där endast begränsat provmaterial finns tillgängligt och hög känslighet krävs.
Administrering av cART till humaniserade möss kan göras antingen genom oral sondmatning eller intraperitoneal injektioner med lösningar av cART30,31,32, och som visas nyligen, genom formulering i kosten21. Ett av våra främsta mål var genomförandet av en cART regim i musen kost för att minska potentiella stress på djuren på grund av de extra hanteringssteg inneboende i andra metoder drogleverans. Dosen av läkemedlet som en mus kommer att äta kan uppskattas exakt baserat på det genomsnittliga dagliga födointag avmössen 33. Oral leverans genom kosten fungerar som den enklaste leveransvägen med både minimal stress för djuret och minimal arbetsbelastning för hanteraren. Vi baserade vår kombination av antivirala läkemedel på tidigare publicerade studier på humaniserade möss21,30. Dessutom är vår cART-strategi kliniskt relevant med tanke på att läkemedelskombinationen som används kliniskt administreras oralt av patienter runt om i världen.
Vissa begränsningar noteras när det gäller användning av NOG möss. Viktigt, mänskliga T-celler i dessa möss odlas i en mus thymic miljö, i motsats till en mänsklig miljö. Den senaste tidens fokus ligger på att generera xenorecipient stammar som har en gynnsam miljö för utveckling av robusta mänskliga immunsvar. Dessa nya stammar inkluderar immunbristmöss som är transgena för mänskliga MHC-molekyler, såsom A2. Dessa modeller möjliggör HLA-begränsad antigen T-cellssvar som resulterar i bättre mognad och effektor funktioner i adaptivt immunsystem34. Ett annat tillvägagångssätt är att ersätta musgener med viktiga mänskliga cytokiner för IL-3/GM-CSF35, IL-636, IL-1537, TPO, M-CSF38och IL-7/TSLP31. Sådana modeller har fått ökad uppmärksamhet för sin förmåga att generera bättre differentiering av medfödda celltyper. Vårt protokoll är lätt att anpassa för humanisering och HIV-infektion av möss med hjälp av någon sådan förbättrad genetisk bakgrund immunbrist stam.
Sammanfattningsvis underlättar den beskrivna metoden sett till att forskningen inom hiv-relaterade områden in vivo är lätta och användbara. Humaniserade möss kan vara ett mycket kraftfullt verktyg för att styra forskning för att generera bättre forskning hypoteser. Tillsammans med genereringav mer "mänskliga" humaniserade möss med mänskliga transgener tror vi att vårt standardiserade protokoll kommer att bidra till att effektivisera experimentella procedurer i olika forskningsmiljöer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka biomedicin Animal Facility personal vid Århus universitet, särskilt Ms Jani Kær för koloni underhåll insatser och för att spåra mus vikter. Författarna vill tacka professor Florian Klein för att utveckla standard-of-care cART och för vägledning. Följande reagens erhölls genom NIH AIDS Reagensprogram, sektionen för aids, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (katt# 11744) från Dr John Kappes och Dr Christina Ochsenbauer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
- WHO. GHO | By category | Antiretroviral therapy coverage - Data and estimates by WHO region (2018). World Health Organization. , Available from: http://apps.who.int/gho/data/node.main.626 (2018).
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
- Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
- Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
- Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
- Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
- Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
- Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
- Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
- Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
- Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
- Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
- Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
- Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
- Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
- Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
- Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
- Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
- Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
- Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
- Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
- Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
- Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
- Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
- Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
- Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
- Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
- Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, FEB (2018).
- Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
