Summary
Questo protocollo fornisce metodi dettagliati che descrivono la fabbricazione e l'implementazione di una piattaforma di regolazione del carico di carico magnetica per tessuti cardiaci ingegnerizzati.
Abstract
Il postcarico è noto per guidare lo sviluppo di stati cardiaci fisiologici e patologici. Di conseguenza, lo studio dei risultati degli stati afterload alterati potrebbe fornire importanti informazioni sui meccanismi che controllano questi processi critici. Tuttavia, attualmente manca una tecnica sperimentale per mettere a punto con precisione il post-tuning nel tessuto cardiaco nel tempo. Qui, viene descritta una tecnica basata su magnetici di recente sviluppo per ottenere questo controllo nei tessuti cardiaci ingegnerizzati (EHT). Al fine di produrre EHT magneticamente reattivi (MR-EHT), i tessuti sono montati su pali in silicone cavo, alcuni dei quali contengono piccoli magneti permanenti. Un secondo set di magneti permanenti è press-fit in una piastra acrilica in modo che siano orientati con la stessa polarità e siano assialmente allineati con i magneti del palo. Per regolare il post-carico, questa piastra di magneti viene tradotta verso (dopo il carico superiore) o in trasferta (postcarica inferiore) dai magneti postali utilizzando uno stadio piezoelettrico dotato di un encoder. Il software di controllo del movimento utilizzato per regolare il posizionamento dello stage consente lo sviluppo di regimi post-caricamento definiti dall'utente, mentre l'encoder assicura che lo stage corregge eventuali incoerenze nella sua posizione. Questo lavoro descrive la fabbricazione, la calibrazione e l'implementazione di questo sistema per consentire lo sviluppo di piattaforme simili in altri laboratori in tutto il mondo. I risultati rappresentativi di due esperimenti separati sono inclusi per esemplificare la gamma di diversi studi che possono essere eseguiti utilizzando questo sistema.
Introduction
Il post carico è il carico sistolico sul ventricolo dopo che ha iniziato a espellere il sangue1. Durante lo sviluppo cardiaco, un afterload appropriato è di importanza critica per la maturazione cardiomiocita2. In età adulta, bassi livelli di post-carico ventricolare (ad esempio, in pazienti costretti a letto con lesioni del midollo spinale di alto livello3 o in casi molto particolari come il volo spaziale4)possono provocare ipotrofia del cuore. Al contrario, un elevato afterload può portare all'ipertrofia cardiaca5. Mentre l'ipertrofia cardiaca negli atleti di resistenza o nelle donne in gravidanza è considerata benefica e fisiologica, l'ipertrofia associata all'ipertensione arteriosa a lungo termine o alla grave stenosi della valvola aortica è dannosa in quanto predispone ad aritmie cardiache e insufficienza cardiaca6. Anche se il tasso di mortalità a 5 anni per i pazienti affetti da insufficienza cardiaca si è ridotto dal 70% negli anni '80dal 6 al 40-50%7 attualmente, c'è ancora un grande bisogno di nuove opzioni terapeutiche per questa condizione altamente prevalente (attualmente 2,2% della popolazione nel mondo occidentale)8.
Al fine di studiare i meccanismi molecolari dell'ipertrofia cardiaca patologica e per testare strategie preventive o terapeutiche per il trattamento di questa malattia, sono stati sviluppati modelli in vivo di postcarico9,10,11,12. Sebbene questi modelli abbiano offerto informazioni utili sugli effetti del postload sulle prestazioni ventricolari, non consentono un controllo preciso sulla magnitudine post-carico. In alternativa, gli studi in vitro del postcarico eseguiti su cuori eccitati e preparati muscolari consentono un controllo più preciso sul carico dei tessuti, ma questi modelli non sono favorevoli agli studi longitudinali13,14,15.
Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un modello in vitro di postload elevato in tessuti cardiaci ingegnerizzati (EHT)16,17. Questo modello è un formato di coltura tridimensionale per le cellule cardiache del ratto incorporate in una matrice di fibrina sospesa tra pali flessibili in silicone cavo. Questi tessuti battono spontaneamente (contro la resistenza dei pali in silicone) ed eseguono un lavoro auxotonico. Abbiamo aumentato il postcarico applicato agli EHT di un fattore 12 negli esperimenti precedenti mediante l'inserimento di bretelle metalliche rigide nei pali in silicone cavo per una settimana. Ciò ha portato a una moltitudine di cambiamenti, caratteristica dell'ipertrofia cardiaca patologica18,19,20: ipertrofia cardiomiocite, necrotosi parziale, un calo della forza contrattile, il compromissione del rilassamento dei tessuti, la riattivazione del programma genico fetale, uno spostamento metabolico dall'ossidazione dell'acido grasso alla glicolisi anaerobica e un aumento della fibrosi. Anche se questa procedura è stata impiegata con successo in diversi studi17,21,22, ha alcuni svantaggi. Ci sono solo due stati, basso o molto alto (12 volte) afterload, e la procedura richiede la gestione manuale degli EHT, che limita la sua flessibilità temporale e pone il rischio di contaminazione.
Recentemente, Leonard ealtri usato una tecnica simile per modulare postload in EHTs coltivati su pali in silicone23. Per limitare il loro movimento di piegatura, sono state posizionate parentesi graffe di lunghezza variabile. Gli autori di questo studio hanno riferito che un singolare aumento di piccole-medie dimensioni dello sviluppo della forza avanzata del carico e della maturazione degli EH di derivazione degli iPO umani, mentre carichi più elevati hanno portato a uno stato patologico. Tuttavia, simile al nostro sistema, questa tecnica consente solo aumenti singolari nel post-caricamento, la cui grandezza è dettata dalla lunghezza delle parentesi graffe. Come tale, le alterazioni fini nel post-caricamento, le modifiche nel postload nel tempo e i regimi di caricamento precisi non sono possibili con queste tecniche.
