Summary
L'imaging vivo dell'esocitosi lisosomica sulle cellule micromodelle consente una quantificazione spaziale di questo processo. La normalizzazione della morfologia tramite micromodelli è uno strumento eccezionale per scoprire le regole generali sulla distribuzione spaziale dei processi cellulari.
Abstract
L'imaging dal vivo della proteina di membrana associata alla vescicola 7 (VAMP7) con etichetta Soluble N-ethylmaleimide-sensitive Attachment protein REceptor (v-SNARE) Proteina della membrana associata alla vescicolo 7 (VAMP7) dalla microscopia a fluorescenza a fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM) è un modo semplice per esplorare la secrezione dal compartimento lisosomiale. Sfruttando la coltura cellulare su superfici micromodellate per normalizzare la forma cellulare, sono stati impiegati una varietà di strumenti statistici per eseguire un'analisi spaziale dei modelli secretori. Utilizzando la funzione K di Ripley e un test statistico basato sulla distanza vicina più vicina (NND), abbiamo confermato che la secrezione dai lisosomi non è un processo casuale, ma mostra un clustering significativo. Da notare, la nostra analisi ha rivelato che gli eventi di esocitosi sono raggruppati anche in aree non di aesione, indicando che le molecole di adesione non sono le uniche strutture che possono indurre punti caldi secretori alla membrana plasmatica. Tuttavia, abbiamo scoperto che l'adesione cellulare migliora il clustering. Oltre alle aree adesive e non aesive definite con precisione, la geometria circolare di questi micromodelli consente l'uso di coordinate polari, semplificando le analisi. Abbiamo usato la stima della densità del kernel (KDE) e la funzione di distribuzione cumulativa sulle coordinate polari degli eventi di esocitosi per identificare le aree arricchite di esocitosi. Nelle cellule a micromodello ad anello, il clustering si è verificato al confine tra le aree adesive e non aesive. La nostra analisi illustra come gli strumenti statistici possono essere impiegati per studiare le distribuzioni spaziali di diversi processi biologici.
Introduction
L'esocitosi è un processo cellulare universale in cui una vescica si fonde con la membrana plasmatica e rilascia il suo contenuto. La vescicola può fondersi totalmente con la membrana plasmatica (fusione completa) o creare un poro di fusione che rimane aperto durante un tempo limitato (bacio e corsa)1. Per esempio, le proteine appena sintetizzate vengono rilasciate nel mezzo extracellulare dalle vesicelle che provengono dal complesso Golgi. Questa via biosintetica e anterograda è primordiale, soprattutto negli organismi multicellulari, per seceare peptidi di segnalazione (ad esempio, ormoni, neurotrasmettitori) e componenti a matrice extracellulare (ad esempio, collagene), così come per il traffico di proteine transmembrane alla membrana plasmatica. Inoltre, le secrezioni possono verificarsi da diversi endsomes: 1) riciclare endosomi al fine di riutilizzare le proteine transmembrane; 2) corpi multiversicolari (MVB) per rilasciare esosomi; e 3) lisosomi per il rilascio di enzimi proteolitici. La secrezione endosomica ha dimostrato di essere importante per la crescita dei neuriti, la formazione di pseudopodi, la riparazione della membrana plasmatica e la segnalazione dipendentedall'ATP 2.
Per studiare l'esocitosi a livello di singola cellula, sono state impiegate diverse tecniche. Patch-clamp consente il rilevamento di singoli eventi di esocitosi con un'alta risoluzione temporale in una vasta gamma di cellule viventi3. Tuttavia, questo metodo non fornisce informazioni sulla localizzazione degli eventi di esocitosi, né dal raggruppamento che si verifica. La microscopia elettronica consente la visualizzazione diretta di eventi esoctici ad alta risoluzione spaziale, e in combinazione con l'immunoetichettazione fornisce informazioni sulla specificità dei compartimenti e delle molecole coinvolte. Uno svantaggio di questo approccio è la mancanza di informazioni sulle dinamiche del processo, nonché la sua incapacità di eseguire studi ad alto rendimento. Approcci di microscopia leggera come la microscopia a fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM), che sfrutta il campo evanescente per illuminare i fluorofori nelle vicinanze del cos coverslip (100 nm), fornisce una buona risoluzione temporale e spaziale per studiare gli eventi di esocitosi. Tuttavia, questo metodo è compatibile solo con le cellule aderenti e può essere applicato solo alla parte ventrale / inferiore delle cellule.
