Summary
在本文中，我们详细描述了从主要小鼠神经原性利基中提取的产后小鼠神经干细胞生成神经球培养的一个协议。神经球用于识别脑组织的神经干细胞，从而估计前体细胞数。此外，这些3D结构可以在不同的条件下镀，产生神经元，寡核细胞和星形细胞，允许细胞命运的研究。
Abstract
神经球测定是一种非常有用的体外技术，用于研究神经干细胞/祖细胞（NSC）的固有特性，包括增殖、自我更新和多能性。在产后和成人大脑中，NSPC主要存在于两个神经原性利基：侧心室的补助区（SVZ）和海马性腺性腺间角（DG）的亚粒区。将神经原性利基与产后大脑隔离，从而在培养中获得更高数量的NSPCs，从而获得更高的产量。每个神经圈内的细胞之间的密切接触创造了一个微环境，可能类似于神经学利基。在这里，我们详细描述如何从1⁄3天（P1+3）小鼠中生成SVZ和DG衍生的神经球培养物，以及通过神经球扩张。这是一个有利的方法，因为神经球测定允许快速生成NSPC克隆（6-12天），并有助于显著减少动物使用数量。通过在不同条件下电镀神经球，我们可以获得由NSC和不同神经谱系的分化细胞（神经元、星形细胞和寡核细胞）组成的伪单体细胞，从而能够研究内在或外在因素对NSPC增殖、分化、细胞生存和神经生成的作用。
Introduction
神经球测定（NSA）最早描述于1992年1，2，2仍然是神经干细胞（NSC）研究中一个独特而强大的工具。将NSCs与主要神经原区隔离具有具有挑战性的问题，因为在生理条件下维持这些细胞的要求仍然知之甚少。在NSA中，细胞在化学定义的无血清培养基中培养，存在包括表皮生长因子（EGF）和基本纤维细胞生长因子（bFGF）1、2、3等生长因子。1,2,3神经前体细胞（干细胞和祖细胞）是使用这些线原选择的，因为这些细胞是EGF和FGF反应进入一个活性增殖期，而其他细胞，即分化细胞，死亡4。神经前体细胞生长作为神经球，然后可以通过进一步扩大这些细胞的池5。重要的是，由于这些神经干细胞祖细胞（NSPCs）是多能的，它们能够分化成中枢神经系统（CNS）的三种主要细胞类型：神经元、寡核细胞和星形细胞5。
国家安全局提供了一种无分化的中枢神经系统前体的可再生来源，可用于研究几种过程，包括NSC增殖和自我更新，以及生理和疾病背景下的神经元和胶质分化。此外，体外研究可用于评估发育过程中神经前体内在规范的程度，以及通过去除与其正常环境相关的外在线索来研究细胞的全部潜力。神经球模型对评估假定的调节器很有价值，因为通过将细胞维持在没有血清的介质中，环境线索仅由周围的细胞6提供。此外，在NSA中，NSPCs在培养中很容易扩大，每个区域细胞的密度很高，神经球的异质组成与体内的利基6有些相似。这些公认的优势是许多研究人员广泛使用这种方法的原因。
以下协议详细介绍了从两个主要神经原区（补助区（SVZ）和海马腺密度陀螺（DG）分离产后NSPC种群到这些细胞作为神经球的膨胀，以及分化成神经元、星形细胞和寡核酸物的所有过程。最后，还描述了不同的检测，以访问SVZ和DG衍生的NSPC的茎和多能特性。
Protocol
所有实验均按照欧洲共同体（86/609/EEC;2010/63/EU;2012/707/EU）和葡萄牙（DL 113/2013）保护用于科学目的的动物的立法进行。该议定书得到了"iMM的机构动物福利机构-ORBEA-iMM和国家主管当局——DGAV——Veterinéria的核准"。
1. 文化媒介的基本设置和准备
- 在解剖当天，准备与无血清介质（SFM）对应的适当量的生长介质，由Dulbecco的改良鹰介质[（DMEM）/F12与L-谷氨酰胺]（材料表）补充，辅以100 U/mL青霉素和100μg/mL链球菌素（笔/链球菌），1%B27， 以及 10 纳克/mL EGF 和 5 纳克/mL bFGF。在水浴中将培养介质加热到 37 °C。
注：生长介质的体积取决于小狗的数量，5个小狗准备100 mL（SVZ为50 mL，DG为50 mL）;但是，在计算单元格数（步骤 5.1）后，必须调整确切的音量。 - 对于 SVZ 和 DG 的微解剖，准备无钙和无镁的 Hanks 的平衡盐水溶液 （HBSS） 解剖介质，并辅以 100 U/mL 笔/链球。
注：准备50~100 mL的解剖介质。 - 设置解剖显微镜，并准备必要的工具，以消除大脑（剪刀和小铲子）和SVZ和DG微解剖（杜蒙小剪刀，#7钳，#5钳，#5S钳子）浸泡在70%乙醇。
2. 产后（P1+3）小鼠脑和SVZ/DG微切片的收获
- 准备60毫米培养皿（生长面积21厘米2），HBSS辅以笔/链球和2个样品管（一个用于SVZ，一个用于DG），每个500μL补充HBSS。2
- 根据机构动物护理设施/指南批准的协议，对小鼠幼崽（P1+3）进行安乐死。用锋利的剪刀在脑干底部用一把锋利的剪刀进行斩首。