Qui, forniamo il protocollo per un sistema che può essere utilizzato per modulare la post-resistenza, cioè, dopo il caricamento di EHT magneticamente24. Questa piattaforma facilita la messa a punto del postload, abilita i regimi afterload definiti dall'utente e garantisce la sterilità EHT.
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Protocol
1. Preparazione della piattaforma di ottimizzazione dopo il carico
NOT: I passaggi coinvolti in questa parte del protocollo non sono sensibili al tempo.
- Produzione di rack in silicone magneticamente reattivi
NOTA: questi rack fungono da piattaforma di coltura per gli EHT. Ogni EHT è sospeso tra due pali in silicone, che impartiscono post-carica al tessuto. Il grado di postload è direttamente correlato alla rigidità di questi pali. Per consentire la messa a punto magnetica del postcarico, alcuni dei post devono essere magneticamente reattivi.- Acquisire 24-well racke rack compatibili di pali in silicone (dimensioni fornite in Supplementary Figura 1). I rack utilizzati in questo studio sono stati prodotti da un fornitore commerciale di prodotti in silicone secondo queste dimensioni utilizzando silicone con una durezza a terra di 40.
- Determinare la polarità dei magneti postali (ad es., d - 0,5 mm, h - 2,0 mm; vedi Tabella dei materiali) posizionandoli su un magnete permanente più grande.
- Mantenere una polarità fissa, lubrificare i magneti con acqua e inserirli, uno alla volta, nei pali più esterni dei rack di silicone.
NOT: Se si tenta di inserire più di un magnete alla volta, la resistenza aggiuntiva renderà più difficile spingere i magneti sul fondo del palo. - Utilizzare un pezzo smussato di filo dentale in acciaio inossidabile (d 0,4 mm, vedere Tabella dei materiali) per spingerli con attenzione verso il fondo della cavità del post cavo. È possibile impilare fino a cinque magneti in ogni post.
- Utilizzare le pinze (naso rotondo) per piegare il filo dentale in acciaio inossidabile (d - 0,4 mm, vedi Table of Materials) in parentesi graffe larghe 11,25 mm e 15 mm di lunghezza. Utilizzare le frese a filo per tagliare le parentesi graffe e un file per lisciare la superficie di taglio. Per garantire che vengano raggiunte le dimensioni corrette, è possibile utilizzare un jig self-made per aiutare nella piegatura del filo.
NOT: Post immobilizzazione può essere raggiunto anche da bretelle fatte da altri materiali, purché siano non magnetici e rigidi. - Lubrificare le parentesi graffe con acqua e inserirle nel rack di silicone, fissando il secondo e il terzo posto più esterno nel processo (vedere Figura 1 per la configurazione completa del rack in silicone).
NOT: Facoltativamente, al fine di adattare la rigidità di base dei pali di controllo in modo che corrisponda a quella dei pali magneticamente reattivi, frammenti di aste rotonde di stirene (vedi Tabella dei materiali)possono essere inseriti nei pali vuoti (quelli senza tutore o magnete). - Lasciare riposare i rack per 1-2 giorni per consentire l'asciugatura dell'acqua rimanente.
- Quando i pali sono asciutti, sigillare i fori nella parte superiore dei pali in silicone cavo contenenti i magneti utilizzando una goccia di colla di silicone.
- Il dispositivo di ottimizzazione post-carico
NOTA: Poiché i magneti nel dispositivo di sintonizzazione post-carico vengono spostati verso o lontano da quelli nei pali in silicone, le forze magnetiche attraenti aumentano o diminuiscono di conseguenza, con conseguente alterata rigidità dei pali in silicone. Questo movimento si ottiene utilizzando uno stadio piezoelettrico. A causa della natura prototipo del dispositivo di ottimizzazione post-caricamento, non verranno fornite istruzioni dettagliate su come replicarlo. Al contrario, le linee guida generalizzate per la costruzione di un dispositivo di ottimizzazione afterload simile sono descritte in dettaglio nel presente documento.- Ottenere un motore lineare piezoelettrico molto preciso per consentire la traslazione verticale della piastra magnetica verso e lontano dagli EHT (vedere Tabella dei materiali).
NOT: Si suggerisce vivamente che questo motore sia dotato di un encoder lineare per correggere il posizionamento dello stage. - Posizionare un insieme di magneti permanenti all'interno di un supporto non magnetico in modo che siano allineati assialmente con i magneti post quando sono posizionati direttamente sotto di essi. In questo caso, i grandi magneti cilindrici (d - 13 mm, h - 14 mm; vedi Tabella dei materiali) sono stati press-fit all'interno di una piastra di plastica acrilica ("piastra magnetica").
- Attaccare il supporto del magnete allo stadio piezoelettrico utilizzando un materiale non magnetico. Questo può essere ottenuto utilizzando un pezzo di alluminio a forma di L (vedere Figura 2).
- Costruire un telaio in grado di ospitare i componenti del dispositivo di sintonizzazione afterload. Come minimo, questa struttura dovrebbe avere una posizione su cui montare verticalmente il palco piezoelettrico, così come un telaio rigido su cui posizionare la piastra 24-well.