Da notare, la membrana plasmatica rivela una significativa eterogeneità basata su complessi adesivi che sono presenti solo in aree ristrette. Questa eterogeneità limita, ad esempio, l'adozione di diversi ligandi4. Allo stesso modo, è stato recentemente riferito che la secrezione dal complesso di Golgi è concentrata in "punti caldi" nella membranaplasmatica 5. Inoltre, è noto che alcuni carichi sono secreti attraverso l'esocitosi associata all'adesione focale6. Pertanto, si dovrebbe prestare particolare attenzione alla questione se gli eventi di esocitosi siano distribuiti casualmente nello spazio o se siano concentrati in aree specifiche della membrana plasmatica. Diversi strumenti statistici basati sulla funzione K di Ripley sono stati proposti per esplorare questedomande 7,8,9. Il nostro approccio combina questi strumenti con micromodello per controllare la forma delle cellule e l'eterogeneità della membrana plasmatica. Oltre a fornire un mezzo per distinguere tra aree adesive e non analizzate, questa tecnica consente anche il confronto tra diverse cellule e condizioni e aumenta la potenza delle analisi statistiche.
Qui impieghiamo una varietà di strumenti statistici per studiare la distribuzione spaziale degli eventi di esocitosi dal compartimento lisosomiale monitorato dall'imaging cellulare vivo TIRFM di VAMP7-pHluorin nelle cellule hTert-RPE1 normalizzate a micromodello ad anello. È stato confermato che la secrezione dai lisosomi non è un processocasuale 8,9 e che gli eventi di esocitosi esibiscono il clustering. Da notare, abbiamo scoperto che gli eventi di esocitosi sono raggruppati anche in aree non aesive, indicando che le molecole di adesione non sono le uniche strutture che possono indurre punti caldi secretori alla membrana plasmatica. Tuttavia, l'adesione cellulare ha migliorato il clustering. Coerentemente, la nostra analisi ha identificato aree arricchite di esocitosi che si trovavano al confine tra le aree adesive e non aesive.
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Protocol
1. Preparazione di cellule micromodelli
- Trasfezione delle cellule
- Un giorno prima della trasfezione, seme 2,5 x10 6 hTERT-RPE1 cellule in un pozzo di una piastra 12 pozzo (2 x 2 cm) in 1 mL di media.
- Il giorno della trasfezione, preparare la miscela di trasfezione con plasmide VAMP7-pHluorin (100 L di tampone, 0,8 g di DNA, 3 L di miscela di trasfezione). Incubare per 10 min.
NOTA: VAMP7 è un lysosomal v-SNARE, fuso con un tag pHluorin luminale. La sonda pHluorin viene sfociata da un basso pH, ma durante l'esocitosi vengono rilasciati protoni e la pHluorina inizia a emettere unsegnale 10,11. - Aggiungere il mix di trasfezione alle cellule nel loro mezzo.
- Cambiare il mezzo 4 h dopo aver aggiunto il mix di trasfezione sulle cellule.
- Utilizzare le cellule per gli esperimenti durante i prossimi 24-48 h.
- Preparazione micromodello (metodo fotolitigrafico)
- Lavare le coperture (25 mm di diametro) in etanolo e lasciarle asciugare per 5 minuti.
- Attivare coverlips per illuminazione sotto UV profondo per 5 min.
- Creare una camera umida umidificando accuratamente un asciugamano di carta su cui è posizionata una pellicola di paraffina. Aggiungere le gocce (30 l per 22 mm) della soluzione Poly-L-Lysine-graft-Polyethylene Glycol (PLL-g-PEG) (0,1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH - 7,4) e posizionare i coperture con la superficie attivata su di essi. Chiudere la camera umida con una parte superiore e incubare coverslips per 1 h.
- Lavare i coperture 2x in PBS e 1x in acqua distillata e lasciarli asciugare.
- Lavare la fotomaschera al quarzo con acqua distillata e poi con etanolo o propanolo. Asciugare la fotomaschera con il flusso d'aria filtrato.
NOTA: La fotomaschera al quarzo è rivestita su un lato con cromo antiriflesso che contiene fori sotto forma di micromodelli. In questo protocollo viene utilizzata una fotomaschera contenente micromodelli a forma di anello di 37 m. Quando i raggi UV profondi sono brillati sulla fotomaschera, la luce può passare solo attraverso questi fori12. - Esporre la fotomaschera (lato rivestito di cromo) ai raggi UV profondi per 5 minuti per pulire la superficie.
- Aggiungete piccole gocce d'acqua (10 L per un coperture da 20 mm) sul lato cromato della fotomaschera. Posizionare il con il lato trattato con PLL-g-PEG sulla goccia e asciugare l'acqua in più. Assicurarsi che non si formino bolle d'aria tra la maschera e le coperture.
NOTA: La forza capillare dell'acqua immobilizza le coperture. - Esporre la fotomaschera a raggi UV profondi per 5 minuti con il lato non rivestito di cromo verso l'alto (le copertine sono attaccate sulla superficie inferiore).
NOTA: la luce può passare solo attraverso i fori e modificare la superficie trattata da PLL-g-PEG di coverlips sotto la fotomaschera. - Rimuovere le copertine dalla fotomaschera aggiungendo acqua in eccesso.
NOTA: Coverslips dovrebbe fluttuare rapidamente. - Incubare le coperture in una soluzione di proteine a matrice extracellulare (50 g/mL di fibronectina, 5 g/mL di fibrinogeno fluorescente diluito in acqua) su pellicola di paraffina in una camera umida (come nel punto 1.2.3) per 1 h sotto una cappa di flusso laminare per evitare la contaminazione.
NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa a questo punto memorizzando le coperture in PBS a 4 gradi centigradi.
- Semina cellulare su superfici micromodellate
- Utilizzare un supporto di coperture magnetiche che si adatti alle dimensioni delle coperture micromodelle per montare le coperture. Il giorno dell'acquisizione, riscaldare il supporto di coperture a 37 gradi centigradi per evitare shock termici per le cellule durante le fasi successive.
- Preparare il modello medio integrando il supporto DMEM/F12 con 20 mM HEPES e il 2% di penicillina/streptomicina.
- Posizionare i coperture nel supporto con il lato micromodello verso l'alto e aggiungere il supporto del motivo non appena il coverslip è sulla base del supporto. Aggiungere la guarnizione e immobilizzare con il dispositivo magnetico. Riempire il supporto coverslip con il mezzo modello e chiuderlo con il coperchio di vetro.
NOTA: Sii veloce, per non lasciare che il coverslip si asciughi. Non lavare il supporto di coperture con etanolo tra un esperimento e l'altro, perché la guarnizione potrebbe trattenere un po' di etanolo, che può reagire con PLL-g-PEG e provocare stress cellulare. Lavare il supporto per le coperture solo con acqua sapo impossibile. Inoltre, l'articolazione può essere incubata nel mezzo di riferimento a 37 gradi centigradi per 1 h per diluire il prodotto residuo. - Raccogliere le cellule hTERT-RPE1 trasfettate mediante trypsinization (0,5 mL per una piastra di 12 ben) e aggiungere 1 mL del 10% di media FBS DMEM/F12.
- Aggiungere 0,5 x 106 celle hTERT-RPE1 trasfettate al supporto della barra degli e riconorla. Incubare per 10 minuti nell'incubatrice.
- Lavare il supporto coverslip 5x con motivo medio per rimuovere le cellule non attaccate e l'FBS residuo aggiungendo il mezzo modello con una pipetta e aspirando il supporto con un'altra pipetta per creare un flusso di lavaggio. Mantenere sempre un piccolo volume di modello medio nel supporto di coverslip per evitare l'essiccazione delle cellule sul coperture micromodelli, che porterà alla morte cellulare.
- Incubare nell'incubatrice per 3 h per consentire la diffusione completa delle cellule.
2. Acquisizione dei dati di esocitosi
- Imaging di eventi di esocitosi
- Posizionare il supporto per le coperture sotto un TIRM. Il segnale deve essere rilevato da una telecamera sensibile impostata con il miglior formato di imaging disponibile.
NOTA: in questo esperimento, è stato utilizzato un obiettivo obiettivo obiettivo 100x e una fotocamera EMCCD con area di rilevamento 512 x 512 pixel, dando origine a una dimensione in pixel di 160 nm. - Cercare una cella che esprima VAMP7-pHluorin completamente diffusa (Figura 1A).
NOTA: Le celle che esprimono VAMP7 sono chiaramente identificabili, perché presentano un segnale verde. - Modificare l'angolo del laser fino a raggiungere un angolo TIRF che consenta la visualizzazione degli eventi di esocitosi VAMP7-pHluorin. Eseguire un'acquisizione di 5 minuti a una frequenza compatibile con la frequenza di esocitosi e la scala temporale (in genere 3 Hz, Figura 1D) utilizzando il software al microscopio.
NOTA: le cellule hTERT-RPE1 hanno una frequenza di secreria lisosomica di circa 0,3 Hz sui micromodelli. L'esocitosi lisosomica ha una durata tipica di 1 s. È caratterizzato da un'intensità di picco seguita da un decadimento esponenziale. La diffusione della sonda dovrebbe essere evidente in questo momento (Figura 1B, C). - Per ogni cellula, eseguire anche un'acquisizione del micromodello utilizzando il software al microscopio (Figura 1A).
- Posizionare il supporto per le coperture sotto un TIRM. Il segnale deve essere rilevato da una telecamera sensibile impostata con il miglior formato di imaging disponibile.
- Acquisizione delle coordinate dell'esocitosi
- Aprire il filmato acquisito con ImageJ/FIJI. Utilizzo di File Proprietà Import . Sequenza immagine. Trova eventi di esocitosi a occhio. Un evento di esocitosi è caratterizzato dall'aspetto di un segnale luminoso che si diffonde verso l'esterno (Figura 1).
- Utilizzare lo strumento punto per contrassegnare il centro dell'evento esocitico. Utilizzare l'opzione Analizza Misurare per misurare le coordinate X e Y, nonché la coordinata temporale (numero di sezione). Eseguire queste misurazioni per tutti gli eventi di esocitosi del film.
- Salvare irisultati ( Risultati Proprietà File . Salva con nome). Preparare un file di testo per ogni cella analizzata denominata "Results(cell_name).txt" che contiene le coordinate slice, X e Y per tutti gli eventi di esocitosi in tale ordine.
