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Biology

Isolement et caractérisation des fibroblastes cardiaques adultes et des myofibroblastes

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60909
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

Summary

L’obtention d’une population pure de fibroblastes est cruciale pour étudier leur rôle dans la réparation des plaies et la fibrose. Décrit ici est une méthode détaillée pour isoler les fibroblastes et les myofibroblastes des cœurs de souris non blessés et blessés suivis par la caractérisation de leur pureté et de leur fonctionnalité par immunofluorescence, RTPCR, tri cellulaire assisté par fluorescence, et contraction du gel de collagène.

Abstract

La fibrose cardiaque en réponse aux dommages est une réponse physiologique à la cicatrisation des plaies. Des efforts ont été faits pour étudier et cibler les sous-types de fibroblastes qui atténuent la fibrose. Cependant, la recherche sur le fibroblaste a été entravée en raison de l’absence de marqueurs fibreblastaux universellement acceptables pour identifier les fibroblastes quiescents ainsi que les fibroblastes activés. Les fibroblastes sont une population de cellules hétérogènes, ce qui les rend difficiles à isoler et à caractériser. Le protocole présenté décrit trois méthodes différentes pour enrichir les fibroblastes et les myofibroblastes des cœurs de souris non blessés et blessés. L’utilisation d’un protocole standard et fiable pour isoler les fibroblastes permettra d’étudier leurs rôles dans l’homéostasie ainsi que la modulation de la fibrose.

Introduction

Les fibroblastes cardiaques, cellules d’origine mésenchymale, jouent un rôle important dans le maintien de la conduction électrique et des forces mécaniques dans le cœur en plus du maintien de l’architecture cardiaque pendant l’homéostasie1. Suite à des blessures, ces cellules sont activées, se dilatent et produisent des protéines de matrice extracellulaire (ECM)2. De nombreuses études précliniques ont révélé des fibroblastes en tant que régulateurs cellulaires critiques qui maintiennent l’intégrité structurale d’un cœur blessé3 ainsi que les cellules principales effecteur responsables de la production non contrôlée et le dépôt des protéines ECM, résultant en la formation de cicatrices raides et l’insuffisance cardiaque4. Les fibroblastes sont un groupe hétérogène de cellules, ce qui rend difficile de disséquer leur fonction réparatrice à partir de propriétés maladaptives pro-fibrotiques. Récemment, l’hétérogénéité fonctionnelle de deux sous-types fibreblastiques distincts suivant des dommages myocardiques ont été définies, indiquant la possibilité d’isoler différents sous-types de fibroblaste et d’étudier leur rôle dans la cicatrisation des plaies5.

L’obtention d’une population de fibroblastes purs est cruciale pour délimiter son rôle fonctionnel dans la réparation et la fibrose. Cependant, la présence de marqueurs fibroblastiques multiples qui reconnaissent d’autres types de cellules font qu’il est difficile d’isoler une population fibreuse sensiblement pure6. Plusieurs études élégantes ont conçu des moyens intelligents d’isoler les fibroblastes cardiaques du myocarde non blessé et blessé. La méthode la plus populaire et bien établie d’enrichir les fibroblastes est par l’adhérence sélective suivant la digestion des tissus enzymatiques7.

En outre, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) des fibroblastes à base d’antigènes de surface cellulaire a été décrit avec succès8. Dans l’étude, suivant la digestion enzymatique, les cellules mésenchymales ont été triées comme lignée-négative (Lin : Ter119-CD45-CD31-) et gp38-positive (gp38-) des coeurs de souris. Les cellules de Gp38ont été confirmées pour être des fibroblastes basés sur leur co-expression de col1-1 et d’autres marqueurs mésenchymals. Bien que la plupart de la digestion des tissus est terminée après avoir disséqué le ventricule dans un plat Petri, une étude récente a étudié l’utilisation d’une perfusion directe d’enzyme d’aiguille du ventricule gauche pour isoler les myocytes et les non-myocytes qui incluent les fibroblastes9. Les fibroblastes ont ensuite été isolés par l’adhérence sélective dans ce cas.

Ce protocole décrit l’isolement et l’enrichissement des fibroblastes à l’aide de trois méthodes. La première est une méthode déjà établie impliquant l’adhérence sélective des fibroblastes suivant la digestion enzymatique. La deuxième méthode est utilisée principalement pour isoler les muscles lisses alpha induits par les blessures exprimant des myofibroblastes. La troisième méthode implique l’épuisement séquentiel et magnétique d’une suspension de cellules cardiaques enzyme-digérées des cellules hématopoïétiques et endothéliales. Après épuisement, les fibroblastes/myofibroblastes sont isolés en fonction de la présence de l’antigène MEFSK4 à l’aide de perles magnétiques. Récemment, MEFSK4 a été décrit comme un antigène présent sur les fibroblastes quiescents ainsi que activés, ce qui en fait un marqueur approprié pour l’identification et l’isolement de fibroblaste. Naturellement, toutes les méthodes décrites ici ont des limites uniques. Il est donc fortement recommandé de vérifier la pureté de la population cellulaire isolée par analyse de flux, immunostaining, et semi-quantitative PCR en temps réel. Cependant, ces méthodologies peuvent être élargies, et des marqueurs supplémentaires peuvent être ajoutés afin d’exclure d’autres populations contaminantes avant d’utiliser les populations de fibroblastes et de myofibroblastes pour des expériences cruciales.

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Protocol

Cette étude confirme strictement les recommandations du Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Vanderbilt a approuvé le protocole (numéro de protocole : M1600076-01).