NOT: Si suggerisce che la posizione di questo monte sia modificabile nel piano orizzontale al fine di consentire regolazioni nell'allineamento assiale tra i due set di magneti. Un sistema di azionamenti meccanici è stato utilizzato per ottenere questa manovrabilità nel sistema presentato (Figura 3). Il dispositivo di ottimizzazione del postload qui descritto è stato progettato per essere compatibile con il sistema di analisi della contrattivita EHT (vedere Tabella dei materiali). Come tale, le sue dimensioni erano limitate a 29 cm di larghezza, 29 cm di profondità e 16 cm di altezza per adattarsi all'interno di questo sistema. - Per consentire l'analisi visiva dei tessuti, installare una fonte di luce all'interno del dispositivo di sintonizzazione afterload. In questo caso, è stata impiegata una serie di LED (Figura 4) per illuminare gli EHT dal basso (Figura 5).
- Ottenere un motore lineare piezoelettrico molto preciso per consentire la traslazione verticale della piastra magnetica verso e lontano dagli EHT (vedere Tabella dei materiali).
- Calibrazione del sistema di sintonizzazione post-carico
Nota:Per aumentare con precisione il postcarico EHT al valore desiderato, sarà necessario determinare la relazione tra la spaziatura del magnete e la conseguente rigidità del post.- Misurare la spaziatura del magnete più vicina (dmin) e più lontana (dmax) possibile nella configurazione. Queste distanze determineranno i postcarichi massimi e minimi raggiungibili.
NOT: Il fondo della piastra di coltura impedirà il contatto diretto tra la piastra magnetica e i pali in silicone magneticamente reattivi. - Produrre una gamma di pesi non magnetici e montarli su corda per servire come carichi di prova.
- Determinare i pesi dei carichi di prova utilizzando una scala fine ed etichettarli in base a questo peso. Qui, sei diversi pesi di vetro acrilico che vanno da 30 mg a 200 mg sono stati utilizzati.
NOT: Selezionare i pesi che sono abbastanza pesanti per piegare il palo, ma non così pesante che piegano il palo più di pochi millimetri. L'utilizzo di un numero maggiore di carichi di prova garantisce che la calibrazione sia più precisa, ma richiederà anche più tempo. - Montare uno dei rack in silicone verticalmente (utilizzando materiali non magnetici), in modo che i pali in silicone magneticamente reattivi siano orientati orizzontalmente.
- Montare uno dei magneti della piastra (il "magnete di calibrazione") su uno stadio lineare che viaggia orizzontalmente in modo che sia allineato assialmente con il palo magneticamente reattivo.
- Posizionare il magnete di calibrazione a una distanza definita dal palo in silicone magneticamente reattivo utilizzando lo stadio orizzontale (preferibilmente, iniziare ad una distanza uguale alla spaziatura massima del magnete raggiungibile dal dispositivo di sintonizzazione afterload).
- Posizionare una telecamera (ad esempio, vedere Tabella dei materiali) sul lato di questo set-up per poter registrare otticamente la deviazione del post sotto l'influenza dei carichi di prova.
NOT: Si suggerisce che l'utente impiega una fotocamera con una risoluzione di almeno 2 megapixel per garantire una determinazione accurata della post-deflessione. - Scatta una foto del post in assenza di pesi da utilizzare come riferimento per la posizione "neutra" del post.
- Senza cambiare la prospettiva della fotocamera, fissare uno dei carichi fino alla fine del palo in silicone e scattare una foto del post piegando sotto l'influenza del peso.
- Ripetere questa misura per tutti i pesi.
- Determinare otticamente la deflessione del palo del silicone causata dalla forza gravitazionale di ogni peso.
- Grafico della deviazione del palo in silicone (x, sull'asse x) rispetto alla forza gravitazionale di ogni peso di prova (mg, sull'asse y). Questo dovrebbe produrre una relazione lineare tra forza e deflessione.
NOT: Se i dati non sono lineari, ciò potrebbe indicare che il palo è al di fuori della sua gamma lineare di deflessione, cioè i pesi utilizzati erano troppo pesanti. - Tracciare una funzione di regressione lineare che passa attraverso (0,0) e i dati acquisiti (vedere la figura 6A per esempi). La pendenza di questa funzione (mg e kx) è la rigidità k del palo in silicone magneticamente reattivo alla spaziatura magnete testata.
- Ripetere questi passaggi a diverse spaziature tra dmax e dmin. In questo caso, sono state analizzate le deviazioni in nove diverse posizioni magneti che vanno da 31 mm a 5 mm.
- Determinare la rigidità di base del palo in silicone magneticamente reattivo in assenza del magnete di calibrazione utilizzando la stessa tecnica.
- Determinare anche la rigidità di un post di controllo mobile, non magneticamente reattivo, utilizzando la stessa tecnica.
- Tracciare i valori k risultanti rispetto alle rispettive distanze magneti. Questo dovrebbe produrre una relazione esponenziale negativa.
- Tracciare una funzione di regressione attraverso questi valori. Ad esempio, utilizzare adattamento non lineare Funzione di decadimento in una fase nel software di analisi (vedere la Tabella dei materiali). Questa funzione di regressione descrive la relazione tra la spaziatura magnete e post-caricamento (vedere Figura 6B per un esempio).
- Misurare la spaziatura del magnete più vicina (dmin) e più lontana (dmax) possibile nella configurazione. Queste distanze determineranno i postcarichi massimi e minimi raggiungibili.
2. Generazione e cultura EHT
NOT: La generazione e la cultura EHT sono state descritte in dettaglio in un altro articolo25. Pertanto, tratteremo brevemente questi aspetti solo nel nostro protocollo. Si prega di effettuare i seguenti passaggi in condizioni sterili, aderendo a buone pratiche di coltura cellulare.
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Generazione EHT
- Immergere i rack in silicone precedentemente preparati in un contenitore riempito con 70% di etanolo per almeno 20 min.
ATTENZIONE: Non autoclave i pali in silicone regolabili dopo il carico per sterilizzarli in quanto le alte temperature possono danneggiare i magneti permanenti. - Portare questo contenitore nell'armadietto della biosicurezza, sciacquare i rack 2x con acqua sterile e lasciarli asciugare all'aria.
