Summary
Este artículo presenta procedimientos experimentales para evaluar las deficiencias de memoria en ratones epilépticos inducidos por pilocarpina. Este protocolo se puede utilizar para estudiar los mecanismos fisiofitosiológicos del deterioro cognitivo asociado a la epilepsia, que es una de las comorbilidades más comunes en la epilepsia.
Abstract
El deterioro cognitivo es una de las comorbilidades más comunes en la epilepsia del lóbulo temporal. Para recapitular el deterioro cognitivo asociado a la epilepsia en un modelo animal de epilepsia, generamos ratones epilépticos crónicos tratados con pilocarpina. Presentamos un protocolo para tres pruebas de comportamiento diferentes utilizando estos ratones epilépticos: localización de objetos nuevos (NL), reconocimiento de objetos nuevos (NO) y pruebas de separación de patrones (PS) para evaluar el aprendizaje y la memoria de lugares, objetos y contextos, respectivamente. Explicamos cómo configurar el aparato conductual y proporcionar procedimientos experimentales para las pruebas NL, NO y PS después de una prueba de campo abierto que mide las actividades de locomotora basal de los animales. También describimos las ventajas técnicas de las pruebas NL, NO y PS con respecto a otras pruebas de comportamiento para evaluar la función de la memoria en ratones epilépticos. Por último, analizamos las posibles causas y soluciones para que los ratones epilépticos no puedan hacer 30 s de buen contacto con los objetos durante las sesiones de familiarización, lo que es un paso crítico para las pruebas de memoria exitosas. Por lo tanto, este protocolo proporciona información detallada sobre cómo evaluar las deficiencias de memoria asociadas a la epilepsia mediante ratones. Las pruebas NL, NO y PS son ensayos simples y eficientes que son apropiados para la evaluación de diferentes tipos de memoria en ratones epilépticos.
Introduction
La epilepsia es un trastorno crónico caracterizado por convulsiones recurrentes espontáneas1,,2,,3. Debido a que las convulsiones repetitivas pueden causar anomalías estructurales y funcionales en el cerebro1,2,3, la actividad convulsiva anormal puede contribuir a la disfunción cognitiva, que es una de las comorbilidades asociadas a la epilepsia más comunes4,5,6. Contrariamente a los eventos de convulsiones crónicas, que son transitorios y momentáneos, los deterioros cognitivos pueden persistir a lo largo de la vida de los pacientes epilépticos, deteriorando su calidad de vida. Por lo tanto, es importante entender los mecanismos fisiofitosiológicos del deterioro cognitivo asociado a la epilepsia.
Se han utilizado varios modelos animales experimentales de epilepsia para demostrar los déficits de aprendizaje y memoria asociados con la epilepsia crónica7,8,9,10,11,12. Por ejemplo, el laberinto de agua de Morris, el acondicionamiento contextual del miedo, el tablero de agujeros, la localización de objetos novedosos (NL) y las pruebas de reconocimiento de objetos novedosos (NO) se han utilizado con frecuencia para evaluar la disfunción de la memoria en la epilepsia del lóbulo temporal (TLE). Debido a que el hipocampo es una de las regiones primarias en las que TLE muestra patología, las pruebas conductuales que pueden evaluar la función de memoria dependiente del hipocampo a menudo se seleccionan preferentemente. Sin embargo, dado que las convulsiones pueden inducir neurogénesis hipocampal aberrante y contribuir al deterioro cognitivo asociado a la epilepsia10,los paradigmas conductuales para probar la función neuronal del recién nacido dengunato (es decir, la separación del patrón espacial, PS)8,,13 también pueden proporcionar información valiosa sobre los mecanismos celulares de las deficiencias de memoria en la epilepsia.
En este artículo, demostramos una batería de pruebas de memoria, NL, NO y PS, para ratones epilépticos. Las pruebas son simples y de fácil acceso y no requieren un sistema sofisticado.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad Católica de Corea y se llevaron a cabo de conformidad con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Publications No. 80-23).
1. Prueba de ubicación de objetos novedosos (NL)
- Preparar ratones epilépticos C57BL/6 o transgénicos 4–6 semanas después de la inyección de pilocarpina.
NOTA: Las convulsiones agudas fueron inducidas por inyección intraperitoneal (IP) de pilocarpina, siguiendo el protocolo detallado en nuestro informe anterior14. - Transfiera los ratones epilépticos de la sala de cría a la sala de comportamiento un día antes de que comiencen las pruebas de comportamiento. Permita que los ratones se habituan durante al menos 12 horas durante la noche.
- En la sala de comportamiento, separe los ratones individuales en jaulas nuevas para una sola vivienda. Escriba la información de cada animal en la tarjeta de jaula y mantenga a los animales en las mismas jaulas durante las pruebas de comportamiento. Múltiples jaulas se pueden transferir simultáneamente utilizando un carro.