- 将身体的腹腔部分握在头部底部，并使用小尖剪刀，在头部的整个长度上在皮肤上进行中线切口，从而露出头骨的表面。
- 在头骨底部进行纵向切口，然后继续沿下垂缝合线切割，使用角度尽可能浅的小剪刀，以避免损坏大脑结构。
- 用弯曲的钳子将头骨剥到两侧，露出大脑。
注意：在接触大脑之前，确保解剖仪器不含乙醇。 - 使用小铲子将大脑从头骨中分离出来，通过在大脑底部滑动来切断与大脑底部相连的颅神经和血管，并将大脑转移到含有冷补充HBSS溶液的培养皿中。
- 将包含大脑的培养皿置于低放大倍率的解剖显微镜下，并将大脑置于其背面上。
- 使用细钳子，从大脑的腹部和嗅觉球中取出脑孔，同时由小脑将大脑放在原位。将大脑旋转到腹腔，然后剥去其余的脑筋。
注：去除背带膜是确保正确脑切片的关键步骤。 - 丢弃使用钳子进行切割的小脑。将孔径为 11 μm 的滤纸放在组织切碎器上（材料表），并用弯曲的钳子将大脑放在滤纸上。将大脑切成450μm的日冕部分，并使用湿层将分段的大脑收集到一个新的培养皿中，里面装满了冷补充的HBSS。
- 要解剖SVZ，使用钳子以前到后的方式分离日冕切片，直到在解剖显微镜下用侧心室达到切片。
- 用细钳子切割心室侧壁周围的薄层组织（对应于 SVZ），不包括纹状体和肉体。通过将钳子尖端置于侧心室的侧角中，隔离 SVZ：一个直接在心室下，另一个直接放入与侧心室心室区域相邻的组织中。然后，在侧心室周围切割一小行组织。
- 将解剖组织收集到样品管中，并辅以先前确定为SVZ的HBSS溶液。
注：在横向心室和海马形成开始出现的切片中排除 SVZ。 - 在 SVZ 微解剖后，以前到后时尚遍通所有切片，到达海马形成。使用钳子丢弃第一片与海马，其中DG仍然无法识别。
- 要删除 DG，请先将海马与切片隔离开来。重新聚焦显微镜，以可视化 DG 周围的边界。
- 通过在 DG 和 CA1 区域之间执行切割，然后使用钳子在 DG 和 CA3 区域之间垂直切割来分解 DG 部分。去除纤维和任何相邻的组织。
注：在P1+3动物中，DG几乎无法与艾蒙的角区别开来，但显示一个小尖端。 - 将解剖组织收集到样品管中，其中包含先前确定为 DG 的补充 HBSS 溶液。
注：海马或周围区域的整体损伤将使隔离DG更加困难。当用户不熟悉SVZ和DG组织与日冕部分的隔离时，使用产后小鼠大脑的地图集是必不可少的。
3. 组织分离
- 要分离各自管中的 SVZ 和 DG 组织，添加胰蛋白酶-EDTA 0.05%，使其最终浓度为 HBSS 中 Trypsin-EDTA 0.05% 的最终浓度。在37°C下孵育约15分钟，直到组织被合并在一起。
- 通过去除介质并连续4次加入 1 mL 的新 HBSS 补充溶液，从胰蛋白酶中清洗组织。
- 取出 HBSS，重新悬浮在 1 mL SFM 中，并辅以 10 纳克/mL EGF 和 5 纳克/mL bFGF 作为补充的消化组织。使用 P1000 移液器轻轻上下移液约 7-10 倍，从而机械地分离颗粒，直到获得均匀的细胞溶液。
注意：过度的机械分离会导致细胞死亡增加，并会对随后的细胞生长产生负面影响。
4. 细胞对测定研究细胞命运
- 在实验之前，根据第8-10节为粘附单层培养物准备涂层24孔板。
- 要计算要镀的 SVZ 或 DG 细胞的数量（在第 3 节中获得），请使用含有 0.2% Trypan 蓝色溶液并使用造血率计对细胞进行计数。
- 稀释SFM中分离细胞悬浮液，以5纳克/mL EGF和2.5纳克/mL bFGF（低EGF/bFGF）为密度，在11，300细胞/厘米2的密度下稀释，并将其涂在涂层玻璃盖玻片上。
- 24小时后，根据NSC标记（如性别确定区域Y-box 2（Sox2）和内斯汀，以及神经元血统标记（即双皮素[DCX]，用于未成熟的神经元）固定免疫细胞化学细胞（见第14节）。
注：Sox2 是接受线虫症的 NSC 标记。Sox2+/+细胞对由单个祖细胞分裂产生，反映了干细胞扩张7。
5. 产后神经干细胞作为神经球的扩展
- 要确定分离的SVZ或DG细胞悬浮液的密度（在第3节中获得），使用造血计对细胞进行计数。
- 在 SFM 中，在 2 x 104细胞/mL 的密度下稀释 SVZ 和 DG 单细胞悬浮液，并辅以 10 ng/mL EGF 和 5 纳克/mL bFGF。种子SVZ和DG细胞在未涂覆的60毫米培养皿与最终体积为5 mL/Petri盘。
- 孵育SVZ和DG细胞6~8天和10~12天，分别在37°C下形成原发性神经球，CO2为5%。
注：孵化天数超过上述时间，可以促进神经球聚合和神经球中心更高级别的细胞死亡。 - 当大多数神经球的直径为150~200μm时，执行神经球道。
注：当神经球没有适当直径时，通过神经球会破坏所有后续步骤。
6. 神经球的传递