NOT: Per ridurre la probabilità di contaminazione, questo processo deve essere effettuato nello stesso armadietto di biosicurezza che verrà successivamente utilizzato per lanciare gli EHT. - Acquisire (e scongelare se necessario) le cellule ventricolare del cuore di ratto neoato o hiPSC (cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo) -nanomiociti (anche disponibile in commercio) e preparare il mix di ricostituzione EHT secondo la tabella 1.
- Pipet 1.5 mL di calda soluzione agarose 2% nel più a sinistra 4 pozzi di una piastra di coltura 24-well e inserire immediatamente un distanziale in politetrafluoroetilene (PTFE) (vedi Tabella dei materiali) nella soluzione agarose liquida.
- Ripetere il passaggio precedente per i restanti 20 pozze all'interno della piastra di coltura.
- Dopo aver permesso all'agarose di solidificarsi per 10 min, rimuovere con attenzione i distanziali PTFE.
NOT: L'agarose diventa torbida quando si è solidificata. - Inserire i pali dei rack in silicone magneticamente sensibili nei vuoti agarose prodotti dai distanziali PTFE.
- Tubo 100 l della miscela di ricostituzione in una soluzione di trombina 3 lfdicessa di 100 mU/L. Pipette su e giù due volte per mescolare e trasferire rapidamente la miscela nel vuoto all'interno del primo stampo agarose sulla piastra di coltura.
- Ripetere il passaggio precedente per i restanti 23 stampi, utilizzando una nuova punta del tubo per ogni EHT.
NOT: Mescolare delicatamente la costituzione mescolare ogni 6-8 EHT per prevenire la sedimentazione cellulare. - Conservare la piastra di 24 pozze in un'incubatrice (37 gradi centigradi, 7% CO2,40% O2) per 90 min. Nel frattempo, preparate il mezzo EHT integrando il mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) con il 10% di siero di cavallo, l'1% di penicillina/streptomicina, 10 g/mL di insulina e 33 g/mL di aprotinina.
- Aggiungere 500 l di mezzo EHT caldo ad ogni pozzo.
- Conservare la piastra di 24 pozze in un'incubatrice (37 gradi centigradi, 7% CO2,40% O2) per 30 min. Durante questo periodo, preparare una seconda piastra di 24 pozzetti con 1,5 mL di mezzo EHT in ogni pozzo e posizionarla nell'incubatrice.
- Rimuovere con attenzione i rack in silicone sensibile al magnete con gli EHT appena lanciati su di essi dagli stampi agarose e trasferirli alla seconda piastra di 24 pozzetti.
- Immergere i rack in silicone precedentemente preparati in un contenitore riempito con 70% di etanolo per almeno 20 min.
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Cultura EHT
NOTA: Dopo la colata dei tessuti, modificare il supporto tre volte alla settimana: il lunedì, il mercoledì e il venerdì.- Per un cambiamento medio, pipet 1.5 mL di fresco EHT medio per bene in una nuova piastra di coltura 24-pozzi e posizionare questa piastra all'interno dell'incubatrice a 37 gradi, 7% CO2e 40% O2 per almeno 30 min.
- Trasferire i rack in silicone dalla vecchia piastra 24-po alla nuova piastra sotto una cappa di coltura cellulare.
- Conservare le piastre EHT chiuse in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 7% CO2e 40% O2.
3. Esperimenti di modifica dopo il caricamento
NOT: Le seguenti fasi del protocollo sono specifiche della piattaforma di analisi della contrattinalità ottica e del motore piezoelettrico elencata nella Tabella dei Materiali.
- Preparazione del dispositivo di ottimizzazione post-carico per gli esperimenti
- Per misurare gli effetti delle manipolazioni postload sulla contrattilità EHT, scollegare e rimuovere il sistema di illuminazione dal vano più interno della piattaforma di analisi della contrattilità ottica e inserire il dispositivo di accordatura post-carico, compresa la fonte di luce.
- Installare il software di controllo del movimento dello stage (vedere Tabella dei materiali)nel computer che verrà utilizzato per eseguire il dispositivo di ottimizzazione post-carica.
- Collegare il motore a fase piezoelettrico al controller di movimento (vedere Tabella dei materiali) e il controller di movimento al computer. Assicurarsi che il controller di movimento sia collegato anche a una fonte di alimentazione.
NOT: Ci sono due luci sulla faccia del controller di movimento. Al momento del collegamento all'alimentazione, entrambe le luci lampeggiano in rosso per alcuni secondi. Durante il funzionamento, la luce superiore rimane verde mentre quella inferiore dovrebbe diventare rossa solo se si verifica un errore. - Posizionare una piastra di coltura vuota 24-well sul supporto piastra nella parte superiore del dispositivo di sintonizzazione afterload.
- Allineare otticamente la piastra di coltura vuota con la piastra magnetica sottostante utilizzando il sistema di azionamento meccanico XY collegato al supporto.
- Utilizzo del dispositivo di regolazione del carico di lavoro
- Avviare il software della piattaforma controller di movimento.
- Collegare il software al motore dello stadio piezo selezionando la porta indicata come porta dello stage durante l'installazione del software di controllo del movimento, quindi fare clic sul pulsante apri porta.
NOT: Dopo aver completato questo passaggio, la porta deve essere designata come "aperta" e visualizzata in una casella verde. - Vai al pannello Sistema. Selezionare Apri ciclo nel menu a discesa Loop.
- Spostare manualmente la piastra magnetica nella posizione più alta, ovvero la spaziatura magnete più vicina possibile dmin. La piastra magnetica deve prendere contatto con il supporto della piastra di coltura.