- Al día siguiente, comience 3 días de sesiones de habituación (H1–H3) en la mañana temprano. Aclimatar a los animales a la luz baja en sus jaulas domésticas durante al menos 30 minutos.
- Preparar una caja de campo abierto con dimensiones exteriores de 44 x 44 x 31 cm y dimensiones interiores de 43 x 43 x 30,5 cm. En el día 1 de la habituación (H1), coloque un iluminamínómetro en el centro de la caja de campo abierto y ajuste la iluminancia a 60 lux.
- Rocíe el suelo y las paredes de la caja de campo abierto con un 70% de etanol y limpie con una toalla de papel limpia para eliminar posibles señales olfativas. A continuación, espere al menos 1 min hasta que el alcohol residual se haya secado por completo.
- Evalúe la actividad locomotora de cada ratón realizando una prueba de campo abierto.
- Para grabar y realizar un seguimiento del comportamiento de cada ratón experimental, utilice el software de seguimiento de vídeo de comportamiento animal (consulte Tabla de materiales).
- Una vez abierto el software de seguimiento de vídeo, calibre el tamaño de la caja de campo abierto. A continuación, establezca la zona para el seguimiento. Establezca 3 s de latencia y 15 minutos de tiempo de adquisición para evitar el seguimiento de las manos de un experimentador. Inserte la información sobre cada ratón experimental (grupo, sexo, edad, etc.).
- A continuación, coloque suavemente un ratón experimental en la caja de campo abierto que mira hacia la pared. Para ello, colocándolo en la tapa de la jaula para minimizar el estrés y la ansiedad asociados al manejo. A continuación, suelte el ratón cerca del muro del cuadro de campo abierto que está más lejos de donde estarán los objetos durante la sesión de familiarización (paso 1.9.3.).
NOTA: Una vez que el ratón está en el cuadro de campo abierto, el software de seguimiento del ratón lo detectará automáticamente y comenzará a grabar. Para un seguimiento óptimo de la exploración, la cámara se puede colocar directamente encima de la caja de campo abierto. - Después de 15 minutos de grabación, regrese el animal a su jaula de origen colocándolo en la tapa de la jaula. Limpie la caja de campo abierto con un spray de etanol al 70% y limpie con una toalla de papel limpia entre ensayos. Restaure la luz brillante y mida la distancia total del animal movida utilizando el software de seguimiento de vídeo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Abra el software de seguimiento de vídeo y los clips de vídeo. A continuación, haga clic en Análisis para calcular la distancia total movida en función de la calibración del tamaño del cuadro de campo abierto.
- En el día 2 y el día 3, realice las sesiones de habituación (H2, H3) repitiendo los pasos 1.3 a 1.7.
- En el día 4, realice la sesión de familiarización (F1).
- En la luz tenue, coloque cada ratón en el campo abierto vacío durante 3 minutos. Después de esa breve rehabilitación, devuelve al animal a su jaula.
- Durante la habituación, limpie a fondo los objetos con un 70% de etanol y límpielos con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
- Coloque dos objetos idénticos (muñecas de goma, objeto A) en la arena de campo abierto a 5 cm de distancia de las paredes contiguas. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Introducir el ratón experimental en el cuadro de campo abierto, frente a la pared más alejada de los objetos.
- Permita la exploración gratuita durante 20 minutos y mida manualmente el tiempo dedicado a explorar ambos objetos utilizando dos cronómetros. Una vez que el ratón alcanza el tiempo mínimo de exploración (30 s) para ambos objetos, detenga la sesión de F1 y transfiera al animal a su jaula de origen. Si el ratón no puede explorar los objetos durante 30 s en un plazo de 20 minutos, quite el mouse del cuadro de campo abierto y excluya de otras sesiones.
- Después de que el animal sea retirado de la caja de campo abierto, limpie a fondo el suelo y las paredes de la caja con un 70% de spray de etanol y límpielos con una toalla de papel.
NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto.
- En el día 5, realice la sesión de prueba de NL.
- Transfiera el ratón de su jaula de inicio a la zona de campo abierto para su rehabilitación durante 3 min. Luego devuelva el animal a su jaula de origen.
- Durante la habituación, limpie a fondo los objetos con un 70% de etanol y límpielos con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
- Mueva un objeto (muñeca de goma, objeto A) a la posición diagonal, a 5 cm de distancia de las paredes contiguas. Fije el objeto con cinta adhesiva de doble cara. Transfiera el ratón experimental en la tapa de su jaula a la zona de campo abierto y colóquelo frente a la pared de la caja de campo abierto.