注：以下协议可用于扩展 SVZ 和 DG 神经球。
- 要通过神经球，从60毫米培养皿中收集含有神经球的生长因子SFM，在300 x g下将离心机收集5分钟。
- 根据制造商的说明（材料表），使用化学分离试剂盒（鼠标）丢弃上清液并重新悬浮神经球颗粒。
注：精确观察孵育时间，因为它们对性能至关重要。 - 在 300 x g下离心 5 分钟，去除上清液，加入 1 mL SFM，并辅以 10 ng/mL EGF 和 5 ng/mL bFGF。
- 使用 P1000 移液器上下三酯约 10 倍，以分离神经球。
- 使用含有 0.2% 锥蓝色和造血率计的溶液计算细胞数。
- 在未涂覆的60毫米培养皿中，以2 x 104细胞/mL的密度重新培育细胞。
- 孵育SVZ和DG细胞分别为6~8天和10~12天，以获得继发性神经球，在37°C下，CO2为5%。
注：SVZ 和 DG 派生的 NSPC 的自更新能力可通过以下协议第 5 节和第 6 节访问。为此，在含有5纳克/mL EGF和2.5纳克/mL bFGF（低EGF/bFGF）的生长SFM介质中，1.0 x 104细胞/mL（在未涂层的24孔板中）的SVZ和DG细胞种子SVZ和DG细胞。计算生成的初级和次要神经球的数量。
7. 神经球的储存
- 从60毫米的培养皿中收集含有神经球的介质（从步骤5.3和6.7中获得）。
- 在 300 x g下离心 5 分钟，并丢弃上清液。
- 用 1 mL 的 HBSS（300 x g时 5 分钟）清洗细胞 2x。
- 在300 x g下离心5分钟，丢弃上清液，并将神经球颗粒储存在-20°C，用于分子生物学分析。
8. PDL 涂层板程序
- 制备溶液1（0.1M硼酸盐缓冲液），重3.92克硼酸，在400mL高纯度水中稀释。将 pH 调整到 8.2，用高纯度水产生高达 500 mL。
- 制备溶液2（0.167 M硼酸盐缓冲液），重10.3克硼酸，在900mL高纯度水中稀释。将 pH 调整到 8.2，用高纯度水产生高达 1，000 mL。
- 要重组脂-D-赖因 （PDL）（0.1 M 硼酸盐缓冲液中的 1 mg/mL），在溶液 100 mL 中稀释 100 mg PDL。
- 使 10 mL 的等号立即使用或冻结并储存在 -20 °C。
- 在层压流下，每口井加1个盖玻片，在紫外线下消毒15分钟。
- 使用重组后的 PDL 或解冻冷冻重建的 PDL。
- 通过在0.167 M硼酸盐缓冲液中加入10 mL的重组PDL到90 mL溶液2，制备100 μg/mL PDL的最终解决方案。
- 将最终溶液添加到井中至少 2 小时，以 37 °C 过夜。
注：对于 24 孔板，在每个孔中添加 500 μL 的体积。 - 取出溶液，用高纯度水洗涤3倍。
- 让盖玻片在层压流量罩中干燥。
- 将多孔培养板留在 4 °C 处。
9. PDL/拉米宁涂层板程序
- 第 1 天，按照第 8 节所述，在板上涂上 PDL。
- 第 2 天，取出 PDL 溶液，用高纯度水洗涤 3 倍。让干吧。
- 在不含生长因子的冷SFM中制备5微克/mL层压。
- 将溶解的层压素添加到盖玻片中，并在37°C下孵育过夜。
注：对于 24 孔板，在每个孔中添加 500 μL 的体积。 - 使用移液器去除层状。
注：请勿从层压中清洗盖玻片。 - 立即使用或储存在-20°C。
10. 聚-L-球素（PLO）/层宁涂层程序
- 在层压流下，每口井加一个盖玻片，在紫外线下消毒15分钟。
- 在室温 （RT） 下，将 0.01% PLO 溶液添加到每口井 20 分钟。
注：对于 24 孔板，在每个孔中添加 500 μL 的体积。 - 取出溶液，用消毒的 1x PBS 清洗 3x。让干吧。
- 在无菌的1x PBS中制备5微克/mL层压。
- 在37°C下孵育2小时。
- 取出拉米宁。
注：请勿从层压中清洗盖玻片。 - 立即使用。
注：通过用移液器尖端轻轻敲击盖玻片，确保盖玻片完全被 PLO 解决方案覆盖。当震动时，多孔板不应发出声音。
11. 通过生成分化的单层细胞来评价神经生成
- 从60毫米培养皿（从第5部分获得）收集含有神经球的介质，在RT时以300 x g的速度在离心机中收集5分钟。
- 丢弃上清液，在1 mL分离PBS中分离神经球的颗粒（即， 不含 Mg2+/Ca2+的 PBS 与 EDTA [2.7 mM KCl， 1.5 mM KH2PO4，137 mM NaCl， 8.1 mM Na2HPO4和 0.5 mM EDTA 4Na， 在 pH = 7.40°） 孵育 15 分钟，然后机械分离。或者，使用化学分离试剂盒（小鼠）分离神经球（材料表）。
- 在 RT 时在 300 x g下离心 5 分钟，并丢弃上清液。
- 在1 mL SFM中重新悬浮细胞颗粒，没有生长因子。