- Vai al pannello Movimento. Fare clic sul pulsante zero per reimpostare la posizione corrente dello stage piezo su 0 mm.
- Spostare manualmente la piastra magnetica nella posizione più bassa possibile. Annotare la posizione dell'encoder (indicato nel pannello Movimento da Enc) per determinare la gamma di movimento per il motore a fase piezoelettrica.
- Impostate i limiti di viaggio nel pannello Sistema sui valori compresi nell'intervallo di movimento determinato nel passaggio precedente. Ciò impedisce alla piastra magnetica di urtare la piastra di coltura o il fondo del dispositivo di sintonizzazione afterload.
- Ancora una volta, spostare la piastra magnetica nella sua posizione più alta e fare clic sul pulsante zero.
- Passare al pannello di sistema e modificare la modalità loop di feedback in Loop chiuso. In questo modo si garantisce che la fase corregga per eventuali errori nel suo posizionamento.
- Fare clic sul pulsante Salva nella casella Salva parametri per memorizzare queste impostazioni nel sistema.
- Posizionare una piastra di coltura di 24 ben2 piani contenente EHT su rack in silicone magneticamente reattivi sul supporto della piastra di coltura.
- Per calcolare la spaziatura del magnete necessaria per ottenere un afterload desiderato, risolvere la funzione di regressione non lineare dal passaggio 1.3.19 per il parametro di spaziatura del magnete d. Ad esempio, se l'equazione è:
, d è la spaziatura del magnete (in mm) necessaria per ottenere il carico successivo desiderato k in mN/mm, sarebbe necessaria una spaziatura del magnete di 12,12 mm per ottenere un afterload di 5 mN/mm. - Sottrarre dmin dalla spaziatura magnete calcolata d. Il risultato è la distanza che la piastra magnete deve percorrere dalla sua posizione zero per ottenere il postcarico desiderato.
- Digitate questo valore nel campo di immissione Posizione di destinazione 1 nel pannello Movimento e fate clic su Vai per regolare il postcaricamento degli EAt al valore calcolato.
- Facoltativo: programmazione della fase per un regime di intervallo successivo al caricamento
NOTA: nella sezione precedente viene descritto come programmare lo stage in cui spostarsi e rimanere in una singola posizione. Tuttavia, è anche possibile concatenare diversi comandi in un programma per ottenere una sequenza di movimenti eseguita automaticamente, che può essere ripetuta su un ciclo continuo. Per istruzioni più dettagliate sul software della piattaforma di controllo del movimento, consultare il manuale operativo fornito dal produttore dello stage.- Dopo aver impostato il dispositivo di ottimizzazione post-carica come descritto nella sezione precedente, aprite il pannello Comandi. Digitare il comando 1PGM1 e premere Invio per avviare la registrazione di un programma.
- Per creare un programma che, ad esempio, farà sì che la fase piezoelettrica si sposti di 30 mm dalla posizione zero (lontano dagli EIT) e 1WTM40000 ritorni dopo 40 s, inserisci 1WST la seguente catena di comandi: 1MVA30 1WST 1MVA0
- Utilizzare il comando 1END per terminare la registrazione di un programma e salvarlo.
- Utilizzare il comando 1EXC1 per eseguire il programma registrato.
- Per mantenere il programma in esecuzione su un ciclo continuo, immettere 1PGL1, seguito dal comando 1EXC1.
- Per terminare un programma ciclico, immettere il comando 1EST.
NOTA: la tabella 2 contiene alcuni comandi utili per gli esperimenti di modifica post-caricamento. Un elenco completo dei comandi disponibili per questo sistema è disponibile nel manuale di riferimento per il sistema di controllo del movimento modulare.
, d è la spaziatura del magnete (in mm) necessaria per ottenere il carico successivo desiderato k in mN/mm, sarebbe necessaria una spaziatura del magnete di 12,12 mm per ottenere un afterload di 5 mN/mm.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Quantificazione del magnete post rigidità
Un palo in silicone magneticamente orientato orizzontalmente è stato montato in una posizione fissa, e un magnete di calibrazione allineato asalizzatamente è stato posizionato a diverse distanze definite ("spazi magneti") da questo palo. I carichi di prova di peso noto sono stati sospesi dalla fine del palo in silicone, causando la piegatura del palo. Questa deviazione è stata quantificata otticamente. È stata osservata una relazione lineare tra la forza gravitazionale del carico di prova e la conseguente postlessione a tutte le distanze del magnete (Figura 6A). I valori di rigidità derivati da queste relazioni lineari hanno seguito una tendenza esponenziale negativa con una crescente spaziatura del magnete (Figura 6B).
Aumento passoa dopo il carico
Il controllo e gli EHT (MR-EHT) generati dai cuori dei ratti sono stati coltivati in assenza di postcarica magnetica (0,6 mN/mm per i tessuti di controllo e 0,91 mN/mm per i MR-EHT) fino a raggiungere un altopiano in forza contrattile. In questo giorno (24 giorni dopo il casting EHT), GLI ETMR e gli EHT di controllo avevano forze medie simili (0,29 mN contro 0,22 mN). Nel corso della settimana successiva, il postload esercitato sui MR-EHT è stato aumentato in modo incrementale da 0,91 a 6,85 mN/mm, mentre il postload per il controllo degli EHT è rimasto costante. La forza contrattuale media è aumentata con l'aumento del postload fino a 0,95 mN, che segna più di un aumento della forza di 3 volte rispetto al valore medio (0,29 mN) misurato per gli EHT di controllo (Figura 7A). La post-deflessione, d'altra parte, è diminuita rispetto ai tessuti di controllo. L'ultimo giorno di coltura, la deviazione media misurata per MR-EHTs era di soli 0,11 mm rispetto a 0,48 mm per il controllo EHT(Figura 7B). A partire dal giorno 27 in poi, il tasso di produzione della forza e il tasso di decadimento della forza erano più elevati nei MR-EHT rispetto agli EHT di controllo, mentre c'è stato solo un aumento transitorio del lavoro nei giorni 25-28 (Figura supplementare 2).
