Summary
Aqui demonstramos um método para quantificar o tamanho do fígado em zebrafish larval, fornecendo uma maneira de avaliar os efeitos das manipulações genéticas e farmacológicas no crescimento e desenvolvimento do fígado.
Abstract
Em vários modelos transgênicos de zebrafish do carcinoma hepatocelular (CcH), hepatomegaly pode ser observado durante estágios larvais precoces. Quantificar o tamanho do fígado larval em modelos de HCC de zebrafish fornece um meio de avaliar rapidamente os efeitos das drogas e outras manipulações em um fenótipo relacionado ao oncogene. Aqui mostramos como consertar larvas de zebrafish, dissecar os tecidos ao redor do fígado, fotografar fígados usando microscopia de campo brilhante, medir a área hepática e analisar os resultados. Este protocolo permite quantificação rápida e precisa do tamanho do fígado. Como este método envolve medir a área hepática, pode subestimar diferenças no volume do fígado, e metodologias complementares são necessárias para diferenciar entre alterações no tamanho celular e alterações no número celular. A técnica de dissecção descrita aqui é uma excelente ferramenta para visualizar o fígado, intestino e pâncreas em suas posições naturais para inúmeras aplicações a jusante, incluindo a coloração de imunofluorescência e a hibridização situ. A estratégia descrita para quantificar o tamanho do fígado larval é aplicável a muitos aspectos do desenvolvimento e regeneração hepática.
Introduction
O carcinoma hepatocelular (CCH) é a malignidade primária mais comum do fígado1 e a terceira principal causa de mortalidade relacionada ao câncer2. Para entender melhor os mecanismos da hepatocarcinogênese e identificar potenciais terapêuticas de HCC, nós e outros desenvolvemos zebrafish transgênicos nos quais a expressão específica do hepatocito de oncogenes como β-catenin3,4, Kras (V12)5,6, Myc7, ou Yap18 leva ao HCC em animais adultos. Nestes zebrafish, o alargamento do fígado é observado já em 6 dias após a fertilização (DPF), fornecendo uma plataforma fácil para testar os efeitos das drogas e alterações genéticas no crescimento excessivo do fígado orientado por oncogenes. Medição precisa e precisa do tamanho do fígado larval é essencial para determinar os efeitos dessas manipulações.
O tamanho e a forma do fígado podem ser avaliados semi-quantitativamente em larvas fixas de zebrafish por CY3-SA rotulando9 ou em larvas de zebrafish vivos usando repórteres fluorescentes específicos de hepatocito e microscopia dissecante5,6. Este último método é relativamente rápido, e sua falta de precisão pode ser abordada fotografando e medindo a área de cada fígado usando software de processamento de imagem7,10. No entanto, pode ser tecnicamente desafiador posicionar uniformemente todas as larvas vivas em um experimento de tal forma que a área hepática bidimensional é uma representação precisa do tamanho do fígado. Uma técnica semelhante para quantificar o tamanho do fígado envolve o uso de microscopia de fluorescência de folha de luz para quantificar o volume de fígadolarval 8, o que pode ser mais preciso para detectar diferenças de tamanho quando o fígado é expandido não uniformemente em diferentes dimensões. A classificação celular ativada pela fluorescência (FACS) pode ser usada para contar o número de hepatocitos fluorescentes rotulados e outros tipos de células hepáticas em fígados larvais8,11. Neste método, os fígados larvais são agrupados e dissociados, por isso se perdem informações sobre o tamanho e a forma individuais do fígado. Em combinação com outro método de determinação do tamanho do fígado, o FACS permite diferenciação entre o aumento do número celular (hiperplasia) e o aumento do tamanho celular (hipertrofia). Todos esses métodos empregam tecnologia de fluorescência cara (microscópio ou aparelho celular) e, com exceção da rotulagem CY3-SA, exigem rotulagem de hepatocitos com um repórter fluorescente.
Aqui descrevemos em detalhes um método para quantificar a área hepática larvalde zebrafish usando microscopia de campo brilhante e software de processamento de imagem3,12,13,14. Este protocolo permite quantificação precisa da área de fígados individuais in situ sem o uso de microscopia de fluorescência. Ao analisar o tamanho do fígado, cegamos a identidade da imagem para reduzir o viés do investigador e melhorar o rigor científico15.
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Protocol
Estudos em animais são realizados seguindo procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Utah.
1. Corrigir larvas
- Em 3 a 7 dias após a fertilização (DPF), eutaniza larvas com metanosulfonato de tricaina (0,03%) e coletar até 15 larvas em um tubo de 2 mL usando uma pipeta de vidro e bomba de pipeta.