1. Dissection cardiaque

  1. Préparation de la solution
    1. Tampon KHB
      1. À l’aide d’une barre de remuer, dissoudre lentement 9,4 g de poudre tampon Krebs-Henseleit (KHB) dans 900 ml d’eau DDI.
        REMARQUE : Le tampon se précipitera si on agite trop rapidement ou trop longtemps. Le tampon KHB doit être froid pendant l’isolement fibroblastique.
      2. Ajouter 2,9 mM CaCl2 et 24 mM NaHCO3. Ajuster le pH à 7,2 à 7,3 et diluer à un volume de 1 L avec dH2O.
      3. À l’aide d’un filtre stérile (0,22 m), conserver jusqu’à 4 oC pendant une durée pouvant aller jusqu’à 4 semaines. Conserver sur la glace ou à 4 oC pour une durée d’isolement.
    2. Cocktail de digestion Collagenase
      1. Préparer le cocktail de digestion le jour de l’isolement du fibroblaste. Déterminer le volume approprié de cocktail de digestion en fonction du nombre de cœurs; 5 ml de cocktail par 1 coeur.
      2. Préparer le mélange de collagène (voir Tableau des matériaux) et DNase I selon les instructions du fabricant.
      3. Pour 20 ml de cocktail de digestion total, ajoutez 17,5 L de DNase I, 180 L de 1 M HEPES, et 500 L de collagène à un tube conical vide de 50 ml.
      4. Ajoutez un volume suffisant de la solution Hank’s Balanced Salt (HBSS) avec Ca2 et Mg2md pour obtenir un volume total de 20 ml.
    3. Tampon de lyse des globules rouges (RBC)
      1. Déterminer le volume total nécessaire en fonction du nombre de cœurs (5 ml/cœur). Diluer le tampon de stock 10x RBC lysis à 1x à l’aide de dH2O.
    4. Multimédia : 10% de FBS dans DMEM F-12
      1. Ajoutez 10% de FBS à DMEM-F12 avec L-glutamine et HEPES. Ajouter 10 U/mL pénicilline/streptomycine, 2,5 g/mL antifongique, et 2,5 g/mL mycoplasma prophylactique (voir Tableau des matériaux). Conserver à 4 oC.
  2. Dissection de coeur
    1. Préparer une plaque de 6 puits sur glace avec 2 ml de KHB froid par puits pour ranger les cœurs pendant la dissection. Utilisez des ciseaux et des forceps chirurgicaux autoclaved.
    2. Euthanasiez les souris à 12 semaines ou plus par surdosage d’isoflurane, et suivez avec la dislocation cervicale.
    3. Alternativement, pour l’isolement de fibroblaste activé, induisent l’infarctus du myocarde dans les souris de 12 semaines par la ligature coronaire d’artère10. Euthanasiez les souris 8 à 10 jours après une blessure.
    4. Vaporiser le corps avec 70% d’éthanol et d’orient de sorte que le côté ventral est face à l’expérimentateur. Épinglez ou retenez des appendices pour prévenir les interférences.
    5. Coupez la peau abdominale et le muscle ouvert, mais évitez de percer le foie. Couper verticalement vers le sternum, et ouvrir soigneusement le thorax tout en évitant le perçage du cœur. Continuez à couper à travers la cage thoracique pour exposer le cœur.
    6. À l’aide de forceps, soulevez doucement le cœur de la poitrine, coupant tout poumon ou excès de tissu attaché à l’extérieur du cœur. Retirer le ventricule et placer dans un puits de 6 assiettes de puits avec KHB froid. Continuez à disséquer les cœurs de cette manière jusqu’à ce que tous les échantillons aient été isolés.
  3. Dissociation enzymatique du cœur
    1. À l’aide de forceps, serrez et agitez à plusieurs reprises le cœur dans KHB pour enlever l’excès de sang. Transférer le cœur dans une plaque stérile propre de 10 cm2. À l’aide d’une seule lame de bord, hacher rapidement le cœur en petits morceaux.
    2. Ajouter 1 ml de cocktail de digestion de collagène et continuer à hacher jusqu’à ce que les morceaux soient assez petits pour être transférés avec une micropipette de 1 ml. Transférer les morceaux dans un tube conique de 50 ml avec une micropipette de 1 mL. Laver la plaque 2x avec 2 ml de cocktail de digestion de collagène.
      REMARQUE : Couper une partie de la pointe de la pipette peut aider à recueillir de plus gros morceaux de cœur qui pourraient autrement se coincer dans la pointe de la pipette.
    3. Incubate tube conique à 37 oC pendant 30 minutes avec bascule ou agitation. Tube sécurisé au besoin. Résuspendez 10x avec une pipet de 5 ml jusqu’à ce que le contenu soit homogène, et incubate le tube conical à 37 oC pendant 15 minutes avec rotation ou agitation.
    4. Résuspendez 10x avec une pipet de 10 ml jusqu’à consistance homogène. Primez une passoire cellulaire de 40 m en mouillant le filtre avec un tampon KHB de 1 à 2 ml au-dessus d’un nouveau tube conique de 50 ml. Ajouter 25 ml de tampon KHB à la suspension de digestion, à la résuspendance et filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 m. Modifier le filtre au besoin.
      REMARQUE : Lorsque la filtration ralentit, le tube légèrement tapotant ou l’utilisation d’une micropipette de 1 ml pour tirer la suspension du dessous du filtre peut aider la suspension cellulaire à passer à travers une passoire cellulaire partiellement bloquée de 40 m.
    5. Centrifugeuse à 400 x g et 4 oC pendant 10 min. Retirez le supernatant et réutilisez la granule dans un tampon de 1x RBC lysis (5 ml/cœur). Incuber pendant 2 min à température ambiante (RT).
    6. Centrifugeuse à 400 x g et RT pendant 10 min. Enlever le supernatant puis laver en résumant des granulés dans 1 ml de tampon KHB.
    7. Ajouter 9 ml de tampon KHB et filtrer à travers la passoire cellulaire apprêtée de 40 m dans un nouveau tube conique de 50 ml. Centrifugeuse à 400 x g et RT pendant 10 min.
    8. Retirez le supernatant, la résuspendance dans 1 ml de multimédia ou de PBS, et déterminez le numéro de cellule. Les fibroblastes peuvent être isolés par les trois méthodes différentes décrites ci-dessous.