- 使用造血量计确定细胞密度。
- 在24孔板的涂层玻璃盖玻片上，在3，766细胞/cm2的密度下，在SFM中稀释分离细胞悬浮液，没有生长因子。
- 1~3天后，根据细胞骨架的蛋白质固定细胞化学细胞（见第14节）。
12. 神经球培养的分化
注：从细胞扩张中获得的神经球，无论是从原发神经球还是通道神经球（在第5节或第6节中获得）都可以从不同的神经谱系分化成细胞。
- 当神经球的直径为150~200μm时，在24孔板中收集25μL的神经球悬浮介质和涂布玻璃盖玻片上的板。
注：要收集更多的神经球，请轻轻旋转培养皿以集中中心的神经球。然后，从中心移液器。 - 将板在 37°C 的培养箱中放置 15 分钟，使神经球粘附在基材上。之后，添加500μL的SFM，没有生长因子（不同的条件）。
- 24小时后，用不含生长因子的新鲜SFM代替介质。
- 在37°C时，以5%的CO2和95%的大气空气区分不同的时间点（例如，体外2天和7天，DIV2和DIV7。
注：细胞生存、增殖和分化可以用不同的细胞测定进行分析。
13. 细胞生物学测定
- 细胞生存测定
- 在37°C的培养箱中固定细胞之前，将镀层神经球暴露在3微克/mL丙酸酯（PI）上30分钟。
注：PI是一种自动荧光剂，只能进入膜完整性受损的细胞8。其他分析细胞生存的方法，如卡帕塞3染色或终端脱氧核酸酯转移酶dUTP尼克端标签（TUNEL）测定。
- 在37°C的培养箱中固定细胞之前，将镀层神经球暴露在3微克/mL丙酸酯（PI）上30分钟。
- 细胞增殖测定
- 在37°C的培养箱中固定前，将镀层神经球暴露在10μM 5-溴-2'-脱氧尿素（BrdU）上4小时。
注：BrdU是一种合成胸腺酰胺模拟物，可在DNA合成过程中纳入增殖细胞9。
- 在37°C的培养箱中固定前，将镀层神经球暴露在10μM 5-溴-2'-脱氧尿素（BrdU）上4小时。
- 细胞分化测定
- 在前24小时将7天大的镀层神经球暴露在10μM BrdU中，在37°C的培养箱中。
- 更新没有生长因子（不同条件）的SFM，并允许细胞在没有BrdU的情况下发育，直到固定。
注：这些脉冲追逐实验通过与成熟神经细胞的标记共同标记，允许在协议期间评估分化成成熟细胞的后代细胞。
14. 神经球培养物的免疫染色
- 细胞固定
- 在 1x PBS 中制备 4% 的副甲醛 （PFA），并在 4°C 或 -20 °C 下储存。
- 从油井中取出没有生长因子的SFM，并在RT时在4°C下在4°C下每口井加500μL4%的PFA。
- 用1x PBS洗涤3倍，每次5分钟，盖玻片含有分化的神经球。
- 在 4 °C 下使用 500 μL 的 1x PBS 之前，将盖玻片储存在盖玻片中。
注： 如果实验没有 BrdU，请跳到步骤 14.3。
- 变性方法（仅适用于 BrdU 实验）
- 在 37 °C 下准备 1 M HCl。
- 在 1x PBS 中冲洗盖玻片 3x。
- 在含有1%非离子表面活性剂（例如，Triton X-100）的PBS中渗透细胞30分钟。
- 在37°C（±300 μL/well）下，将1 M HCl预热至37°C的变性dsDNA30~40分钟。
- 用 1x PBS 清洗井 4x。
- 渗透和阻塞
- 在 1x PBS 中冲洗盖玻片 5 分钟。
- 在 1x PBS （+300 μL/well） 中孵育 1.5 h，使用 0.5% 非离子表面活性剂和 3% 牛血清白蛋白 （BSA）。
注：对于 NeuN，在 1x PBS 中使用 6% BSA。
- 孵化和安装
- 第1天，在不清洗的情况下，在孵化室中用0.1%的非离子表面活性剂和0.3%的BSA（24孔板使用20μL/井）孵育具有原抗体的细胞（材料表）。如果抗体与氟磷结合，在4°C光保护下过夜。
- 在第 2 天，将盖玻片返回到各自的井中，并在 1x PBS 中冲洗 3x 5 分钟。
- 具有适当荧光结合的二次抗体（稀释1：200）和12 μg/mL Hoechst 33342在RT和光保护在孵化室（20 μL/覆盖单）的1倍PBS2小时对反染色。
- 在 1x PBS 中洗涤盖玻片 3x 5 分钟。
- 使用 5 μL/荧光安装介质的盖玻片将盖玻片安装到显微镜滑轨上。
- 让盖玻片在RT时干燥，防止光线照射，1天。
- 显微镜
- 使用荧光显微镜查看和获取图像。
- 对于每个条件，请使用三个复制。在每个盖玻片中，在每个盖玻片中执行细胞计数，目标为 40 倍（每个场约 100 个细胞）。
15. 准备EGF和bFGF股票解决方案
- EGF 库存解决方案
- 要重组冻干EGF，在高纯度水中稀释产品，最终浓度达到20微克/米。
- 在 -5 至 -20 °C 的微管中储存的等值和存储。
- bFGF 库存解决方案