NOTA: Contrate la ubicación del objeto movido para reducir cualquier preferencia innata potencial para una dirección determinada. Por ejemplo, cambie la ubicación del objeto preferido de la sesión de familiarización para la mitad de los animales experimentales, y para el resto de los animales, mueva el objeto menos preferido de la sesión de familiarización. - Permita 10 minutos de exploración y grabación gratuitas con un sistema de seguimiento de vídeo. Mida el tiempo dedicado a explorar cada objeto utilizando dos cronómetros y calcule la relación de discriminación como
NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto. - Coge la cola del ratón experimental y colóquelo en la tapa de su jaula para transferirla a su jaula de origen. Durante 3 días (días 6–8), deje reposar el ratón con acceso gratuito a alimentos y agua.
- Una vez que el animal es retirado de la caja de campo abierto, limpie a fondo el suelo y las paredes de la caja con un 70% de spray de etanol y limpie con una toalla de papel.
2. Prueba de reconocimiento de objetos novedosas (NO)
- En el día 9, realice una sesión de habituación de 15 minutos repitiendo los pasos 1.2–1.7.
- En el día 10, realice la sesión de familiarización (F1).
- Con poca luz, coloque el ratón en el campo abierto vacío durante 3 minutos. Después de rehabilitar el ratón a la zona de campo abierto, devuélvalo temporalmente a su jaula de origen.
- Durante la habituación, limpie a fondo los objetos con un 70% de etanol y limpie con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
- Coloque dos objetos idénticos (tubos de plástico de 50 ml llenos de 40 ml de agua, objeto B) en el campo abierto a 5 cm de distancia de las paredes adyacentes. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Introducir el ratón experimental en el cuadro de campo abierto frente a la pared más alejada de los objetos.
- Como el animal está expuesto a los dos objetos diferentes (tubo de plástico de 50 ml lleno de 40 ml de agua, objeto B; tarro de Coplin de vidrio, objeto C) en la prueba NO, contrarresta el objeto durante la sesión F1. Por ejemplo, presente dos objetos idénticos (tarros de Coplin de vidrio, objeto C) para la mitad de los animales del grupo.
- Permita la exploración gratuita durante 20 minutos y mida manualmente el tiempo dedicado a explorar ambos objetos utilizando dos cronómetros. Una vez que el ratón alcanza el tiempo mínimo de exploración (30 s) para ambos objetos, detenga la sesión de F1 y transfiera al animal a su jaula de origen. Si el ratón no puede explorar los objetos durante 30 s en un plazo de 20 minutos, elimínelo del cuadro de campo abierto y excluya de otras sesiones.
- Después de que el animal sea retirado de la caja de campo abierto, limpie a fondo el suelo y las paredes de la caja con un 70% de spray de etanol y límpielos con una toalla de papel.
NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto.
- Al día siguiente (día 11), realice la sesión de prueba NO.
- Transfiera el ratón de su jaula de origen al campo abierto para la rehabilitación durante 3 minutos, y luego devuelva al animal a su jaula de origen.
- Durante la habituación, limpie a fondo los objetos con un 70% de etanol y limpie con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
- Sustituya un objeto (tubo de plástico de 50 ml lleno con 40 ml de agua, objeto B) por otro objeto (tarro de Coplin de vidrio, objeto C) a 5 cm de distancia de las paredes adyacentes. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Transfiera el ratón experimental en la tapa de la jaula al campo abierto y colóquelo frente a la pared. Contrapeso de los objetos presentados juntos durante la prueba NO. Por ejemplo, reemplace un frasco de Coplin de vidrio (objeto C) por un tubo de plástico de 50 ml lleno de 40 ml de agua (objeto B) para los ratones expuestos a los dos frascos coplin de vidrio (objeto C) durante la sesión de familiarización.
NOTA: También se puede realizar una contrapeso de la ubicación del objeto reemplazado para reducir la preferencia innata potencial para una dirección determinada. Por ejemplo, para cada cohorte de los animales expuestos al conjunto de dos objetos (objeto B u objeto C), cambie el objeto preferido en la sesión de familiarización para la mitad de los animales experimentales, y para el resto de los animales, reemplace el objeto menos preferido en la sesión de familiarización. - Permita 10 minutos de exploración gratuita y grabarlo usando un sistema de seguimiento de vídeo. Mida el tiempo dedicado a explorar cada objeto utilizando dos cronómetros y calcule la relación de discriminación.
NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto. - Agarre la cola del ratón experimental y colóquelo en la tapa de la jaula para transferirla a su jaula de origen. Durante 3 días (días 12–14), deje reposar el ratón con libre acceso a alimentos y agua.