2. Isolement des fibroblastes de la suspension à cellule unique

  1. Isolement du fibroblaste : placage différentiel(figure 1)
    1. Préparer une plaque de 6 puits en ajoutant 2 ml de multimédia par puits et en faisant tourbillonner la plaque pour couvrir le fond du puits.
    2. Résuspendent les cellules dans 1 ml de médias par cœur. Plaque 1 ml de suspension cellulaire par puits de telle sorte qu’un cœur (théoriquement) est plaqué par puits. Par exemple, six cœurs seraient résiliés dans 6 ml de support, puis plaqués en six puits avec 1 ml de suspension cellulaire par puits.
    3. Plaque tourbillonnante pour répartir uniformément les cellules. Ajouter un support supplémentaire de 1 à 2 ml par puits pour un volume total allant jusqu’à 5 ml par puits, et incuber à 37 oC pour 4 h.
    4. Les fibroblastes seront séparés par adhérence sélective après 4 h. Enlever les cellules non attachées et mortes en enlevant les médias. Laver les cellules attachées avec 2 ml de PBS et ajouter 2 à 4 ml de multimédia de fibroblaste stérile par puits. Incuber à 37 oC jusqu’à confluent. Changez de média tous les 2 à 4 jours.
  2. Isolation fibroblaste : FACS utilisant un modèle de souris de journaliste GFP (figure 1)
    1. Tampon FACS
      1. Préparer 15 ml de sérum bovin fœtal (FBS) à 15 ml de sérum bovin fœtal (FBS) en dPBS sans Ca2 et Mg2. Conserver sur glace ou à 4oC.
    2. Solution de bloqueur FC
      1. Préparer le bloqueur FC de 0,5 L (CD16/CD32 anti-souris purifié) en 25 L de FACS (1:50 dilution). 25 L de solution de bloqueur FC est nécessaire par échantillon. Conserver sur glace ou à 4 oC.
    3. Préparation de l’échantillon et coloration d’anticorps
      REMARQUE : Les dilutions d’anticorps peuvent être préparées à l’avance, mais cela peut risquer une exposition à la lumière ou à la température.
      1. Préparer 7AAD ou Ghost teindre violet 510 qui est 2x la dilution requise dans le tampon FACS. Voir le tableau 1 pour les anticorps et les dilutions.
      2. Résuspendez 500 000 cellules fraîchement isolées dans une solution de blocage de 25 L de FC pour empêcher la liaison non spécifique de la région d’anticorps FC à un récepteur FC. Incubate pendant 5 min à RT.
      3. Ajoutez 7AAD ou Ghost teindre violet 510 anticorps au volume final de 25 L de suspension cellulaire. Incuber pendant 30-60 min sur la glace dans l’obscurité.
      4. Laver en resuspending dans 1 ml de tampon FACS. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à 4 oC.
      5. Pellet de résuspendance dans le volume recommandé d’échantillon de cytométrie d’écoulement de tampon DE FACS (300 l) et transfert au tube de cytométrie d’écoulement.
    4. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
      REMARQUE : Les souris de journaliste de GFP-SMA ont été une contribution du Dr Ivo Kalajzic11. Cette souris exprime GFP sous le promoteur alpha lisse de cellules musculaires lisses. Le SMA a été utilisé comme marqueur de fibroblastes activés (myofibroblastes)12.
      1. Pour l’isolement du fibroblaste activé (SMA exprimant le myofibroblast), induire l’infarctus du myocarde chez les souris GFP-SMA âgées de 12 semaines par ligature coronaire. Sacrifiez les souris 8 à 10 jours après une blessure.
      2. Suite à la suspension à cellule unique des cœurs de souris blessées, trier les fibroblastes de ve del’ASMA pour les protéines fluorescentes vertes (GFP). Utilisez des fibroblastes non blessés non contaminés pour définir le signal d’arrière-plan dans le canal GFP après la compensation.
      3. Porte pour les cellules GFPve en gating pour 7AAD-ve/GFP-ve cellules ou Ghost dye violet 510-ve/GFP've cellules et trier GFP exprimant myofibroblastes 'SMA've. Recueillir les cellules dans les médias de fibroblaste.
  3. Isolement du fibroblaste : isolement magnétique à base de perles des fibroblastes(figure 1)
    1. Tampon d’équilibre
      REMARQUE : Préparez toujours un tampon frais pour les isolements.