Il file di testo dovrebbe essere simile al seguente:
ID X X Raggio del diametro di Y Feret
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
NOTA: fare attenzione a sostituire tutte le virgole con punti. - Misurare il centro e il diametro di ogni cella utilizzando lo "Strumento Ovale". Adattare un cerchio perfetto (non usare un ovale) e utilizzare "Misura" per ottenere le coordinate X e Y e il diametro di Feret. Salvare l'identità di ogni cella (ID), le coordinate X e Y, il diametro di Feret e il raggio (diametro/2) in un file di testo denominato "Spherical parameter.txt".
Il file di testo dovrebbe essere simile al seguente:
ID X X Raggio del diametro di Y Feret
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
NOTA: fare attenzione a sostituire tutte le virgole con punti. - Misurare lo spessore dell'anello di micromodello (lunghezza di adesione) con lo strumento dritto e salvare l'ID della cella, il raggio della cella (dal file: "Spherical parameter.txt") e la lunghezza dell'adesione in un file di testo denominato "Pattern parameter.txt". Calcolare la lunghezza dell'adesione normalizzata dividendo la lunghezza dell'adesione per il raggio della cella.
NOTA: Fare attenzione a sostituire tutte le virgole con punti.
Il file dovrebbe essere simile al:
ID Lunghezza di adesione del raggio della cella Lunghezza di adesione normalizzata
RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826
3. Analisi spaziale a singola cellula
- Pacchetto R e installazione
NOTA: il pacchetto R per questa analisi sfrutta il pacchetto Spatstat13 per calcolare la densità bidimensionale (2D) e la funzione K di Ripley. Il codice è open source e utilizza file di testo descritti in precedenza.- Scaricare e installare R da https://www.r-project.org/ (è stata utilizzata la versione 3.5.2 in questa analisi).
- Scarica il pacchetto (e il set di dati demo) da: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
- Installare il pacchetto in R Studio utilizzando "Strumenti" utilizzando "Installa pacchetti". Selezionare "Package Archive File (.zip; .tar.gz)" per la categoria "Installa da:" e scegliere il file del pacchetto. Premere "Installa".
- Caricare il pacchetto con la funzione "library("ExocytosisSpatialAnalysis")" scrivendo questo comando in R studio e premendo "Invio".
- Eseguire il pacchetto con la funzione "ESA()" scrivendo questo comando in R studio e premendo "Invio".
NOTA: si aprirà un'interfaccia utente. - Selezionare la directory per il set di dati (file con estensione txt) e una directory per i grafici di output.
NOTA: i parametri dell'analisi (vedere il testo riportato di seguito) possono essere modificati tramite un'interfaccia utente. - Questo script verrà avviato automaticamente ed eseguito l'analisi. Fornisce file .pdf di grafici corrispondenti e file .txt contenenti risultati numerici.
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Representative Results
Le caratteristiche spatiotemporal degli eventi di esocitosi sono state analizzate dai lisosomi visualizzati da VAMP7-pHluorin10,11 nelle cellule hTert-RPE1. Le cellule hTert-RPE1 sono cellule nontransformed che adottano bene al micromodello e sono state ampiamente utilizzate nei precedenti studi basati sumicromodello 4,14. VAMP7 è un lisosomico v-SNARE15 che è stato etichettato con il pHluorin super eclittico al suo N-terminus e si trova nel lume del lisosoma. All'interno della cellula, la sonda pHluorin è stata sfociata dal basso pH del lsosoma, ma durante l'esocitosi pHluorin ha iniziato a emettere un segnale perché il pH è aumentato a causa del rilascio di protoni. VAMP7-pHluorin è stato monitorato dall'imaging a cellule vive TIRFM su micropattern a forma di anello (Figura 1A–B). Il segnale di pHluorina ha mostrato un picco durante l'esocitosi che rappresentava il rilascio rapido di protoni lisosomiali seguiti da decadimento esponenziale, che rappresenta la diffusione 2D della sonda nella membrana plasmatica (Figura 1C). Le cellule hTERT-RPE1 presentavano un'importante attività di secrezione lisosomica con un tasso medio di esocitosi di 0,28 Hz (Figura 1D). Tuttavia, è stata osservata un'elevata eterogeneità nel tasso di estosi tra le cellule (deviazione standard di 0,15 Hz), indicando che c'era una forte variabilità da cellula a cellula nella secrezione dai lisosomi.