- Una vez que el animal es retirado de la caja de campo abierto, limpie a fondo el suelo y las paredes de la caja de campo abierto con un 70% de spray de etanol y limpie con una toalla de papel.
3. Prueba de separación de patrones (PS)
- En el día 15, realice la primera sesión de familiarización (F1) para la prueba PS.
- Transfiera el ratón de su jaula de origen al área de campo abierto para su rehabilitación durante 3 minutos, y luego devuélvalo a su jaula de origen.
- Durante la habituación, limpie a fondo los objetos y la placa de suelo cuadriculada con un 70% de etanol y limpie con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
- Coloque la placa de suelo (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) con la rejilla ancha (5,5 x 5,5 cm) en la caja de campo abierto y coloque dos objetos idénticos (frascos T de plástico llenos de 50 ml de agua, objeto D) en el campo abierto a 5 cm de distancia de las paredes adyacentes. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Introducir el ratón experimental en el cuadro de campo abierto frente a la pared más alejada de los objetos.
- Como el animal está expuesto a dos objetos diferentes (frasco T de plástico lleno con 50 ml de agua, objeto D; botella de vidrio, objeto E) en la prueba PS, contrarresta el objeto durante las sesiones F1 y F2. Por ejemplo, presente dos objetos idénticos (botellas de vidrio, objeto E) en el amplio suelo de rejilla para la mitad de los animales del grupo.
- Permita la exploración gratuita durante 20 minutos y mida manualmente el tiempo dedicado a explorar ambos objetos utilizando dos cronómetros. Una vez que el ratón alcanza el tiempo mínimo de exploración total (30 s) para ambos objetos, detenga la sesión de F1 y transfiera al animal a su jaula de origen. Si el ratón no puede explorar los objetos durante 30 s en un plazo de 20 minutos, elimínelo del cuadro de campo abierto y excluya de otras sesiones.
NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto. - Después de completar la primera sesión de familiarización (F1), limpie a fondo los objetos y la placa de suelo con un spray de etanol al 70% y retírelos de la caja de campo abierto.
- Al día siguiente (día 16), realice la segunda sesión de familiarización (F2) para la prueba PS.
- Transfiera el ratón de su jaula de origen a la zona de campo abierto para su rehabilitación durante 3 minutos, y luego devuelva al animal a su jaula de origen.
- Durante la habituación, limpie a fondo los objetos y la placa de suelo cuadriculada con un 70% de etanol y limpie con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
- Coloque la placa de suelo (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) con la rejilla estrecha (2,75 x 2,75 cm) en la caja de campo abierto y coloque dos objetos idénticos (botellas de vidrio, objeto E) en el campo abierto a 5 cm de distancia de las paredes contiguas. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Introducir el ratón experimental en el cuadro de campo abierto frente a la pared más alejada de los objetos.
- Para el contrapeso, presente dos objetos idénticos (frascos T de plástico llenos de 50 ml de agua, objeto D) en el suelo estrecho de la rejilla.
- Permita la exploración gratuita durante 20 minutos y mida manualmente el tiempo dedicado a explorar ambos objetos utilizando dos cronómetros. Una vez que el ratón alcanza el tiempo mínimo de exploración total (30 s) para ambos objetos, detenga la sesión F2 y transfiera el animal a su jaula de origen. Si el ratón no puede explorar los objetos durante 30 s en un plazo de 20 minutos, elimínelo del cuadro de campo abierto y excluya de otras sesiones.
NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto. - Después de completar la segunda sesión de familiarización (F2), limpie a fondo los objetos y la placa de suelo con un spray de etanol al 70% y retírelos de la caja de campo abierto.
- Al día siguiente (día 17), realiza la sesión de prueba pS.
- Transfiera el ratón de su jaula de origen al área de campo abierto para su rehabilitación durante 3 minutos, y luego devuélvalo a su jaula de origen.
- Durante la habituación, limpie a fondo los objetos y la placa de suelo cuadriculada con un 70% de etanol y limpie con una toalla de papel. Espere al menos 1 min para que el alcohol residual se seque por completo.
- Coloque la placa de suelo con la rejilla estrecha (2,75 x 2,75 cm) en la caja de campo abierto y coloque dos objetos diferentes (frasco T de plástico lleno de 50 ml de agua, objeto D; botella de vidrio, objeto E) en la placa de suelo a 5 cm de distancia de las paredes adyacentes. Fije los objetos con cinta adhesiva de doble cara. Transfiera el ratón experimental en la tapa de la jaula a la zona de campo abierto y colóquelo frente a la pared.