      1. Préparer 0,5% BSA et 2 mM EDTA dans PBS. Dégazer le tampon en remuant la solution tout en attachant un aspirateur au couvercle du récipient.
        REMARQUE : L’agitation élimine l’excès de gaz de la solution qui est ensuite enlevée par le vide de telle sorte que les bulles ne obstruent pas la colonne de séparation lors de l’utilisation.
    2. Étiquetage magnétique : CD45et cellules hématopoïétiques
      1. Centrifuge cellules isolées des cœurs de souris à 500 x g pendant 5 min, puis enlever le supernatant.
      2. Résuspendez la pastille de cellules en tampon d’équilibre de 1 ml. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
      3. Centrifuge la suspension cellulaire comme ci-dessus et résuspendez la pastille cellulaire dans un tampon d’équilibre de 90 l par 1 x 107 cellules totales. Ajouter 10 L de CD45et perles magnétiques par 1 x 107 cellules totales. Bien mélanger et incuber pendant au moins 15 minutes à 4 oC.
      4. Laver les cellules en ajoutant un tampon d’équilibre de 2 ml par 1 x 107 cellules totales, puis la centrifugeuse à 500 x g pendant 10 min à 4 oC.
      5. Enlever le supernatant, compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et résuspender jusqu’à 1 x 107 cellules totales dans 2 ml de tampon d’équilibre. Si plus de 107 cellules sont présentes, échelle le tampon linéairement. Passer les cellules à travers un filtre de 40 m pour empêcher les agrégations cellulaires d’obstruer la matrice de la colonne de séparation.
    3. Séparation magnétique : CD45et cellules hématopoïétiques
      1. Placez la colonne de séparation dans le champ magnétique d’un séparateur approprié et colonne d’équilibre avec au moins 3 ml de PBS.
      2. Recueillir les cellules non étiquetées dans le flowthrough (FT), et laver la colonne 3x avec 3 ml de tampon d’équilibre. Recueillir les lavages avec FT. Retirer la colonne du séparateur. Placez la colonne sur un tube conique de 15 ml.
      3. Débrinez les cellules CD45étiquetées magnétiquement en pipe de 5 ml de tampon d’équilibre sur la colonne et en plongeant fermement les cellules avec un piston fourni avec la colonne.
      4. Centrifuge eluent ainsi que FT/ lavage fractions à 500 x g. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    4. Étiquetage et séparation magnétiques : CD31et cellules endothéliales
      1. Protocole de répétition pour l’étiquetage et la séparation de CD45et magnétiques (sections 2.3.2-2.3.3), sauf utiliser des perles magnétiques CD31pour incuber avec le FT et laver les parties du CD45et l’isolement.
    5. Étiquetage et séparation magnétiques : MEFSK4et fibroblastes
      1. Protocole de répétition pour l’étiquetage magnétique CD45à l’aide de l’anticorps MEFSK4 anti-alimentation-APC au lieu de perles magnétiques. Centrifuge les portions FT et Wash du CD31- isolement à 500 g pendant 5 min, puis retirer supernatant. Résuspendez la pastille cellulaire dans 1 ml de tampon d’équilibre, et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
      2. Ajouter 10 L d’anticorps anti-alimentation-APC MEFSK4 par 1 x 107 cellules. Incuber pendant au moins 15 minutes à 4 oC.
      3. Laver les cellules liées aux anticorps MEFSK4 en ajoutant 5 ml de tampon d’équilibre par 1 x 107 cellules totales, puis la centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min.
      4. Retirez le supernatant et la résuspendance dans les perles anti-APC, en utilisant le même volume d’anticorps anti-alimentation-APC MEFSK4 utilisé. Incuber sur la glace pendant 15 min à 4 oC.
      5. Centrifugeuse à 500 x g pendant 10 min. Enlever le supernatant, la résuspendance dans 2 ml de tampon d’équilibre par 1 x 107 cellules totales, et procéder à la séparation magnétique comme décrit précédemment (section 2.3.3). Les fibroblastes MEFSK4+vede séparation magnétique /CD45 -ve/CD31-ve peuvent être utilisés pour des analyses de pureté et d’autres applications en aval.-ve-ve