Regime di intervallo dopo il carico
Gli EHT di ratto su pali in silicone magneticamente reattivi (MR-EHT) sono stati coltivati ad un afterload minimo di 0,91 mN/mm fino a raggiungere un altopiano in forza contrattile. Da questo giorno (17 giorni dopo il casting EHT) in poi, MR-EHTs ha subito un regime di postload di 7 giorni che ha esposto gli EHT a cicli di postcari alternando tra 0,91 e 6,85 mN/mm (Figura 8A). Il postcaricamento degli EHT di controllo è stato mantenuto costante a 0,60 mN/mm per l'intera durata della coltura. In seguito a questo intervento, le forze medie per i MR-EHT sono aumentate del 12,0% rispetto al giorno 17, mentre quelle misurate per gli EHT di controllo sono aumentate solo dell'1,5% rispetto allo stesso arco di tempo (Figura 8B). Tuttavia, queste differenze non erano statisticamente significative. Inoltre, non sono state misurate differenze significative nel tasso di produzione della forza, nel tasso di decadimento della forza e nel lavoro contrattuale (Figura supplementare 3). Ciò implica che il regime di postload selezionato non era un mezzo efficiente per aumentare la contrattilità EHT.
Figura 1: Rack in silicone magneticamente reattivi assemblati. (A) Vista ortogonale e(B) vista sezionale di rack in silicone magneticamente reattivi assemblati contenenti cinque magneti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Piastra del magnete. Fotografia della piastra magnetica e della sua staffa di attacco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Sistema di azionamento meccanico. Fotografia che mostra il sistema di azionamenti meccanici utilizzato per regolare la posizione orizzontale della piastra di 24 pozze rispetto alla piastra magnetica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Piastra LED. Fotografia della piastra LED utilizzata per illuminare gli EHT per l'analisi ottica della contrattilità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Dispositivo di ottimizzazione post-carico completamente assemblato. Fotografia del dispositivo di sintonizzazione post-carico completamente assemblato, compresa la piastra LED. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Determinazione ottica della rigidità post. (A) La deflessione di un posto in silicone magneticamente reattivo in presenza di un magnete di calibrazione esterno e sotto l'influenza di cinque pesi di prova è stata valutata a nove distanze di magneti determinate (cinque mostrate come esempi). (B) Relazione determinata tra spaziatura del magnete e rigidità post. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Risposta contrattuale degli EHT a un aumento graduale del postcarico. Misurazioni contrattuali degli EGT di controllo (linea nera) e degli EHT sono stati coltivati su pali magneticamente reattivi (MR-EHT; linea blu) in un periodo culturale di 31 giorni. (A) gli MR-EHT avevano forze contrattuali medie leggermente più elevate rispetto agli EHT di controllo in condizioni di base. Dal giorno 25 in poi, tuttavia, questa differenza è stata amplificata con l'aumento del postload. (B) La post-deflessione è stata simile tra i due gruppi fino al giorno 27. Valori successivi al carico passati di 3,5 mN/mm, la post-deflessione per gli MR-EHT è diminuita notevolmente. In questo caso, sono stati analizzati n, n, 10 MR-EHT e n 10 EHT di controllo, adattando un modello misto (REML - probabilità massima limitata) e il test di confronto multiplo di Sidak. Le barre di errore nei grafici rappresentano l'errore standard della media, p < 0,01, p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Risposta del contratto di EOTT a un protocollo di postcarico intervallo. È stato osservato il comportamento contrattile degli EHT magneticamente reattivi sotto l'influenza di un regime fluttuante di postload. (A) Il regime di post-carico, che è stato avviato il giorno 17 (d17), ha esposto il MR-EHTs a intervalli di 40 s di postload minimo (0,91 mM/mm) seguito da intervalli di 40 s di postcarica massima (6,85 mN/mm) per 7 giorni. (B) Mr-EHTs (barre blu) ha mostrato una tendenza verso l'aumento delle forze durante il protocollo di post-caricamento dell'intervallo, mentre le forze misurate per il controllo Degli EHT (barre nere) sono rimaste relativamente invariate. Per questi esperimenti sono stati analizzati n n n 10 EHT per gruppo e questi dati sono stati statisticamente confrontati utilizzando un test di confronto multiplo a 2 vie ANOVA e Sidak. Le barre di errore nei grafici rappresentano l'errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 1 Ratto EHT | 24 Ratti EHT (-10%) | 1 hiPSC-CM EHT | 24 HiPSC-CM EHT (10%) | Componente | |
| 5 x 105 | 1,3 x 107 | 1 x 106 | 2,6 x 107 | Cellule (cellule ventricolari cardiace al ratto neoaale o cardiomiociti derivati da hiPSC) | |
| 5,57 l | 147 ll | 5,57 l | 147 ll | 2x DMEM: 20% di siero di cavallo inattivato dal calore, 20% 10x DMEM, 2% penicillina/streptomicina, 58% aqua ad iniectabilia | |
| 2,53 l | 66,8 ll | 2,53 l | 66,8 ll | Fibrinogeno: 200 mg/mL Fibrinogeno sciolto in 0.9% NaCl | |
| - | - | 0,1 L | 2,64 l | Y-27632 | |
| annuncio 100 L | annuncio 2640 -L | annuncio 100 L | annuncio 2640 -L | Mezzo di colata EHT: 88% DMEM, 10% di siero di vitello fetale inattivato dal calore, 1 % penicillina/streptomiacina, 1% L-glutamina | |
Tabella 1: Mix di ricostituzione per la generazione di EHT.