- Contrapeso de los objetos presentados juntos durante la prueba PS. Por ejemplo, coloque cada objeto (objeto D, objeto E) en el suelo de cuadrícula estrecho para que el objeto E sea un objeto novedoso en este contexto. También se puede realizar un contrapeso de la ubicación del objeto D o del objeto E (un objeto novedoso en el patrón de suelo estrecho) para reducir el potencial de una preferencia innata para una dirección determinada. Por ejemplo, reemplace el objeto preferido de la segunda sesión de familiarización para la mitad de los animales experimentales, y para el resto de los animales, reemplace el objeto menos preferido de la segunda sesión de familiarización.
- Permita 10 minutos de exploración y grabación gratuitas utilizando un sistema de seguimiento de vídeo. Mida el tiempo dedicado a explorar cada objeto utilizando dos cronómetros y calcule la relación de discriminación.
NOTA: Mida el tiempo cuando el ratón toque los objetos con sus bigotes, hocico o patas delanteras. No cuantifique como tiempo exploratorio ningún comportamiento en el que el hocico del animal no apunte hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto. - Agarre la cola del ratón experimental y colóquelo en la tapa de la jaula para transferirla a su jaula de origen.
4. Tinción violeta cresil
- Después de completar todas las pruebas conductuales, anestesia al animal inyectando un cóctel (4:0.5) de ketamina (50 mg/ml) y xilazina (23,3 mg/ml) disuelto en solución salina a una dosis de 110 ml/kg de peso corporal (IP; 1 ml de jeringa; 26 G aguja). Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a un pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo.
- Una vez que el animal está profundamente anestesiado, realizar perfusión transcardial con 4% de paraformaldehído para fijar el cerebro15.
- Una vez finalizada la perfusión transcardial, decapita al animal con un par de tijeras15. Luego, retire el cráneo usando un par de tijeras de iris para exponer el cerebro. Después de aislar el cerebro, postfijo en 4% de paraformaldehído durante la noche, seguido de crioprotección en 30% sacarosa en 0.01 M solución salina tamponada fosfato.
- Haga secciones coronales (30 m) a partir del cerebro congelado con un criostato.
- Montar los tejidos cerebrales en diapositivas y realizar una serie de pasos de hidratación de 100% etanol al agua del grifo mediante el lavado durante 3 minutos secuencialmente en 100%, 95%, 90%, 80%, 70% etanol.
- Incubar los portaobjetos en solución violeta de cresil al 0,1% durante 15 min.
- Elimine la mancha excesiva sumergiendo los portaobjetos en 95% de etanol/0.1% ácido acético glacial, y luego deshidrate los tejidos con soluciones de 100% etanol, 50% etanol/50% xileno y 100% xileno.
- Cubra los portaobjetos de tejido utilizando un medio de montaje de xileno disponible comercialmente.
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Representative Results
En la Figura 1se muestra un cronograma experimental general y una configuración para evaluar la función cognitiva. Seis semanas después de la introducción de las convulsiones agudas inducidas por la pilocarpina, los ratones fueron sometidos a las pruebas de NL, NO y PS en ese orden separados por períodos de descanso de 3 días entre las pruebas (Figura 1A). Para la prueba NL, se colocaron dos objetos idénticos en el campo abierto durante la sesión de familiarización (F1) y al día siguiente, un objeto se movió a una nueva ubicación. En la prueba NO, un objeto se reemplazó por uno nuevo durante la sesión de prueba. Para la prueba PS, las dos sesiones de familiarización (F1, F2) introdujeron combinaciones de diferentes patrones y objetos de cuadrícula de suelo. A continuación, el día de la prueba, se colocó un objeto de cada sesión de familiarización en el patrón de suelo de rejilla estrecha, lo que hizo que un objeto fuera novedoso en el contexto del patrón de suelo de rejilla estrecha (Figura 1B). La caja de campo abierto se puede colocar en un escritorio directamente debajo de una cámara de dispositivo acoplada a carga y rodeada por una cortina negra para evitar señales visuales innecesarias (Figura 2A). Los objetos de muestra eran materiales fáciles de limpiar de un tamaño similar o ligeramente más grandes que un ratón(Figura 2B). Las combinaciones de objetos debían ser preseleccionadas para confirmar que no había ninguna preferencia significativa entre los dos objetos presentados juntos (Figura 2C). Las placas de suelo con diferentes patrones se colocaron en la caja de campo abierto para proporcionar señales experimentales adicionales en la prueba PS (Figura 2B). Una vez que un ratón fue introducido en el cuadro de campo abierto, un sistema de seguimiento de vídeo realizó un seguimiento de su trayectoria para analizar su distancia total de locomoción (Figura 2D). Seis semanas después de una inyección de pilocarpina, los ratones epilépticos mostraron una reducción significativa en la relación de discriminación en la prueba de NL, demostrando deterioro de la memoria espacial (Figura 3). Además, en la prueba NO, que es una prueba para la memoria de reconocimiento de objetos, los ratones epilépticos mostraron una función de memoria deteriorada en comparación con los controles falsos. Cuando se evaluó la función neuronal del recién nacido con la prueba PS, los ratones epilépticos tuvieron dificultades para reconocer el objeto novedoso en un contexto con múltiples señales. Como experimentos de control, se evaluaron la actividad de la locomotora y la latencia para alcanzar los criterios de exploración durante la sesión de familiarización (Figura 3). La medición de la actividad locomotora mostró un aumento significativo de los animales epilépticos(Figura 3C),en línea con los informes anteriores16,17, mientras que la motivación para explorar los objetos fue comparable entre animales falsos y epilépticos (Figura 3D). Nuestras tasas de abandono deserción fallando los criterios de exploración en la sesión de familiarización fueron del 17,4%, 18,2%, 0% para la prueba NL, NO y PS, respectivamente, lo que sugiere que los animales se acostumbraron a los entornos experimentales durante la serie de ensayos conductuales. Finalmente, evaluamos la muerte de la célula del hipocampo después del estado epiléptico inducido por pilocarpina usando tinción violeta de sisil para confirmar el daño neuronal inducido por convulsiones (Figura 4). Los animales tratados con pilocarpina demostraron células piknóticas en el hilus y en el subcampo CA3 del hipocampo, a diferencia de los controles falsos (Figura 4).