- Lave larvas duas vezes com 1 mL de salino frio (4 °C) 1x de fosfato tampão de fosfato (PBS) no gelo. Para cada lavagem, remova o máximo de líquido possível do tubo com uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta, e adicione 1 mL de PBS frio ao tubo.
- Remova o máximo de PBS possível usando uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta, e adicione 1 mL de paraformaldeído frio (4°C) 4% de paraformaldeído (PFA) na PBS.
ATENÇÃO: PfA é um irritante e suspeito de carcinógeno. As luvas devem ser usadas ao manusear pfa, e soluções concentradas devem ser manuseadas em um capô de fume químico. - Incubar a 4 °C pelo menos durante a noite (mas até vários meses) com balanço suave.
2. Dissecando tecidos ao redor do fígado
- Remova larvas da PFA enxaguando 3x com 1 mL de PBS frio (4 °C) e balançando por 5 min entre enxágües.
NOTA: Não há problema em manter as larvas enxaguadas na PBS por um dia ou dois a 4 °C. - Pipette várias larvas em PBS em um poço de um prato de vidro de fundo redondo de 9 poços.
- Remova a pele ao redor do fígado.
- Use fórceps finos para segurar larvas nas costas (barriga para cima), agarrando-se em ambos os lados da cabeça o mais suavemente possível. Em seguida, use fórceps muito finos em sua outra mão para agarrar a pele apenas sobrepostando o coração.
- Puxe a pele para baixo diagonalmente em direção à cauda do peixe e ao fundo do prato no lado esquerdo ou direito do peixe. Repita para o outro lado (lado direito ou esquerdo).
- Continue agarrando retalhos de pele e puxando para baixo/para trás até que toda a pele e melanoforos sobrepostas ou perto do fígado tenham sido removidos.
- Retire a gema, se estiver presente.
- Para larvas de 5-6 dpf, levante a gema em uma peça segurando o peixe com fórceps finos nas costas e usando os fórceps muito finos para cutucar a gema suavemente.
- Para larvas de 3 a 4 dpf, raspe a gema em pedaços. Segure o peixe com fórceps finos nas costas e use os fórceps muito finos para acariciar a gema, começando pelo lado ventral.
- Coloque larvas dissecadas em PBS frio fresco suspito usando uma pipeta de vidro e bomba de pipeta.
3. Imagem
- Para montar larvas, despeje alguns mL de 3% de celulose metila na tampa de uma placa de Petri de plástico limpo.
- Use uma pipeta de vidro e uma bomba de pipeta para adicionar larvas à celulose de metila, adicionando o mínimo de PBS com as larvas possível.
- um microscópio dissecando em baixa ampliação, use fórceps finos para orientar os peixes para que eles estejam deitados no lado direito, de frente para a esquerda.
NOTA: Certifique-se de que os peixes estão orientados perfeitamente ao seu lado ou as medidas hepáticas podem não ser precisas. - Tire uma foto de cada peixe.
- Confirme que o peixe a ser fotografado está alinhado perfeitamente, com um olho diretamente em cima do outro olho. Se necessário, use fórceps finos para tocar levemente na cabeça ou na cauda do peixe para ajustar a orientação. Se a cauda do peixe estiver dobrada, remova a cauda beliscando-a com força com fórceps para removê-la para que o peixe fique liso.
- Amplie para alta ampliação e concentre-se no fígado, certificando-se de que o contorno do fígado é claramente visível.
- Tire uma foto e salve o arquivo.
- Repita para todos os peixes, certificando-se de que a ampliação é a mesma para cada imagem.
- Tire uma foto de um micrômetro usando a mesma ampliação (ver Figura 2H).
4. Análise de Imagens
- Meça a área do fígado de cada peixe usando software de processamento de imagens.
- Cegar todas as imagens hepáticas para evitar o viés do investigador em potencial e promover o rigor científico15. Esta etapa pode ser feita manualmente por outro membro do laboratório ou usando um programa de computador (Material Suplementar). Renomear arquivos aleatoriamente e criar um "arquivo de randomização" contendo uma lista dos nomes de arquivos originais e nomes de arquivos cegos correspondentes.
- Abra arquivos randomizados em ordem, começando pelo arquivo 1.
- Escolha a ferramenta de seleções de mão livre e esboce cada fígado.
- Pressione ctrl-M para medir a área de cada fígado.
- Para quaisquer fígados que não podem ser medidos com precisão, insira uma medição do espaço reservado (muito pequena ou muito grande, para que possa ser facilmente excluída mais tarde).
- Salve as medidas em um arquivo de texto ("arquivo de medições").
- Descego e analise dados
- Abra "arquivo de medidas" e "arquivo de randomização" em um programa de planilha.