注：bFGF 必须用 10 mM Tris 的溶液（pH 7.6）进行重组。- 打开之前，将小瓶暂时离心，将内容带到底部。
- 准备 50 mL 的 10 mM 三元，pH 7.6。为此，重60.57毫克三分（HOCH2）3CNH2），并在40mL高纯度水中稀释。将 pH 调整到 7.6，用高纯度水产生高达 50 mL。
- 在 10 mM Tris 中准备 10 mL 0.1% BSA，pH 7.6。为此，重量为10毫克BSA，并在10mL的10mMTris中稀释。
- 在层压流量罩下使用 0.22 μm 过滤器在步骤 15.2.2 和 15.2.3 中制备的滤清器解决方案。
- 在10 mM三酯中，在10 mM Tris中重组10 μg bFGF，在10 mM三酯中，以0.1%BSA0.1%的BSA，pH 7.6，达到10μg/mL的最终浓度。以-20°C进入微管，最长6个月。
Representative Results
SVZ和DG神经球，使用NSA获得，由未分化的细胞组成，对Sox2呈阳性，这是一种参与自我更新能力的转录因子，对内丁呈阳性，一种在NSPCs中表达的中间丝蛋白（图1A）。此外，SVZ衍生的神经球的尺寸比DG对应物大（图1A）。重要的是，在不同条件下，SVZ和DG衍生的NSPCs从神经球中迁移出来，形成一个伪细胞单层（图1B）。
为了获得自我更新能力，细胞对测定基于 Sox2 和 nestin 的表达进行，它们往往在分裂细胞中消失，这些细胞在开始分化过程时，结合神经元血统的标记，即 DCX。在这两个神经原系区域，可以观察到 Sox2+/+/nestin+//DCX-/-/- - 对称分区（自我更新） （图 2A1，B1），Sox2-///nestin-//=/DCX+/-不对称分（图 2A1，B2）和 Sox2-/-/-nest-/---------------------------------/------------/-________________________________/__/_____________/s2 （图2-/-+/+ A1，B2）/-/_____________________/_////_/_//_////-_/_/_/_/_//-_/_/_/-__/_/_/_/_/_/-/-_/_/_/_/_/__/_/_/_/_/_/_///-/--/--/-///-//-/-//-/-/-/-/-A1,B2A2,B1
通过神经球可增加NSC的产生;然而，DIV2的细胞死亡随传人而改变。事实上，在SVZ中的细胞通道（P0：15.6% = 1.2%对P1：19.2% = 2.7%与P2：32.35% = 0.14%对P3：39.6% = 4.0%），PI阳性细胞的百分比会增加DG（P0： 16.31% = 0.95% vs P1： 32.1% = 1.7% vs P2： 27.42% vs P3： 32.2% = 3.1%）（图3）。
神经生成可以在分化开始时从SVZ和DG NSPCs的分化中获得的神经元中评估：DIV1（图4A，D），DIV2（图4B，E）和DIV3（图4C，F）。事实上，如图4所示，中微子的长度和冲压随分化而增加。
细胞增殖可以在SVZ和DG衍生的神经球中进行评估。比较DIV1的主要分化神经球与SVZ（图5A1）和DG（图5A2），SVZ中BrdU阳性细胞的百分比高于DG（SVZ：6.15%=0.64%对DG：3.27%=0.13%;p < 0.05;n = 4;图5A3。此外，细胞分化也可以通过将BrdU染色与成熟的发育者（如识别成熟神经元的神经元核（NeuN））结合起来（图5B1，B2）来获得。图5B3显示，分化成成熟神经元的增殖祖宗百分比在SVZ和DG中相似（SVZ：12.04% = 1.58%对DG：13.56% ± 0.48%;p > 0.05;n = 4）。
SVZ 和 DG 衍生 N SPC 的干力和多能性可通过评估不同分化日（DIV2 和 DIV7）不同标记的表达式来访问 NSA。事实上，NSCs（内丁和胶质纤维酸性蛋白[GFAP]-双阳性细胞）存在于两个神经原区（图6A，G）。这些细胞能够分化成未成熟的神经元（DCX阳性细胞）（图6B，H），成熟神经元（新核阳性细胞）（图6F，L），寡核苷酸前体细胞（神经元-胶质抗原2[NG2]和血小板衍生的生长 因子受体 =[PDGFR]- 阳性细胞）（图6C，I），成熟寡核细胞（骨髓基本蛋白[MBP]阳性细胞）（图6E，K）和星细胞（GFAP阳性细胞）（图6D，J）。
不同的基质可用于涂覆盖唇，在不同条件下形成细胞的伪单体层。如补充图1所示，当盖玻片与PLO或PDL结合外涂层时，DG细胞迁移更多，而仅使用PDL（补充图1B+H）。事实上，当PDL和层压素作为基板一起使用时（补充图1C，G），DG细胞形成比单独使用PDL的SVZ细胞更融合的伪单体（补充图1A，E）。