Figura 1: Presentación esquemática de la batería de prueba conductual. (A) Un dibujo esquemático de la programación de comportamiento para la ubicación de objetos nuevos (NL), el reconocimiento de objetos novedosos (NO) y las pruebas de separación de patrones (PS) para ratones falsos y epilépticos. (B) Imágenes representativas de los arreglos de objetos y placas de suelo para las pruebas NL, NO y PS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Aparato conductual para la evaluación de la función cognitiva. (A) Una visión general de la configuración de comportamiento. Una cámara se colocó directamente encima de la caja de campo abierto, que estaba rodeada por la cortina para evitar señales innecesarias. (B) Muestra de objetos para la ubicación de objetos novedosos (NL), el reconocimiento de objetos nuevos (NO) y la prueba de separación de patrones (PS). Para la prueba PS, se insertó una placa de suelo con diferentes patrones, es decir, rejillas anchas y estrechas, en el cuadro de campo abierto para proporcionar señales adicionales. (C) Gráficos que muestran el tiempo explorando cada objeto presentado juntos durante la sesión de prueba NO y PS (n x 7), respectivamente. Tenga en cuenta que no hubo ninguna diferencia significativa en la preferencia entre los dos objetos evaluados por la prueba Mann-Whitney U (para la prueba NO) y la prueba t no parís del estudiante (para la prueba PS). (D) Una imagen que muestra que un sistema de seguimiento de vídeo detectó el ratón experimental en el cuadro de campo abierto. El cuadrado rojo indica la zona preestablecida para realizar un seguimiento de la trayectoria del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Memoria espacial deteriorada y separación de patrones en ratones epilépticos. (A) Una presentación esquemática de las pruebas de ubicación de objetos novedosos (NL), reconocimiento de objetos novedosos (NO) y separación de patrones (PS). Un objeto novedoso se indica como un círculo rojo. (B) Gráficos que muestran la relación de discriminación en las pruebas NL, NO y PS entre ratones falsos (n a 8) y epilépticos (n a 10). Tenga en cuenta que los ratones epilépticos demostraron deficiencias significativas en las pruebas NL, NO y PS, que prueban la función de memoria para lugares, objetos y contextos, respectivamente. *p < 0.05 por Mann-Whitney U prueba para la prueba NL. *p < 0.05 por la prueba t no parída del estudiante para las pruebas NO. *p < 0.05 por la prueba t no parísada del estudiante con la corrección de Welch para la prueba PS. (C) Un gráfico que muestra la actividad locomotora de ratones falsos (n a 8) y epilépticos (n a 10). Tenga en cuenta que los ratones epilépticos demostraron un aumento de la locomoción, de acuerdo con los informes anteriores. *p < 0.05 por la prueba t no parída del estudiante. (D) Gráficos que muestran la latencia a los criterios de 30 s en la sesión de familiarización de las pruebas NL, NO y PS. Tenga en cuenta que no hubo diferencias en la motivación para explorar los objetos entre los ratones falsos (n x 8) y epilépticos (n a 10). Los datos se presentan como la media del error estándar de la media (SEM). SE - estado epiléptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Muerte neuronal en el hipocampo después del estado epiléptico (SE) inducido por pilocarpina. Imágenes representativas de los grupos epilépticos (A) y( B) 58 días después de la inyección de pilocarpina. Las imágenes magnificadas muestran el subcampo hilus (a, d), CA1 (b, e), y CA3 (c, f) del hipocampo, que se indican como cuadrados blancos en las imágenes con bajo aumento. Observe las células pignóticas en el subcampo hilus y CA3 del hipocampo. Barra de escala en la imagen del extremo izquierdo a 200 m, también válida para la imagen inferior; barra de escala en a, b, c a 40 m, también válido para d, e, f, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este trabajo describe procedimientos experimentales para evaluar la función cognitiva en ratones con epilepsia crónica. Muchos paradigmas de prueba de comportamiento diferentes se utilizan para evaluar las funciones de aprendizaje y memoria en ratones18. El laberinto de agua Morris, el laberinto de brazos radiales, el laberinto Y, el acondicionamiento contextual del miedo y las pruebas basadas en objetos son las pruebas de comportamiento más utilizadas y proporcionan resultados confiables. Entre ellos, las