3. Analyse de pureté et de fonctionnalité de la population fibroblastique isolée

  1. Analyse de la pureté de la population de FACS : analyse des cellules de la SMA-GFP(figure 2)
    1. Résuspendez des cellules fraîchement isolées dans la solution de blocage de 25 L de Fc pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps. Incubate pendant 5 min à RT.
    2. Facultatif : ajouter 25 L de 7AAD ou Ghost teindre violet 510 à la suspension cellulaire. Incuber pendant 30-60 min sur la glace dans l’obscurité.
    3. Laver en resuspending dans 1 ml de tampon FACS. Centrifugeuse à 500 x g pour 5 min.
    4. Resuspendez des granulés dans 50 L de tampon FACS. Ajouter directement les anticorps CD31-PE, CD45-APC et AN2/NG2 directement à la suspension cellulaire. Incuber pendant 15 min sur la glace(tableau 1).
    5. Laver en resus en attendant dans un tampon FACS de 1 mL. Centrifugeuse à 400 x g pour 5 min.
    6. Ajouter l’anticorps anti-rat d’âne AlexaFluor 405 aux cellules étiquetées avec l’anticorps primaire non soumis. Incuber pendant 30 min sur la glace.
    7. Laver en resuspending dans 1 ml de tampon FACS. Centrifugeuse à 400 x g pour 5 min.
    8. Resuspendez les granulés dans le volume recommandé d’échantillon de cytométrie d’écoulement de tampon DE FACS (300 ll) et transfert à un tube de cytométrie de débit étiqueté pour l’analyse de flux.
      REMARQUE : L’analyse de FACS pour caractériser l’expression de l’antigène MEFSK4 sur les fibroblastes isolés est décrite dans la section 3.3.
  2. Analyse de pureté du fibroblaste : immunofluorescence(figure 3A)
    1. Graine 30 000 fibroblastes primaires (P0-P1) par puits sur les couvertures placées dans une plaque de puits de 24 et une culture jusqu’à 80 % confluent. Ou concentrez lescellules TRIées CD45+ et CD31 (30 000 cellules par puits) sur un coverlip par cytospin à 400 x g (méthode utilisée pour déposer des cellules directement et uniformément sur un coverlip dans une plaque de 24 puits).
    2. Fixer les cellules à l’acétone froide pendant 15 min. Laver 3x fois avec PBS.
    3. Bloc glisse dans le sérum de chèvre à 10 %. Glisse incubées avec anticorps primaires pendant la nuit (tableau 2).
    4. Laver les diapositives 3x dans PBS. Incuber les anticorps secondaires pour 2 h (tableau 2).
    5. Contre-place glisse, et monter avec une goutte de DAPI dans les supports de montage lent-fade.
  3. Analyse de la pureté de la population FACS : sondage MEFSK4(figure 3B)
    1. Résuspendez des cellules fraîchement isolées dans la solution de blocage de 25 L de FC pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps. Incubate pendant 5 min à RT.
    2. Facultatif : ajouter 25 L de 7AAD ou Ghost teindre violet 510 à la suspension cellulaire. Incuber pendant 30-60 min sur la glace dans l’obscurité.
    3. Laver en resuspending dans 1 ml de tampon FACS. Centrifugeuse à 500 x g pour 5 min.
    4. Resuspendez des granulés dans 50 L de tampon FACS. Ajouter l’anticorps MEFSK4 directement à la suspension cellulaire. Incuber pendant 15 min sur la glace (tableau 1).
    5. Laver en resuspending dans 1 ml de tampon FACS. Centrifugeuse à 400 x g pour 5 min.
    6. Ajouter le rat IgG-APC aux cellules (tableau 1). Incuber pendant 30 min sur la glace.
    7. Laver en resuspending dans 1 ml de tampon FACS. Centrifugeuse à 400 x g pour 5 min.
    8. Pellet de résuspendance dans le volume recommandé d’échantillon de cytométrie d’écoulement de tampon DE FACS (300 l) et transfert au tube de cytométrie d’écoulement pour l’analyse de flux.
  4. Analyse de pureté fibroblaste : rtPCR semi-quantitatif en temps réel(figure 3C)
    1. Isolement de l’ARN et PCR semi-quantitatif en temps réel
    2. Suite à l’enrichissement des fibroblastes, isolez l’ARN à l’aide d’un kit d’isolation de l’ARN (voir Tableau des matériaux). Suivez les instructions du fabricant.
    3. Complétez la synthèse de l’ADN du premier brin à l’aide d’un kit de synthèse de l’ADN (voir tableau des matériaux),suivant les instructions du fabricant.
    4. Effectuer semiquantitative en temps réel PCR5.
  5. Analyse de fonctionnalité fibroblaste : analyse de la contractilité du gel de collagène (figure 4)
    1. Solution collagène
      1. Préparer 20 mM HEPES et 44 mM NaHCO3 en DMEM. Ajouter 1,67 mg de collagène de rat de type 1 par 1 ml de DMEM avec HEPES et NaHCO3.
    2. DMEM complété par TGFMD
      1. Préparer 10% FBS en DMEM complété par des antibiotiques et anti-fongiques. Ajouter TGFMD à une concentration finale de 1 ng/mL.
    3. Mélange de cellules/collagènes et placage
      1. Préparer la suspension cellulaire (P3-P5) et déterminer le volume requis pour obtenir 3,3 x 105 cellules.
      2. Ajouter le volume de suspension avec 3,3 x 105 cellules à une solution de collagène suffisante pour obtenir un volume total de 1 ml.
        REMARQUE : La concentration de type 1 de collagène de rat devrait maintenant être de 1,5 mg/mL.
      3. Dans une assiette de 48 puits, graine 300 L de mélange de collagène cellulaire par puits (1 x 105 cellules/puits). Incuber à 37 oC pendant 15-20 min jusqu’à ce que gélifié.
      4. Utilisez une aiguille de 30 G pour séparer le gel des murs du puits. Ajoutez 600 L de TGF ET FBS complété DMEM à chaque puits. Plaques d’image sur un scanner réfléchissant à 24 h et 48 h.
        REMARQUE : Toutes les expériences d’immunofluorescence ont été réalisées sur une machine de cytométrie de débit équipée de trois lasers (405 nm, 488 nm, et 640 nm). Les données ont été acquises à l’aide d’un logiciel d’acquisition de données de flux(Tableau des matériaux). D’autres analyses de données ont été effectuées à l’aide d’un logiciel d’analyse des données de flux. AlexaFluor 405 et Ghost Dye Violet 510 étaient excités par le laser 405 nm et recueillis à l’aide d’un filtre 450/50 BP et 525/50 BP, respectivement. GFP et PE ont été excités par le laser 488 nm et recueillis à l’aide des filtres BP 530/30 et 575/26 BP, respectivement. APC ou AlexaFluor 647 a été excité par le laser 640 nm et recueilli à l’aide d’un filtre BP 670/14. Toutes les expériences de tri cellulaire ont été réalisées sur une machine de cytométrie de débit(Tableau des matériaux) équipée de quatre lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm et 640 nm). 7-AAD était excité à l’aide du laser 561 nm et recueilli avec un filtre BP 670/14. GFP et Ghost Dye Violet 510 ont été collectés à l’aide des mêmes combinaisons laser/filtre que décrits ci-dessus. Toutes les expériences de tri ont utilisé une buse de 100 um avec une configuration de pression de 17 psi pour une viabilité accrue en aval des cellules cibles.