重要的是，这些结果证明了NSA评估从两个主要神经原性利基获得的NSCs的干性和多能特性的潜力。
图1：资助区和变性陀螺衍生的NSPC培养为神经球或伪单体。（A） 代表明亮场 （A1， A3） 和荧光 （A2， A4） SVZ- 和 DG 衍生神经球的图像， 其中核被染色的 Hoechst 33342 （蓝色） 和 NSC 的 Sox2 （绿色） 和鼻（红色）.（B） 在不同条件下从SVZ和DG衍生的神经球生成的伪单体体的代表性光场图像。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：细胞对测定。从祖细胞分裂中提取的细胞对的代表性荧光图像。SVZ和DG核被染色的Hoechst 33342（蓝色），干细胞状细胞为Sox2（红色）和鼻蛋白（白色），以及未成熟的神经元与DCX（绿色）。面板 A1 和 B1 中的箭头指示 Sox2+/*/nestin+//DCX-/- - 对称自更新分区，面板 A1 和 B2 中的箭头表示 Sox2+/-/nestin+//DCX-/=不对称的分割，面板 A2 和 B1 中的虚线箭头显示 Sox2-/-/nestin-//DCX=//////////////////////=对称。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：细胞活存分析与细胞传过。在0、1、2和3通道（P0+P3）之后，对DIV2的PI阳性细胞进行定量分析，在SVZ-和DG衍生的分化神经球培养中。数据表示为均值 = SEM，n = 1+8。PI = 碘化物。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：DIV 1、2和3的内尿发生分析。代表共聚焦荧光图像，由βIII-tubulin信号识别，在SVZ和DG神经元在（A，D）DIV1，（B，E）DIV2和A,DB,E（C，F）DIV3。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：细胞增殖测定。在 DIV1 （A1） SVZ 和 （A2） DG 中，BrdU 阳性细胞的代表性共聚焦图像。（A3）DG-和SVZ衍生的分化神经球培养中DIV1的BrdU阳性细胞定量分析。数据表示为均值 = SEM，n = 4。\p < 0.05 通过 t 测试。在 DIV7 （B1） SVZ 和 （B2） DG 中，BrdU-和 NeuN 阳性细胞的代表性荧光图像。箭头表示 BrdU-/NeuN 阳性细胞。（B3）两个利基的DIV7BrdU-/NeuN阳性细胞的定量分析。数据表示为均值 = SEM，n = 4。BrdU：5-布罗莫-2'-脱氧尿碱，合成胸腺酰胺模拟物。请点击此处查看此图形的较大版本。
图6：SVZ和DG衍生的分化神经球培养中存在的神经细胞类型。SVZ- 和 DG 衍生细胞类型在神经球分化2天和7天（DIV2和DIV7）后具有代表性荧光图像，其中细胞核被沾染有Hoechst 33342（蓝色）和： （A， G） GFAP （绿色） 和鼻（红色） （B， H） 未成熟的神经元的 NSC 对于用于DCX（绿色）、（C，I）的PDGFR®（绿色）和NG2（红色）的寡核苷酸前体细胞（D，J）为GFAP（绿色），（E，K）为MBP（绿色）的成熟寡核细胞，以及（F，L）用于NeuN（红色）的成熟寡核细胞。C,IE,K请点击此处查看此图形的较大版本。
补充图1：测试不同基质的神经球依从性和迁移，形成伪单体。以多D-硅氨酸为基A,E材的SVZ衍生伪单体具有代表性荧光图像， （B， F） DG衍生伪单体以多D-赖氨酸为基质，（C、G）DG衍生伪单C,G体层采用多D赖氨酸，以层压素为基质，（D、H）DG衍生伪单体使用多D-D赖氨酸，多L-L-碱素作为基质。请点击此处查看此图形的较大版本。
Discussion
NSC的体外系统可以更好地理解细胞和分子机制，可以在体内进一步验证。NSA是一种非常强大的方法来模仿生理条件，由于其三维结构。此外，与单层培养系统等体外系统相比，这种培养系统在技术上也更容易培养10。事实上，使用NSA，通过在扩张或分化阶段，通过在培养其他细胞类型6的神经球，在细胞发育过程中，通过在扩张或分化阶段添加精确和可变的感兴趣因子，很容易控制暴露的外在线索。此外，与单层培养物相比，在NSA中，可以从少量组织或少量细胞中获得更高的细胞密度，从而进行平行研究，从而减少动物数量1。