| Nome comando | Sintassi | Descrizione | |
| Muovi in assoluto | 1MVA[x] | Lo stage passa alla posizione [x] in mm | |
| Imposta velocità | 1VEL[x] | Velocità di movimento dello stage impostata su [x] in mm/s | |
| Arresto di emergenza | 1R | Interrompe qualsiasi movimento | |
| Attendere l'arresto | 1WST (in base al ts) | Solo durante la registrazione del programma; Attende il completamento del comando di spostamento precedente prima di eseguire il comando successivo | |
| Attendere il periodo di tempo | 1WTM[x] | Solo durante la registrazione del programma; Attende il periodo di tempo [x] in ms | |
| Avviare la registrazione del programma | 1PGM[x] | Iniziare la registrazione del programma nello slot [x]; Nota: Lo slot [x] deve essere libero | |
| Terminare la registrazione del programma | 1FINE | Terminare la registrazione del programma e salvare il programma | |
| Cancella programma | 1ERA[x] | Cancella il programma salvato nello slot [x] | |
| Esegui programma | 1EXC[x] | Esegui programma salvato nello slot [x] | |
| Programma Loop | 1PGL[x] | [x] 1 Modalità loop programma ON [x] - 0 Modalità loop programma disattivata | |
| Errori di lettura e cancellazione | 1ERR? | Richiedi segnalazione errori | |
Tabella 2: comandi utili per gli esperimenti di ottimizzazione post-caricamento.
Figura supplementare 1: Dimensioni dei rack in silicone. (A) Vista dall'alto, (B) vista laterale sezionale e (C) vista contestuale dei rack in silicone utilizzati per questi studi. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare Figura 2: Parametri contrattili aggiuntivi per l'aumento del postcarico graduale. Misurazioni contrattuali degli EGT di controllo (linea nera) e degli EHT sono stati coltivati su pali magneticamente reattivi (MR-EHT; linea blu) in un periodo culturale di 31 giorni. (A) gli MR-EHT avevano un tasso di produzione di forza significativamente più elevato rispetto agli EHT di controllo a partire dal giorno 27. (B) Il tasso di decadimento della forza è stato significativamente maggiore anche nei MR-EHT rispetto al controllo a partire dal giorno 27. (C) Mentre il lavoro contrattuale misurato negli EHT di controllo è gradualmente aumentato durante l'intero periodo di coltura, il lavoro contrattile prodotto dagli MR-EHT ha raggiunto il picco del giorno 26 e successivamente è sceso a livelli al di sotto del controllo. Tuttavia, il lavoro nei MR-EHT non è mai stato significativamente superiore a quello degli EHT di controllo. In questo caso, sono stati analizzati n, n, 10 MR-EHT e n 10 EHT di controllo, adattando un modello misto (REML - probabilità massima limitata) e il test di confronto multiplo di Sidak. Le barre di errore nei grafici rappresentano l'errore standard della media, p < 0,05, p < 0,001. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 3: Parametri contrattili aggiuntivi per il protocollo di intervallo afterload. È stato osservato il comportamento contrattile degli EHT magneticamente reattivi (MR-EHT) sotto l'influenza di un regime fluttuante di postload. (A) Durante il protocollo di post-caricamento intervallo, gli EOTT MR (barre blu) hanno inizialmente mostrato una tendenza verso tassi di produzione di forza più elevati rispetto agli EHT di controllo (barre nere), ma queste differenze non erano significative e diminuite verso la fine dell'esperimento. (B) I tassi di decadimento forzato misurati in MR-EHT e gli EHT di controllo erano statisticamente simili durante il protocollo di post-caricamento dell'intervallo. (C) Il lavoro contrattuale misurato per i MR-EHT è aumentato durante i primi giorni del protocollo di intervallo di post-caricamento, ma è diminuito l'ultimo giorno. Il lavoro contrattile misurato per il controllo EHT non è cambiato in modo notevole durante questo periodo di tempo. Il lavoro negli MR-EHT non è mai stato significativamente superiore al lavoro nel controllo degli EHT. Per questi esperimenti, sono stati analizzati da un test di confronto multiplo di ANOVA e Sidak a 2 vie. Le barre di errore nei grafici rappresentano l'errore standard della media. Clicca qui per scaricare questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto descrive una nuova tecnica per alterare magneticamente il post-carico nei tessuti cardiaci ingegnerizzati. Questa tecnica si basa sull'uso di uno stadio piezoelettrico per tradurre una piastra di forti magneti verso e lontano da rack magneticamente reattivi di pali in silicone. Più i due set di magneti sono vicini, più forte è il postcarico sperimentato dagli EHT coltivati su di essi.
Ci sono diversi passaggi che sono fondamentali per la produzione di successo e l'uso di questo sistema. Durante la fabbricazione di rack in silicone magneticamente reattivi, è fondamentale garantire che tutti i magneti all'interno dei pali siano orientati con la stessa polarità. Se un magnete è posizionato nell'orientamento inverso, servirà a indebolire piuttosto che aumentare la forza del campo magnetico. Allo stesso modo, questa polarità dovrebbe corrispondere a quella di tutti i magneti all'interno della piastra magnetica, altrimenti i due set di magneti respingono, piuttosto che attirarsi l'un l'altro. Inoltre, ove possibile, astenersi dall'utilizzare materiali magnetici nella costruzione del dispositivo di regolazione post-carico, in quanto possono interferire con il campo magnetico. L'alluminio è suggerito come materiale da costruzione primario per questo motivo. Allo stesso modo, se si utilizza uno stadio piezoelettrico diverso da quello elencato nella Tabella dei Materiali, assicurarsi che sia resistente ai campi magnetici e alle condizioni di coltura delle cellule standard (ad esempio, 37 c, 100% di umidità e alte concentrazioni di CO2 e O2). Infine, tenere a mente che la maggior parte delle fasi lineari piezoelettriche sono destinati ad essere montati orizzontalmente, in quanto tendono ad avere una bassa capacità di carico. Come tale, se il peso della piastra magnetica supera questa capacità di carico, un contrappeso deve essere utilizzato per scaricare il motore.