Analisi spaziale a singola cellula per verificare se l'esocitosi dei lisosomi sia casuale
È stato possibile visualizzare la distribuzione 2D di esocitosi da parte di KDE, come precedentemente eseguito per compartimenti endomembranous14, che potrebbe rivelare differenze nelle densità locali (Figura 2B). Questo approccio è pertinente per la visualizzazione della distribuzione media di una popolazione di cellule, ma meno informativo nelle singole cellule a causa del numero limitato di eventi rilevati (decine rispetto alle diverse migliaia ottenute dall'analisi basata sulla popolazione) e dell'elevata variabilità da cellula a cellula. Ad esempio, questo approccio non ci ha permesso di valutare se la distribuzione degli eventi di esocitosi seguisse un comportamento completo di casualità spaziale (CSR) (cioè corrispondeva a una distribuzione uniforme dei punti in una regione osservata per una singola cella). Un modello di punti segue un comportamento CSR quando le due seguenti ipotesi sono vere: 1) la posizione di ogni punto è indipendente da quella degli altri punti; e 2) la probabilità di trovare un punto in una sottoregione dipende solo dal rapporto tra l'area di questa sottoregione e l'area totale. Ci sono tre possibili deviazioni dal clustering CSR: 1) (cioè l'aggregazione); 2) dispersione (cioè, ordinazione a distanza costante); o 3) una miscela di clustering e dispersione(Figura 2C). La funzione K di Ripley è stata utilizzata per rispondere a questa domanda come nelle precedentianalisi 7,8,9 ( Figura2D). La funzione K di Ripley è vicina a r2 (con d che è la distanza normalizzata da un evento) nel caso di RSI, ma superiore (inferiore respiratoria) a 2 nel caso del clustering (dispersione respiratoria). Sottraendo la curva CSR teorica da 0. Le simulazioni di casi di RSI sono state eseguite utilizzando lo stesso numero di punti degli eventi di esocitosi osservati per valutare la bontà di adattamento per il caso CSR (inviluppo grigio intorno alla curva teorica). La funzione K di Ripley trasformata applicata ai dati sperimentali mostrava valori positivi all'esterno della busta, indicando il clustering (Figura 2D).
Per verificare se il raggruppamento di eventi di esocitosi fosse dovuto all'adesione delle cellule come riportato inprecedenza 6, abbiamo eseguito un'analisi simile sui dati provenienti esclusivamente dall'area delle celle non aesiva nel centro (Figura 2A, area adesiva nell'area grigia del centro cellulare in bianco). Da notare che abbiamo scoperto che anche gli eventi di esocitosi nell'area non adesiva erano raggruppati (Figura 2E), indicando che le molecole di adesione non erano le uniche strutture che indusse punti caldi secretori a membrane plasmatiche.
Poiché la funzione K di Ripley è una statistica descrittiva che non fornisce un valore P, è stato impostato un test statistico che confronta gli eventi di esocitosi cellulare con le simulazioni CSR. È stato utilizzato il metodo NND(i) della distanza adiacente più vicina. NDD è definito come la distanza minima euclidiana tra un punto i e tutti gli altri punti. La NND(i) media di tutti gli eventi esoctici di una cella è stata calcolata e confrontata con la RSI ottenuta con un numero elevato di simulazioni Monte Carlo (Figura 2F). Abbiamo scoperto che il NND medio della singola cellula analizzata nella figura 2F era inferiore alla media della distribuzione simulata del caso CSR, indicando in media i vicini più vicini e quindi il clustering. In caso di dispersione, era previsto un valore più elevato per il NND medio (Figura 2C). Questo confronto ha consentito il calcolo di un valore P per ogni cella. Il valore P rappresenta la percentuale di simulazioni che hanno mostrato un NND più estremo (in modo a due lati). Per essere precisi, il valore P imparziale è stato calcolato come (k-1)/(N-1) con N è il numero totale di simulazioni Monte-Carlo (10.000) e k il numero di queste simulazioni che era più estremo del misuranteosservato 16. L'istogramma di tutti i valori P è stato tracciato per l'area totale delle celle (Figura 2G) e l'area della cella non ahesive (Figura 2I). Se H0: "L'esocitosi è un processo di RSI" era vero, era prevista una distribuzione uniforme dei valori P. Se H0 era false, era previsto un picco con un valore P basso. Eseguendo un test Kolmogorov-Smirnov sugli istogrammi del valore P, è stato ottenuto un valore P inferiore a 0,001, mostrando una deviazione significativa dalla CSR in entrambi i casi (Figure 2G e 2I). Inoltre, un coefficiente di raggruppamento di 0,955 per la superficie cellulare totale e di 1.000 per l'area cellulare non aespressiva indicava che l'esocitosi lisosomica era un processo raggruppato indipendente dall'adesione cellulare. Il coefficiente di clustering rappresenta la percentuale di celle più vicine a un comportamento di clustering rispetto alla dispersione. Questo risultato è stato coerente con la funzione K di Ripley.
Per valutare il ruolo dell'adesione delle cellule nel clustering, abbiamo confrontato il NND medio nell'area non aesiva con quella nell'area complessiva per ogni singola cella (Figura 2H). Poiché l'NND medio era inversamente proporzionale alla densità della superficie, abbiamo normalizzato il NND medio dell'area non aespressiva usando l'omotety. Il NND medio significativamente maggiore degli eventi di esocitosi nell'area non aespressiva indicava un minore clustering (Figura 2H). Così, anche se la secrezione da cluster di lisosomi in aree non afesive, l'adesione cellulare sembrava migliorare il clustering.