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Representative Results

Système de gating de flux démontrant l’isolement de myofibroblast utilisant des souris de journaliste de 'SMA-GFP
Les cœurs indemnes n’ont montré aucune GFP détectable- cellules dans le modèle de souris journaliste de 'SMA-GFP ; par conséquent, ils ont été utilisés pour établir une porte pour le signal de fond du canal GFP post-compensation(figure 2). Les cellulesde la SMA ont été triées en fonction de la présence de l’expression GFP du ventricule gauche blessé 10 jours après l’IM. Un faible pourcentage des cellules endothéliales (GFPMD/CD31MD; SD - 3,8% - 0,0164; n 5) et hématopoïétique (cellules GFPMD/CD45MD; SD - 3,18% - 0,0112; n - 5) cellules ont également exprimé GFP dans les coeurs blessés de souris de la SMA-GFP(figure 2A). Cependant, les cellules GFPMD/CD31-/CD45 n’ont pas exprimé l’AN2, un marqueur périicyte.

Cellules fibroblastes non blessées (quiescentes) et blessées (activées, 'SMA'etGFP' ont exprimé des marqueurs de fibroblaste
Les cellules de GFPMD isolées des souris de la SMA-GFP ont exprimé la chaîne alpha-1 de type 1 de collagène (COL1-1), la vimentine et la periostine lorsqu’elles sont analysées par l’analyse de la FI. Les fibroblastes non blessés isolés par l’adhérence sélective exprimaient la vimentine mais ne manifestaient pas l’expression des marqueurs fibroblastiques activés : 'SMA, periostin, et COL1 '1 (figure 3A). Les fibroblastes non blessés et activés ont exprimé l’antigène MEFSK4 lorsqu’ils ont été analysés par analyse du débit(figure 3B). Les cellules MEFSK4-ve isolées magnétiquement des cœurs de souris non blessées exprimaient des marqueurs de fibroblastes : Col1a1, pdgfrMD et periostin. En revanche, les cellules positives magnétiquement isolées de CD45 et de CD31 ont eu l’expression négligeable des marqueurs de fibroblaste.

Les fibroblastes et les myofibroblastes ont démontré la capacité de contracter le collagène
Dans la culture cellulaire sur le plastique rigide, les fibroblastes ont été montrés pour contracter des gels de collagène en présence de TGF, démontrant leur capacité fonctionnelle de contraction13,14. Cette caractéristique in vitro des fibroblastes est très semblable à la contraction de tissu conjonctif qui se produit pendant la réparation de tissu aussi bien que d’autres processus biologiques. Les fibroblastes non blessés, isolés par l’adhérence sélective, et les myofibroblastes, isolés et triés à partir de souris de la SMA-GFP, ont démontré une capacité à contracter le collagène(figure 4).

Figure 1
Figure 1 : Schéma d’isolement fibroblastique à l’aide de trois approches différentes. (A) placage différentiel, (B) GFPmd tri cellulaire des cellules positives de l’ASMA, et (C) l’isolement à base de perles magnétiques des fibroblastes. Champ lumineux représentatif des cellules dans la culture suivant le placage différentiel. Barre d’échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Analyse FACS des cellules individuelles isolées des cœurs de souris de la SMA-GFP suivant l’IM. (A) Le système représentatif de gating FACS démontrant les cellules de GFPMD co-exprimant cd31, CD45, ou AN2 des souris de la SMA-GFP ont blessé des cœurs 10 jours après l’infarctus du myocarde (MI). (B) Quantification graphique des données FACS présentées pour les cœurs post-MI; n 5 expériences ont été réalisées indépendamment (p 'lt; 0.0001 comme calculé à l’aide d’ANOVA à sens unique avec le test de comparaisons multiples de Tukey). Ce chiffre est adapté de Saraswati et al.10. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Analyse de pureté des fibroblastes isolés des cœurs de souris non blessés et blessés. (A) La coloration de l’immunofluorescence des populations cellulaires (P0) du cœur des souris non blessées ou blessées de la SMA-GFP triées par le FACS. Les cellules non blessées et activées expriment des marqueurs de fibroblaste (FB), tels que COL1-1, et vimentin, mais pas le marqueur hématopoïétique CD45 ou le marqueur endothélial CD31. Les cellules isolées du cœur blessé de souris de la SMA-GFP ont exprimé des marqueurs fibroblastes activés, la SMA et la periostine, qui n’étaient pas présentes dans les cellules isolées des cœurs de souris non blessés. Les noyaux ont été tachés de DAPI, n 3 expériences ont été effectuées indépendamment. Barre d’échelle de 100 m (B) Le représentant FACS superpose l’histogramme de fibroblastes non blessés et activés (P3-P5) montrant l’expression du marqueur fibroblaste MEF-SK4. Pour un contrôle négatif, le rat IgG a été utilisé, n 2 expériences ont été effectuées indépendamment. (C) Changement de pli relatif de Col1 -1, CeofrMD, et les transcriptions Postn dans les fibroblastes MEKSK4-ve non blessés, n 3 expériences ont été effectuées indépendamment (p 'lt; 0.05 comme calculé à l’aide d’ANOVA bidirectionnel avec le test de comparaisons multiples de Tukey). (A) et (B) sont adaptés de Saraswati et coll.10. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Caractérisation fonctionnelle des fibroblastes isolés des cœurs de souris non blessés et blessés. Figure représentative de la contraction du gel de collagène en+ présence de fibroblastes activés non blessés et blessés (P3-P5). Le graphique représente le changement en pourcentage dans la zone initiale du gel après 24 h et 48+ h de contraction lorsqu’il est incubé avec des fibroblastes activés non blessés et blessés, les fibroblastes, n - 2 ont été effectués indépendamment. Ce chiffre est adapté de Saraswati et al.10. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Anticorps Cible cellulaire Dilution
7AAD Cellules mortes 1:1000
Violet de teinture fantôme 510 Cellules mortes 1:1000
APC-CD45 Cellules hématopoïétiques 1:200
PE-CD31 Cellules endothéliales 1:200
anti-AN2/NG2 Péricytes 1:11
Âne anti-rat alexa fluor 405 Anticorps secondaires 1:100
Cellules anti-alimentation-APC (MEFSK4) Fibroblastes 1:100
Rat IgG-APC Contrôle isotype 1:100

Tableau 1 : Colorants et anticorps FACS.