- Insira uma nova coluna no "arquivo de medidas" e adicione os nomes originais dos arquivos para os arquivos cegos, usando o "arquivo de randomização". Salve este arquivo como "arquivo de medidas não cegadas".
- Classificar dados pelo nome do arquivo original.
- Certifique-se de excluir quaisquer medidas hepáticas para as quais as imagens foram inadequadas (ver Figura 2A-G).
- Se necessário, converta valores de medição em escala desejada (mm2,por exemplo).
- Abra a barra de escala no software de processamento de imagens.
- Use a ferramenta de linha reta para medir 1 mm na barra de escala. O software de processamento de imagens irá medir nas mesmas unidades que os fígados (pixels), dando um fator de conversão.
- Use o fator de conversão para converter medidas no "arquivo de medições não cegadas".
- Usando o programa de planilha ou colando dados em um software científico de gráficos e estatísticas, determine o desvio médio e padrão e calcule os valores p.s.
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Representative Results
Zebrafish transgênico expressando β-catenina ativada com hepatocyte(Tg(fabp10a:pt-β-cat)zebrafish) 3 e irmãos de controle não transgênicos foram eutanizados a 6 dpf e a área hepática foi quantificada usando microscopia de campo brilhante e software de processamento de imagens. Zebrafish transgênico aumentaram significativamente o tamanho do fígado (0,0006 cm2) em comparação com seus irmãos não transgênicos (0,0004 cm2, p < 0,0001; Figura 1).
Figura 1: Análise de tamanho do fígado de 6 dpf (dias após a fertilização) zebrafish. (A-B) Imagem representativa de 6 dpf larvas de zebrafish não transgênicas, que mostra posição natural e forma de fígado sobrepostando o intestino. A área hepática foi delineada em(B). Barras de escala = 0,1 mm.(C-D) Imagem representativa de brightfield de 6 dpf larvas transgênicas de zebrafish expressando b-catenina ativada por hepatocyte (ABC), mostrando fígado aumentado. A área hepática foi delineada em(D). Barras de escala = 0,1 mm.(E) Gráfico mostrando medidas de tamanho do fígado (média ± desvio padrão) de 6 dpf larvas de zebrafish não transgênicas (Non-Tg) e larvas transgênicas de zebrafish expressando b-catenina ativada específica de hepatocito (ABC). As amostras foram comparadas usando teste t não emparelhado. p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Exemplos de imagens inadequadas e micrômetros. (A-G) Imagens representativas de fígados larvais que devem ser excluídos da análise. Barras de escala = 0,1 mm.(A) Larva com pele cobrindo o fígado. (B)Larva com gema obscurecendo o fígado. (C) Larva com partes do fígado arrancadas. (D) Larva com fígado deslocado e caindo. (E) Larva com fígado perdido. (F) Larva com contorno hepático que é difícil de identificar porque a imagem é borrada/fora de foco. (G) Larva com posicionamento inadequado. Os dois olhos não estão alinhados diretamente em cima um do outro. (H) Imagem do micrômetro, usada para gerar barras de escala e converter medições de software de processamento de imagens de pixels para cm2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A quantificação do tamanho do fígado é crucial em estudos que visam entender o desenvolvimento do fígado, a regeneração e a oncogênese. O protocolo descrito aqui é uma técnica relativamente rápida, fácil e barata para quantificação do tamanho do fígado em zebrafish larval. Exercitar a cautela adequada ao realizar certos aspectos do protocolo pode ajudar no aumento da precisão dos resultados e diminuição da frustração.
A fixação adequada das larvas é crucial para obter amostras biológicas bem preservadas e prevenir sua desintegração. Diluição da solução PFA de 4% pode ocorrer quando o PBS não é removido completamente antes da adição de PFA às larvas enxaguadas. Usar soluções PFA bem feitas e eliminar toda ou a maioria da solução PBS antes da adição da PFA é útil para resolver essa questão.
Embora rápida e fácil de executar após muita prática, a técnica de dissecção requer destreza manual substancial. Ao dissecar, é crucial remover a pele e a gema completamente acima do fígado de tal forma que todo o fígado esteja exposto. A não realização disso pode resultar em imagens onde a visão do limite do fígado é obscurecida(Figura 2A,B). Movimentos não qualificados e vigorosos durante a dissecação podem levar a beliscar partes do fígado (Figura 2C) ou afrouxamento de apegos hepáticos, resultando no fígado sendo deslocado (Figura 2D) ou faltando inteiramente(Figura 2E). Os usuários devem colocar um número adequado de horas para aprimorar suas habilidades dissecando em amostras de prática antes de passar para amostras experimentais.