Analisi spaziale degli eventi di esocitosi utilizzando coordinate polari
La geometria circolare del micromodello a forma di anello ha permesso l'uso delle comuni coordinate polari, che semplificano le analisi, come precedentemente trovato17. Ogni evento di esocitosi potrebbe quindi essere descritto da un modulo (distanza dall'origine, qui il centro del piano inferiore della cella) e da un angolo (secondo un asse arbitrario fisso). Inoltre, il modulo può essere normalizzato dividendolo per il raggio della cella. L'istogramma degli eventi di esocitosi è stato tracciato secondo il modulo per una cella rappresentativa (Figura 3A). Ciò ha rivelato un picco intorno al confine tra le aree adesive/non aesive. È stata osservata anche una grande variabilità tra le cellule. Pertanto, abbiamo in pool n - 22 celle per ottenere una distribuzione media degli eventi di esocitosi. Tuttavia, per dare lo stesso peso statistico a ogni cella, lo stesso numero di eventi di ogni cella è stato selezionato in modo casuale. Questa selezione casuale non ha modificato i modelli generali visti. Per ottenere una distribuzione media continua delle singole distribuzioni di singole celle, è stato utilizzato un KDE (Figura 3B). Tuttavia, poiché il modulo normalizzato è compreso tra 0 e 1, le condizioni del bordo dovevano essere prese in considerazione. Un kernel beta che cambia forma accanto ai bordi è stato utilizzato18. È stata calcolata una banda di errore con una strategia di bootstrap. La distribuzione media osservata è stata confrontata con un'ipotetica distribuzione di RSI che ha mostrato più eventi a un modulo più alto, perché l'area è aumentata con un modulo più alto. Poiché l'integrale di una densità di probabilità deve essere uno, la distribuzione DELLA RSI era 2r (con il raggio normalizzato, senza unità). Una banda di confidenza è stata calcolata intorno alla curva teorica utilizzando un gran numero di simulazioni CSR Monte Carlo (5.000 ciascuna). Sono statitracciati i percentili 1 st e99 th della distribuzione del modulo da queste simulazioni. Abbiamo scoperto che la distribuzione media degli eventi di esocitosi si discostava da quella ipotetica a 0,7rmax, che corrisponde all'inizio dell'area adesivo della cellula.
Abbiamo cercato di verificare se la distribuzione osservata del modulo fosse diversa da quella teorica. Poiché le distribuzioni medie, come in questo caso, non possono essere testate con precisione da un test di bontà di adattamento (ad esempio, Kolmogorov-Smirnov) è stato impiegato un metodo alternativo proposto da Pecot et al. Questo metodo misura la differenza tra la variazione tra una popolazione e la variazione all'interno di una popolazione e consente quindi test indipendenti per ogni coordinata (cioè modulo e angolo)17. Questo test è stato utilizzato per confrontare i nostri dati con i dati simulati che rappresentano gli eventi di esocitosi CSR (lo stesso numero di cellule ed eventi di esocitosi dei dati osservati) e ha rilevato una differenza statisticamente significativa nelle variazioni (p < 0.001 con il test Wilcoxon-Mann-Whitney, n - 22 celle), indicando che la distribuzione media di esocitosi osservata non era CSR. Tuttavia, quando sono state confrontate due simulazioni di RSI (con 5.000 simulazioni ciascuna), abbiamo scoperto che l'istogramma del valore P non mostrava una distribuzione uniforme, ma mostrava un picco vicino a 1, indicando che questo test probabilmente mancava di sensibilità.
Poiché la stima KDE si basa su una scelta non banale della larghezza di banda del kernel ed è sensibile agli effetti dei bordi, è stata calcolata anche la funzione di distribuzione cumulativa, che supera i problemi inerenti alla stima KDE (Figura 3D). Questa funzione è definita tra 0 e 1 e non contiene parametri arbitrari o distorsioni (ad esempio, distorsioni dei bordi). Le bande di errore e di confidenza sono state calcolate allo stesso modo della distribuzione del modulo. La funzione di distribuzione cumulativa ha confermato che gli eventi di esocitosi non hanno seguito una distribuzione CSR, ma sono stati sovraconcentrcentrata intorno a 0,7rmax. Questa analisi ci ha quindi permesso di identificare le aree cellulari in cui si è verificato il clustering. Una domanda interessante che questo risultato solleva è se l'overconcentrazione a 0,7rmax era a causa della presenza di aree adesive/non adescose del micromodello ad anello o un effetto delle aree di secrezione periferica /centrale delle cellule.