Anticorps primaires Dilution
Actine musculaire lisse (SMA) 1:1000
Protéines spécifiques au fibroblaste 1 (FSP1)1:250 1:100
COL 1-1 1:1000
Periostin 1:100
Vimentin Vimentin 1:200
CD31 (en anglais) 1:250
CD45 (en anglais) 1:250
Anticorps secondaires Dilution
Chèvre anti-souris Alexa Fluor 488 1:200
Chèvre anti-lapin-FITC 1:200
Chèvre anti-lapin-Cy3 1:200
Chèvre anti-rat Alexa Fluor 488 1:200
Chèvre anti-rat Alexa Fluor 647 1:200

Tableau 2 : Anticorps primaires et secondaires d’immunofluorescence.

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Discussion

Les fibroblastes sont un groupe hétérogène de cellules, identifiée par divers ensembles de marqueurs. Les marqueurs protéiques qui ont été utilisés pour identifier les fibroblastes sont le récepteur du domaine de la discoïtine 2 (DDR2), la fibronectine, la vimentine, le collagène I et III, et Thy115,16,17,18,19,20. Alors que la vimentine a été utilisée pour identifier les fibroblastes cardiaques quiescents non blessés, les protéines spécifiques fibroblastes 1, la SMA et la periostine ont été montrés pour identifier les fibroblastes activés induits par les blessures, avec la SMA étant le marqueur le plus commun pour détecter les fibroblastes activés6,12,21. En outre, les protéines Tcf21 et MEFSK4 ont acquis une reconnaissance récente en reconnaissant à la fois les fibroblastes quiescents trouvés dans les tissus cardiaques non blessés ainsi que les fibroblastes activés, y compris les myofibroblastes trouvés dans les cœurs de souris blessés21,22.

Ce protocole utilise trois approches différentes pour isoler et enrichir les fibroblastes et les fibroblastes activés, y compris les myofibroblastes. La capacité du fibroblaste à adhérer de préférence au plastique est utilisée dans la première approche pour l’isolement. Après digestion enzymatique avec liberase, la suspension à cellule unique des cellules est ensemencée sur un plat en plastique pour adhérer de préférence. L’incapacité de nombreuses cellules non fibroblastes à adhérer à la surface du polystyrène des plats Petri nous permet d’enlever tous les supports du plat et de rester avec une population relativement pure de fibroblastes. Une mise en garde de l’utilisation de cette technique est bien que les fibroblastes adhèrent préférentiellement au plat de polystyrène, quelques cellules non-fibroblastes contaminantes peuvent également attacher, laissant une population non homogène de cellules.

La deuxième technique d’isolement utilise facS pour séparer les myofibroblastes exprimant l’expression d’autres cellules. Dans le modèle de souris transgénique utilisé ici, GFP est exclusivement exprimé avec la SMA, de sorte que les myofibroblastes contenant 'SMA peuvent être détectés par une machine FACS grâce aux capacités fluorescentes de GFP. Cette procédure d’isolement nous permet d’obtenir une population de cellules qui est d’environ 99% myofibroblast. Les analyses de pureté de ces cellules ont été largement décrites par Saraswati et coll.10.

La troisième technique d’isolement est un moyen efficace d’isoler les fibroblastes non blessés et activés par la séparation magnétique à base de perles de la cellule d’expression MEFSK4. En permettant à une seule cellule de se lier aux perles magnétiques anti-CD45 et anti-CD31 et de s’immobiliser dans une matrice en raison des effets du champ magnétique, cela a permis la séparation de toute cellule hématopoïétique ainsi que des cellules endothéliales qui ont pu contaminer le l’isolement fibroblaste. Comme MEFSK4 a récemment été utilisé comme marqueur fiable pour identifier les fibroblastes, un anticorps qui se liera aux cellules d’expression MEFSK4 est capable d’être appliqué. Après avoir lier une perle magnétique à l’anticorps, créant un complexe qui permet l’isolement des fibroblastes, le complexe magnétique de perles-cellules est passé par une matrice dans un champ magnétique, et une population fibreuse fortement enrichie est obtenue. La pureté de la population fibroblaste isolée devrait être évaluée par immunostaining, RTPCR, et les analyses de cytométrie de flux.

Comme pour toute autre technique, il y a des limites avec les techniques décrites dans ce manuscrit. La limitation du protocole d’adhérence sélective et de l’isolement à base de perles magnétiques est que ces méthodes ne font pas de distinction entre les fibroblastes quiescents et activés. Afin d’enrichir les fibroblastes activés, l’isolement doit être effectué 8-10 jours après l’infarctus du myocarde. En outre, il est important de vérifier la pureté de l’isolement avec d’autres marqueurs de fibroblaste. La pureté fibroblastique meFSK4-positive n’a été démontrée que par RTPCR, il est recommandé de tester (par immunostaining et analyse de cytométrie de débit) avec d’autres marqueurs et marqueurs de fibroblaste qui reconnaissent les types de cellules contaminantes, y compris l’hématopoïétique (CD45), endothéliale (CD31), et péricytes (AN2). Si possible, d’autres marqueurs spécifiques au fibroblaste pourraient être utilisés pour trier ou isoler magnétiquement la population de fibroblastes.