Nonostante le best practice, è abbastanza difficile mantenere la superficie dell'encoder incontaminata. In questo caso, lo stage smetterà di muoversi prima di raggiungere la posizione di destinazione durante l'esecuzione in modalità a ciclo chiuso. Il LED rosso del controller di movimento lampeggerà, inoltre il software del controller di movimento visualizzerà un messaggio di errore "Nessun codificatore rilevato". Per rimediare a questo, l'utente deve pulire la superficie dell'encoder con un pezzo di stoffa senza lamino imbevuto di alcool isopropile e lasciarlo asciugare all'aria.
Questo protocollo illustra i passaggi eseguiti dal laboratorio per produrre e implementare questo sistema. Tuttavia, molti di questi passaggi potrebbero essere raggiunti con diversi mezzi. Ad esempio, si potrebbe usare un trasduttore di forza, piuttosto che mezzi ottici, per confermare la relazione tra spaziatura del magnete e rigidità post. Inoltre, i post personalizzati potrebbero essere progettati e fabbricati con magneti e bretelle incorporati. Tuttavia, abbiamo scoperto che il posizionamento preciso di questi oggetti è più facile da realizzare manualmente. Per ottimizzare la gamma di afterload applicabili da questo sistema, questi pali possono essere fabbricati con diverse rigidità basali o con un diverso numero di magneti. Tuttavia, l'uso di troppi magneti ostacolerà la post flessione. In alternativa, questo può essere ottenuto anche regolando la dimensione e la forza dei magneti all'interno della piastra magnete. Magneti più grandi e più forti produrranno dopo carichi più elevati.
Ci sono diverse limitazioni a questo metodo che potrebbero essere migliorate nelle versioni future di questo sistema. Vale a dire, la gamma di carichi di carico applicabili è fisicamente limitata dalla spaziatura massima e minima tra i magneti post e i magneti a piastre. Idealmente, i pali utilizzati per questo sistema metterebbero i tessuti il più vicino possibile alla base del piatto di coltura dei tessuti, senza permettere direttamente al tessuto di toccare il fondo della piastra. Tuttavia, i post utilizzati in questi studi sono stati realizzati commercialmente prima dello sviluppo di questo sistema, quindi la lunghezza dei post non è stata ottimizzata per questa piattaforma. Analogamente, poiché il sistema di analisi della contrattilità EHT è stato costruito prima di questo sistema, non è stato progettato per consentire cavi elettrici all'esterno o all'esterno dello spazio di misurazione. Come tale, la presenza di questi cavi ha provocato una piccola lacuna d'aria, che ha permesso ai gas di fuoriuscire lentamente dalla camera interna. Questo potrebbe essere migliorato regolando di conseguenza le portate del gas. Tuttavia, idealmente, una futura incarnazione di questo sistema avrebbe individuato i punti di uscita e di ingresso per questi cavi. Se si desidera eseguire questi esperimenti in assenza del sistema di analisi della contrattilità EHT, la piattaforma di sintonizzazione post-carico può invece essere collocata all'interno di un'incubatrice. Tuttavia, il sistema nella sua interezza si adatta all'interno di un'incubatrice standard solo se uno o più scaffali vengono rimossi, rendendo questo spazio non disponibile per altri scopi di coltura cellulare e o dei tessuti. Per osservare otticamente i tessuti in entrambi gli ambienti, saranno necessarie luci. Le luci A LED utilizzate per questo sistema sono stati trovati per emettere una notevole quantità di calore. Se lasciato acceso per lunghi periodi, questo calore potrebbe potenzialmente danneggiare i tessuti. Come tale, per questi studi, le luci sono state utilizzate solo per brevi periodi, mentre valutavano la contrattilità dei tessuti. Tuttavia, se si desidera osservare costantemente i tessuti, il sistema di illuminazione dovrà essere ottimizzato per questi scopi.
Afterload è stato precedentemente studiato nei modelli EHT16,23. Tuttavia, queste opere hanno presentato tecniche che sono state solo in grado di ottenere un singolare aumento statico del carico. In alternativa, questo lavoro ha dimostrato come una piattaforma basata su magnetici possa essere utilizzata per ottimizzare e regolare temporalmente l'afterload negli EHT. I risultati di due serie distinte di esperimenti sono stati utilizzati per esemplificare l'ampia gamma di regimi di post-caricamento che possono essere applicati agli EHT utilizzando questo dispositivo. Le applicazioni future previste di questo sistema includono studi sull'effetto del regime di postload applicato (dose e durata) sia sulla maturazione dei tessuti che sul rimodellamento patologico.
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Disclosures
TE e MNH sono co-fondatori di EHT Technologies GmbH. Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Jutta Starbatty per il suo sostegno al lavoro di cultura dei tessuti, Axel Kirchhof per la fotografia, Alice Casagrande Cesconetto per il lavoro di editing, e un ringraziamento speciale a B .lent Aksehirlioglu per il supporto tecnico nello sviluppo di questo dispositivo. B.B. è stato sostenuto da un sussidio del Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, M.L.R. da un Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant e M.N.H. da fondi del D.H..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d = 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
References
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