Poiché la distribuzione media degli eventi di esocitosi si discostava dal caso della RSI in aree non aesarsi e adesive, ci siamo anche chiesti dove fosse la densità di esocitosi più alta. Le densità superficiali dell'esocitosi nelle aree di adesione e non di aesenza sono state calcolate e confrontate. È stato rilevato che la densità della superficie era inferiore nell'area di adesione rispetto all'area di non analisi mediante un'analisi accoppiata (Figura 3C). Ciò potrebbe essere spiegato dalla forte diminuzione dell'esocitosi alla periferia cellulare (0,85 – 1rmax, Figura 3B).
come illustrato nella figura 1. Esocitosi da lisosomi nelle cellule hTert-RPE1: ( A ) micromodelloaforma di anello (rosso) e adesivo hTert-RPE1 trasfetto con VAMP7-pHluorin (verde) immagine da TIRFM. La freccia mostra un evento di esocitosi. Barre di scala : 10 m. (B) Kymograph di eventi di esocitosi. Le frecce mostrano eventi di esocitosi. Barra della scala : 2 m, barra della scala nel tempo : 5 s. (C) Profilo di intensità normalizzata dell'estosi lisosomica da 22 celle. Ogni punto è una media di almeno 1.530 eventi di esocitosi. I dati sono presentati - SEM. (D) Tasso di esocitosi delle 22 celle. La deviazione standard media viene tracciata in rosso. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 2. Analisi spaziale degli eventi di estosi lisosomica. (A) Grafico a dispersione di eventi di esocitosi durante l'acquisizione di 5 minuti. Ogni punto rappresenta un evento di esocitosi. L'area adesivo è visualizzata in grigio. (B) Stima della densità del kernel 2D (KDE) del grafico a dispersione di A. Il colore rappresenta la densità locale degli eventi di esocitosi. (C) Rappresentazione schematica dei possibili modelli di punti. Vengono visualizzati i quattro casi, Complete Spatial Randomness (CSR), Clustering, Dispersion e Mixed e diverse distanze adiacenti (NND) più vicine (NND) per mostrare come il NND medio è diminuito nel clustering e aumentato con dispersione. (D) Analisi di una cella rappresentativa utilizzando la funzione K di Ripley. La linea tratteggiata rossa è uguale alla "funzione K di Ripley - s2" per gli eventi CSR, l'inviluppo grigio rappresenta la bontà stimata delle simulazioni monte carlo con lo stesso numero di punti degli eventi di esocitosi (Nevento n. 81). La linea nera è uguale alla "funzione K di Ripley – 2" per gli eventi di esocitosi osservati (Nevento n. 81). La sua deviazione positiva dalla curva rossa fuori dall'involucro grigio indica il raggruppamento degli eventi di esocitosi. La funzione K di Ripley è stata normalizzata per avere un valore massimo di 1. (E) Analisi dell'area non anhesiva della stessa cella utilizzando la funzione K di Ripley come in D. La deviazione positiva dalla curva rossa all'esterno dell'involucro grigio indica un raggruppamento di eventi di esocitosi nell'area non aesiva. (F) Confronto della distribuzione media NND da una cella rappresentativa (linea rossa) con il KDE della RSI ottenuto dalle simulazioni Monte Carlo (curva blu). Il valore P è stato calcolato come percentuale di valori simulati che erano più estremi del valore osservato. ( G ) Istogramma del valorePottenuto dal test NND come in F per n - 26 celle. Il picco ai valori P bassi significa che l'ipotesi nulla "exocytosi segue la RSI" è stata respinta con un test Kolmogorov-Smirnov, indicando che l'esocitosi lisosomica non era CSR. (H) Box-plot di NND medio da eventi di esocitosi in aree non aesive (bianco) e aree cellulari totali (grigio). I due punti dati della stessa cella sono uniti da una linea. L'NND medio era più grande nell'area non aespressiva, p < 0.001 con un test Wilcoxon accoppiato (n - 25 cellule), indicando un numero significativamente inferiore di clustering nell'area non aespressiva. (I) Uguale a G per l'area non anhesive per n - 26 celle. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella figura 3. Analisi spaziale degli eventi di estosi lisosomica in comune: (A) Istogramma degli eventi di estosi di una cellula rappresentativa durante un'acquisizione di 5 minuti con eventi di estosi n - 161 in funzione del modulo normalizzato; 0 rappresenta il centro della cella e 1 la periferia della cella. L'area adesivo della cella viene visualizzata in grigio e corrisponde a
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Discussion
Abbiamo monitorato gli eventi di estosi dal compartimento lisosomiale dall'imaging cellulare live TIRFM di VAMP7-pHluorin in cellule normalizzate a micromodello a forma di anello ed abbiamo eseguito una rigorosa analisi statistica dei parametri spaziali degli eventi di esocitosi. Impiegando la funzione K di Ripley trasformata e un test statistico basato sulla distanza vicina più vicina, abbiamo confermato che la secrezione dai lisosomi non è un processocasuale 8,9. Entrambe le analisi statistiche hanno mostrato in modo convincente che gli eventi di esocitosi presentano il clustering (Figure 2D e 2G). Applicando strumenti simili all'area cellulare non esissiva, abbiamo scoperto che gli eventi di esocitosi sono raggruppati anche in aree non aesive(figure 2E e 2I). Pertanto, le molecole di adesione che sono state precedentemente segnalate per consentire il clustering6 non sono le uniche strutture che possono indurre punti caldi secretori alla membrana plasmatica. Tuttavia, l'adesione alle cellule ha migliorato il clustering: la distanza media più vicina tra gli eventi di esocitosi era significativamente maggiore nelle aree non anali(Figura 2H). Coerentemente, la nostra analisi basata sulla stima della densità del kernel e sulla funzione di distribuzione cumulativa ha identificato aree arricchite di esocitosi che si trovavano al confine tra le aree adesive e non aesarsi nelle cellule a forma di anello. Sono necessari ulteriori lavori per determinare i meccanismi molecolari alla base del clustering, come l'adesione o un targeting specifico del lisosoma in questa regione. È interessante notare che abbiamo osservato un'elevata eterogeneità nel tasso di esocitosi tra le celle hTERT-RPE1 (deviazione standard di 0,15 Hz per il tasso medio di esocitosi di 0,28 Hz, Figura 1D), indicando che la secrezione dai lisosomi ha un'elevata variazione intercellulare. Pertanto, le analisi di sottopopolazione dovrebbero essere prese in considerazione nel lavoro futuro. Sarebbe particolarmente interessante studiare se questa variazione riflettesse la diversità dei compartimenti lisosomiali, le differenze nei carichi o la dipendenza dai macchinari di esocitosi.