L’utilisation de souris de LSMA-GFP pour isoler et trier les myofibroblastes est une technique fiable pour obtenir une population de fibroblastes activés. Cependant, un pourcentage négligeable de cellules hématopoïétiques et endothéliales a été observé dans l’analyse de flux. Pour améliorer cette technique, les cellules CD45-ve/CD31-ve et AN2-ve devraient être exclues du tri des cellules GFP've/'SMA’ve.+ve Étant donné que la SAS est un marqueur largement accepté des myofibroblastes, le modèle de souris journaliste de la SMA-GFP est un outil précieux qui devrait être exploité pour étudier les myofibroblastes dans le contexte des blessures myocardiques.

Il y a plusieurs étapes cruciales de dépannage qui doivent être prises en compte. Le temps de digestion peut être diminué si la viabilité et le rendement des cellules sont affectés. Une barre d’agitation ne doit pas être utilisée pour remuer le mélange de digestion, car cela affecte la viabilité cellulaire. Le tube doit être fixé sur un rocker ou dans un incubateur secouant pour agiter doucement le mélange de digestion. La réépuciation du tissu digéré 10x avec une pipette de 5 ml ou 10 ml est cruciale pour une dissociation appropriée des cellules.

Une bonne lyse des globules rouges de la suspension à cellule unique doit être utilisée si les cellules vont être triées ou analysées par cytométrie d’écoulement. Pour l’isolement de perle magnétique, le dégazage du tampon est essentiel pour empêcher l’introduction de toutes les bulles d’air dans la colonne. La colonne utilisée pour l’isolement des cellules de perle magnétique ne doit pas être réutilisée entre différentes cellules magnétiques conjuguées aux perles. Par exemple, une nouvelle colonne devrait être utilisée pour séparer lescellules CD45, qui doivent être jetées après l’autorisation des cellules CD45, puis une autre nouvelle pour l’isolementdes cellules CD31.+ Dans nos mains, nous n’avons pas vu la contamination des péricytes dans les fibroblastes isolés/triés. Cependant, MEFSK4 a été montré pour reconnaître péricytes22. Il est donc recommandé d’utiliser une étape supplémentaire pour trier ou épuiser magnétiquement les péricytes (AN2) à partir des cellules individuelles. Bien que ce protocole soit validé chez des souris de 12 semaines, la technique peut être utilisée pour les souris plus jeunes ou plus âgées.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs veulent remercier le Dr Ivo Kalajzic pour les souris de la SMA-GFP. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de prix R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the NIH sous le numéro de prix R21EB019509 (P.P.Y.), et la subvention de développement scientifique de l’American Heart Association sous le numéro de prix 17SDG33630187 (S.S.). Des analyses de cytométrie de débit ont été effectuées au VUMC Flow Cytometry Shared Resource, qui est soutenu par le Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) et le Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) Sigma Aldrich A9528
Bovine Serium Albumin (BSA) Sigma 9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES Life technologies 11330057
Dnase I(20U/mL) BioRad 7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ Gibco 13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technologies 16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ Corning 21-023-CV
1M HEPES Corning 25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powder Sigma K3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) Invivogen ant-mpp
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis Buffer Miltenyi 130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) Molecular Probes A1310 dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APC BD Bioscience 559864 dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PE BD Bioscience 553373 dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31 BD Biosciences 553370 dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45 BD Biosciences 553076 dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1 MD Bioproducts 203002 dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) Tonbo Biosciences 13-0870 dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11029 dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3 Southern Biotech 4050-02 dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITC Jackson Immunoresearch Laboratories 711-165-152 dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647 Thermo-Fisher A21247 dilution = 1:200; RRID = AB_141778
Periostin Santa Cruz SC67233 dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
Vimentin Sigma Aldrich V2258 dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA) Sigma Aldrich A2547 dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1) Millipore 07-2274 07-2274 dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic Beads Miltenyi Biotec 130-052-301
CD31 Magnetic Beads Miltenyi Biotec 130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) Miltenyi Biotec 130-102-900 dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC Beads Miltenyi Biotec 130-090-855
Rat IgG-APC Miltenyi Biotec 130-103-034 dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405 Abcam ab175670 dilution = 1:100
anti-AN2/NG2 Miltenyi Biotec 130-097-455 dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm Filter Thermo Scientific 723-2520
10 cm2 Cell Culture Dish Corning 430167
10 mL Pipet Fisherbrand 13-678-11E
40 µm Cell Strainer Fisherbrand 22363547
5 mL Pipet Fisherbrand 13-678-11D
50 mL Conical Tube Falcon 352070
6-well Plate Corning 3506
Flow Cytometry Tubes Falcon 352058
Forceps
Rocker
Single Edge Blade PAL 62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini Kit Qaigen 74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit Ambion AM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit BioRad 1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) BD Biosciences

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References

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Biologie Numéro 157 isolement 'SMA tri cellulaire activé par fluorescence fibroblastes myofibroblast gel de collagène immunofluorescence MEFSK4
Isolement et caractérisation des fibroblastes cardiaques adultes et des myofibroblastes
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Melzer, M., Beier, D., Young, P. P., Saraswati, S. Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts. J. Vis. Exp. (157), e60909, doi:10.3791/60909 (2020).

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