NSA是分离和扩展NSCs11、12、13的最常见方法，可用于估计给定组织样本11,12,135中存在的前体细胞数量和不同条件下的前体细胞频率。然而，神经球和单层培养物并不考虑静止NSCs14。此外，国家安全局有一些限制1111，12，13和由此产生的神经球频率取决于许多因素，包括中分量，解剖程序，分离过程,12,1311，12，13，和神经球聚集5。11,12,13事实上，在高密度文化中，神经球倾向于聚合。因此，在估计样本中前体细胞的数量时，必须谨慎。为了克服上述限制，孤立的NSPC也可以扩大和通过单层5,5，15。重要的是，使用NSA比较不同条件之间的前体细胞频率是非常有用和准确的，因为所有这些限制是隐式的，并且在同一实验中执行的所有条件中都是类似的。
神经球培养中有一些关键步骤需要注意。在大脑收获步骤中，完全去除脑质和良好隔离神经原性利基对于最大化NSC的纯度和产量至关重要。在组织分离期间，由于胰蛋白酶的蛋白酶活性，过量使用胰蛋白酶或延长孵育时间可能导致细胞溶酶。此外，通过的日子是至关重要的获得一个健康的神经球群。直径大于200μm的神经球的传递，极大地影响了NSPCs的生存能力、增殖性和差异化能力。 重要的是，周期较长的通道，超过10个可以增加遗传不稳定性。此外，分别为SVZ和DG细胞涂上PDL和PLD/拉米宁，对于确保在不影响分化过程的情况下，确保细胞从神经球中很好地迁移至关重要。在免疫细胞化学分析方面，PFA的潜伏时间较长，通过掩盖抗原和增加背景，会损害染色。
国家安全局是一个强大的工具，提供一致和无限的NSPCs来源，为神经发育和分化的体外研究，以及治疗目的16，17。16,事实上，这种测定可以应用于遗传和行为模型，以进一步了解NSPC增殖和分化的分子和细胞机制18，19。18,这种测定也可用于测试不同的药物和化合物20，21，2221,22以及20进行基因操纵19，23，以调节19,23NSC属性。除免疫细胞化学外，还可进行逆转录聚合酶链反应和西式斑点分析，以获取RNA和蛋白质表达，同时利用电生理研究和钙成像来评估新生神经元21的功能。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了IF/01227/2015和UID/BIM/50005/2019，Projeto Financiado pela Fundaéo a Tecnologia（FCT）/Ministério da Cióncia，Tecnologia e Ensino高级基金（MCTES）的支持。R.S. （SFRH/BD/128280/2017， F.F.R. （IMM/CT/35-2018）， D.M.L. （PD/BD/141784/2018） 和 R.S.R. （SFRH/BD/129710/2017） 获得FCT研究金。作者感谢美用分子乔奥·洛博·安图内斯研究所生物成像设施的成员提供显微镜援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| 12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
| Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | Life Technologies | A11039 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
| Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
| Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
| Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
| Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
| Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
| Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
| Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
| Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
| Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
| Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
| Fine Scissors - Sharp | FST | 14060-09 | |
| Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
| Micro Spatula - 12 cm | FST | 10091-12 | |
| Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
| Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
| NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
| Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
| Phosphate standard solutions, PO43 - in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
| Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |
References
- Reynolds, B., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural Stem Cell Isolation and Characterization. Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).
- Xapelli, S., et al. Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures. PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).
- Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).
- Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population. Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).
- Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures. RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).
- Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities? Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain. SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
- Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage. PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).
- Khacho, M., et al. Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program. Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).
- Soares, R., et al. Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats. Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).
- Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebastião, A. M., Xapelli, S. Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis. Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).
- Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin? Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
- Kim, H. J., et al. Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells. Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).