Questi risultati illustrano come gli strumenti statistici possono essere impiegati per studiare i parametri spaziali di diversi processi biologici. Inoltre, i micromodelli facilitano lo studio dell'effetto dell'adesione cellulare in modo imparziale con l'aiuto di diverse geometrie di micromodello (ad esempio, a forma di anello rispetto a diskshaped). In particolare, l'uso di forme rotonde facilita le analisi perché possono essere impiegate coordinate polari. Poiché gli strumenti statistici richiedono una certa quantità di dati per essere significativi, le celle con più di 30 eventi sono state utilizzate per la nostra analisi. Tuttavia, è possibile che le celle con 30 o meno eventi siano significative. Pertanto, è possibile eseguire il campionamento di celle con 30 o meno eventi per ottenere eventi sufficienti per l'analisi per determinare se questo è il caso. Allo stesso modo, è difficile stimare quante cellule dovrebbero essere analizzate, in particolare se c'è una forte variazione intercellulare. Un modo per aggirare questo è quello di selezionare in modo casuale lo stesso numero di eventi da ogni cella al fine di dare lo stesso peso statistico a ogni cella durante il pooling. Tuttavia, si consiglia di eseguire analisi su meno di 15 cellule con precauzione. Poiché le distribuzioni medie delle cellule in pool non possono essere testate con precisione mediante test di bontà di adattamento (ad esempio, Kolmogorov-Smirnov) abbiamo impiegato una statistica di prova proposta da Pecot et al. che misura la differenza nelle variazioni delle popolazioni17. Anche se questo test ci ha permesso di trovare una differenza statisticamente significativa nelle variazioni nelle distribuzioni medie, sospettiamo che questo test abbia una bassa sensibilità perché l'istogramma del valore P non era piatto (cioè, ha mostrato una distribuzione uniforme) quando si confrontano diverse simulazioni di RSI per valori p vicini a 1. Pertanto, potrebbe essere necessario migliorare questa procedura statistica.
Uno svantaggio delle nostre analisi è il rilevamento manuale degli eventi di esocitosi, che riduce drasticamente la velocità dell'analisi. Le limitazioni nel rilevamento automatico sono spesso dovute alla forte eterogeneità nel parametro unico e semplice analizzato (ad esempio, l'intensità degli eventi di esocitosi). Le reti neurali potrebbero essere potenzialmente potenti per il rilevamento automatico, perché possono essere addestrate a riconoscere molte funzionalità.
L'analisi qui presentata può essere applicata ad altri processi dinamici osservati da TIRFM, come la secrezione da altri compartimenti e la distribuzione del microdominio a membrana o della presentazione dell'antigene. Analisi simili possono essere applicate anche alle cellule fisse per studiare la distribuzione spaziale delle proteine. Speriamo che il nostro lavoro rafforzi il crescente interesse per l'analisi della distribuzione spaziale nella biologia cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo molto Thierry Galli (Centro di Psichiatria e Neuroscienze, INSERM) per aver fornito il plasmide VAMP7-pHluorin. Ringraziamo Tarn Duong per i consigli sull'analisi statistica e i membri del laboratorio GOUD per le discussioni fruttuose. Gli autori riconoscono molto il Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg e PICT-IBiSA @Pasteur) e il Nikon Imaging Center, Institut Curie (Parigi), membro dell'Infrastruttura Nazionale francese di ricerca Francia-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. è stato sostenuto dall'Associazione pour la Recherche sur le Cancer (ARC) e P.M. ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 666003 dell'Unione europea. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), il Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-003) Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), così come il Centre National de la Recherche Scientifique e Institut Curie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
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