pruebas NL, NO y PS son métodos eficientes y simples para evaluar el aprendizaje y la memoria en ratones epilépticos8,,10. Debido a que los ratones epilépticos pueden tener convulsiones espontáneas inesperadas durante las sesiones de comportamiento, es mejor utilizar pruebas conductuales basadas en la inclinación natural de los animales para explorar la novedad sin añadir otros refuerzos positivos o negativos, como los utilizados en tareas motivadas por miedo como el acondicionamiento del miedo, el hambre de la muerte o la natación forzada a mantenerse a flote, lo que puede desencadenar convulsiones recurrentes19,,20. Además, en comparación con otras pruebas conductuales, las pruebas basadas en la novedad son menos estresantes para los animales porque no se requieren sesiones de entrenamiento extensas. Además, las pruebas de comportamiento basadas en la novedad se pueden modificar fácilmente para evaluar diferentes tipos de memoria (es decir, memoria espacial, memoria de reconocimiento o memoria episódica) simplemente cambiando la ubicación del objeto, presentando un objeto novedoso o combinando estímulos adicionales. En conjunto, las pruebas basadas en la novedad, como las pruebas NL, NO y PS, tienen ventajas versátiles para evaluar las funciones cognitivas en ratones epilépticos.
Aunque las pruebas NL, NO y PS son modelos experimentales rápidos y útiles para investigar la función de aprendizaje y memoria en ratones epilépticos, se deben tener en cuenta varios factores al usarlos. Es bien sabido que los ratones epilépticos crónicos muestran una mayor ansiedad por las inyecciones de pilocarpina7,lo que conduce a una marcada disminución en la exploración de objetos durante las sesiones de familiarización. Esta falta de exploración puede causar una interpretación errónea de los resultados de la prueba. Por lo tanto, es importante incluir suficiente habituación en el campo abierto para que los ratones se acostumbre al entorno antes de la sesión de familiarización. Dependiendo de las cepas, los ratones todavía pueden no explorar los objetos durante 30 s dentro de los 20 minutos de la sesión de familiarización, incluso después de 3 sesiones de habituación. En ese caso, agregar otra sesión de habituación con pares adicionales de los objetos en el cuadro de campo abierto podría ayudar a reducir la ansiedad del ratón hacia los objetos. Las cortinas que rodean el cuadro de campo abierto pueden minimizar las señales de la sala externa, lo que permite a los ratones experimentales centrarse en los objetos en el campo abierto. Además, los criterios de exploración deben ser lo suficientemente estrictos como para excluir comportamientos en los que el hocico del animal no apunta hacia el objeto, como sentarse sobre el objeto, pasar por el objeto o descansar con su extremo posterior apuntando hacia el objeto. Por último, aunque puede ser muy raro, pueden ocurrir eventos convulsivos durante las tareas conductuales. En este caso, se recomienda que esos animales sean retirados de nuevas evaluaciones, ya que esto puede ser una posible fuente de sesgo de confusión para la evaluación de la función de memoria.
Como las pruebas NL, NO y PS son experimentos muy sensibles que dependen de la curiosidad natural de los animales por nuevos estímulos, los cambios sutiles pueden afectar el comportamiento exploratorio de los ratones, lo que resulta en relaciones de discriminación no concluyentes21,,22. Por ejemplo, el manejo brusco del ratón, un cambio de ropa de cama justo antes de las tareas conductuales, el tiempo inconsistente de la prueba y la aclimatación insuficiente a la sala de pruebas pueden elevar los niveles de estrés de los animales, causando resultados equívocos de la prueba. Además, se deben considerar cuidadosamente los entornos de prueba alterados, como presentaciones inconsistentes de objetos asimétricos en cada sesión, colocación de jaulas domésticas cerca de la arena experimental o el cambio de la firma olfativa del experimentador para evitar factores adicionales. En la etapa de análisis de datos, las evaluaciones de múltiples experimentadores pueden contribuir a un aumento de las variedades en los resultados conductuales debido a diferentes criterios de comportamiento exploratorio de roedores o usos de cronómetros. En conjunto, estos aspectos también deben tenerse en cuenta para la implementación exitosa de las pruebas NL, NO y PS.