Durante a montagem, a pele acima do fígado foi removida, aumentando a probabilidade de o fígado cair durante os degraus subsequentes. Para evitar essa possibilidade, movimentos suaves de pipetting devem ser empregados durante esse processo.
Durante a aquisição de imagens usando o microscópio brightfield, é crucial que imagens de boa qualidade sejam tiradas. Imagens embaçadas e fora de foco dificultarão a avaliação do verdadeiro limite do fígado (Figura 2F). Como este método envolve medir a área de superfície do lobo esquerdo do fígado, é crucial que a larva seja orientada bem para o lado e não inclinada(Figura 2G). Certifique-se de que ambos os olhos da larva estão alinhados (um olho cobrindo a vista do outro). Ao medir a área de superfície usando software de processamento de imagens, é importante aproximar o limite o mais próximo possível do contorno real do fígado, de modo a evitar discrepâncias de medição. Exclua qualquer imagem em que o fígado não possa ser medido com precisão(Figura 2A-G). No entanto, tenha em mente que a exclusão dos fígados pode distorcer os dados, já que fígados maiores são mais propensos a serem interrompidos do que fígados menores.
Uma das limitações deste protocolo é que ele se aplica apenas a larvas fixas. Métodos alternativos como a microscopia de fluorescência podem ser usados para medir o tamanho do fígado em larvas vivas expressando repórteres fluorescentes específicos de hepatocyte5,7,10. Esses métodos alternativos permitem que medidas sequenciais sejam feitas no mesmo animal, e também são mais rápidas, uma vez que não requerem fixação ou dissecação dos tecidos que sobrepõem o fígado. As vantagens deste protocolo em comparação com a microscopia de fluorescência em animais vivos são: 1) mais flexibilidade em relação a quando os fígados são medidos, pois os zebrafish podem ser mantidos fixamente por semanas ou meses antes de fotografá-los; 2) nenhuma exigência para incorporar um repórter fluorescente, que pode ser complicado ao lidar com mutantes homozigosos; e 3) aplicabilidade das etapas 1 e 2 para outros experimentos, incluindo a coloração da imunofluorescência ou em estudos de hibridização situ. Usamos ambos os métodos, dependendo da aplicação específica. Por exemplo, normalmente usamos imagens ao vivo e repórteres específicos de hepatocyte para triagem3de alto nível , e acompanhamento em potenciais compostos de impacto usando o protocolo descrito aqui3.
Este protocolo leva apenas a área da superfície em conta para quantificação do tamanho do fígado, para que não detecte alterações no metabolismo celular ou morfologia, nem diferencie entre aumentos no número celular e aumento saque no tamanho celular. Para atender a essa limitação, ensaios complementares para avaliar a esteatose16, histologia6, celular número8,11, tamanho celular3,17, proliferação3,18, e/ou apoptose19 podem ser realizados.
Outra limitação deste protocolo é que ele assume que o aumento ou diminuição na área de superfície do lobo do fígado esquerdo refletem as mudanças na área da superfície e no volume do fígado como um todo. Essa suposição pode não se aplicar quando o crescimento do fígado não é uniforme. Para examinar a forma hepática e verificar se há aumentos não simétricos no crescimento do fígado, fazemos rotineiramente microscopia de fluorescência de folha de luz8 ou microscopia confocal3 em nossos modelos transgênicos. A microscopia de fluorescência da folha de luz pode ser usada para quantificar diretamente o volume do fígado larval8. Em zebrafish transgênicos expressando Yap1 específico de hepatocito, a área hepática e o volume do fígado foram igualmente aumentados em comparação com os irmãos de controle não transgênicos8.
A técnica de dissecção descrita aqui pode ser combinada com a coloração de imunofluorescência, linhas de repórter fluorescentes específicas de células e/ou outras técnicas de rotulagem para estudar outros aspectos do desenvolvimento do fígado além do tamanhodofígado3,19,20. Como este protocolo de dissecção também expõe o intestino e o pâncreas, pode ser útil para estudos de outros órgãos viscerais também.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de reconhecer Maurine Hobbs e o Centralizado Zebrafish Animal Resource (CZAR) da Universidade de Utah por fornecer maçaria de zebrafish, espaço de laboratório e equipamentos para realizar partes desta pesquisa. A expansão do CZAR é apoiada em parte pela subvenção do NIH # 1G20OD018369-01. Também gostaríamos de agradecer a Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum e o Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility por cuidados com zebrafish. Gostaríamos de agradecer a Kenneth Kompass por ajuda com a programação R. Este trabalho foi financiado em parte por subsídios da Huntsman Cancer Foundation (em conjunto com a concessão P30 CA042014 concedida ao Huntsman Cancer Institute) (KJE) e NIH/NCI R01CA22570 (KJE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
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