El hipocampo y la región parahippocampal son conocidos por desempeñar un papel único en el procesamiento de la memoria23,,24. Es ampliamente aceptado que la memoria espacial depende en gran medida de la función del hipocampo, que puede ser fácilmente evaluado por la prueba NL23,24. Por otro lado, la memoria de reconocimiento de objetos parece involucrar múltiples regiones cerebrales, incluyendo la corteza perirhinal, la corteza insular y la corteza prefrontal ventromedial, además del hipocampo25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Los ratones epilépticos tratados con pilocarpina han demostrado consistentemente deficiencias del comportamiento en las pruebas de memoria espacial con daño neuronal hipocampal extenso39,40,41,42,mientras que las pruebas de memoria de reconocimiento de objetos han producido resultados controvertidos, con degeneración neuronal variable en las regiones cerebrales parahippocampales10,,41,42,43,44. Estos datos implican que el reconocimiento de objetos puede requerir conexiones de red sofisticadas entre varias regiones cerebrales, a diferencia de la memoria espacial en la que el hipocampo puede desempeñar un papel central. Cuando se evalúan detenidamente los subcampos específicos del hipocampo, se encuentra que las regiones de giro CA1 y CA3/dentato procesan información diferente. Específicamente, se cree que las neuronas CA1 se activan por exposición a elementos similares, mientras que CA3 y el giro dentu están involucrados en la discriminación de objetos similares23,,45. De acuerdo con esa hipótesis, la evidencia emergente sugiere que dentar las neuronas recién nacidas pueden contribuir al rendimiento de separación de patrones45,,46,47. Dado que la neurogénesis aberrante del hipocampo puede ser inducida durante la epileptogénesis10,los ratones epilépticos pueden demostrar un rendimiento deteriorado en la discriminación de experiencias análogas debido a la integración interrumpida de las neuronas recién nacidas en la epilepsia crónica.
En conclusión, describimos cómo evaluar las deficiencias de memoria en ratones epilépticos. Específicamente, proporcionamos protocolos experimentales para tres pruebas de comportamiento, las pruebas NL, NO y PS, que prueban la memoria para lugares, objetos y contextos, respectivamente. Entre los muchos paradigmas de prueba cognitiva disponibles para ratones, las pruebas NL, NO y PS son ensayos cortos bastante simples que enfatizan mínimamente a los animales, lo que los hace óptimos para evaluar la función de la memoria en animales epilépticos sin desencadenar convulsiones recurrentes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Jae-Min Lee por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la National Research Foundation of Korea (NRF) financiadas por el gobierno de Corea (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Sung-shim | Use with the 26 or 30 gauge needle | |
| 70% Ethanol | Duksan | UN1170 | Spray to clean the box and objects |
| black curtain | For avoiding unnecessary visual cues | ||
| Cresyl violet | Sigma | C5042 | For Cresyl violet staining |
| cryotome | Leica | E21040041 | For tissue sectioning |
| double-sided sticky tape | For the firm placement of the objects | ||
| DPX mounting medium | Sigma | 06522 | |
| ethanol series | Duksan | UN1170 | Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions |
| floor plate with narrow grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm | |
| floor plate with wide grid patterns | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm | |
| illuminometer | TES Electrical Electronic Corp. | 1334A | For the measurement of the room lighting (60 Lux) |
| Intensive care unit | Thermocare | #W-1 | |
| ketamine hydrochloride | Yuhan | 7003 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| LED lamp | Lungo | P13A-0422-WW-04 | Lighting for the behavioral test room |
| objects | Rubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle | ||
| open field box | Leehyo-bio | Behavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm | |
| paper towel | Yuhan-Kimberly | 47201 | Use to dry open field box and objects |
| paraformaldehyde | Merck Millipore | 104005 | Make 4% solution |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| ruler | Use to locate the objects in the open field box | ||
| scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Smart system 3.0 | Panlab | Video tracking system | |
| stopwatch | Junso | JS-307 | For the measurement of explorative activities of mice |
| sucrose | Sigma | S9378 | For cryoprotection of tissue sections |
| terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| video camera (CCD camera) | Vision | VCE56HQ-12 | Place the camera directly overhead of the open field box |
| xylazine (Rompun) | Bayer korea | KR10381 | Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion |
| xylene | Duksan | UN1307 | For Cresyl violet staining |
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