Summary
Este protocolo describe cómo cortar y cultivar el tejido cardíaco en condiciones fisiológicas durante 6 días. Este sistema de cultivo podría utilizarse como plataforma para probar la eficacia de nuevas terapias de insuficiencia cardíaca, así como pruebas fiables de cardiotoxicidad aguda en un modelo de corazón 3D.
Abstract
Muchos fármacos novedosos fallan en los estudios clínicos debido a los efectos secundarios cardiotóxicos, ya que los ensayos in vitro actualmente disponibles y los modelos animales in vivo predicen mal las responsabilidades cardíacas humanas, lo que representa una carga multimillonaria para la industria farmacéutica. Por lo tanto, existe una necesidad médica mundial insatisfecha de mejores enfoques para identificar la cardiotoxicidad de los medicamentos antes de emprender costosos y lentos ensayos "primero en el hombre". Actualmente, sólo se utilizan células cardíacas inmaduras (cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre [hiPSC-CP]) para probar la eficiencia terapéutica y la toxicidad farmacológica, ya que son las únicas células cardíacas humanas que se pueden cultivar durante períodos prolongados para probar la eficacia y toxicidad de los medicamentos. Sin embargo, un solo tipo de célula no puede replicar el fenotipo del tejido cardíaco 3D complejo que se forma de varios tipos de células. Es importante destacar que el efecto de los medicamentos debe probarse en los cardiomiocitos adultos, que tienen diferentes características y respuestas de toxicidad en comparación con los hiPSC-CP inmaduros. La cultuación de las rodajas de corazón humano es un modelo prometedor de miocardio humano intacto. Esta tecnología proporciona acceso a un sistema multicelular completo que imita el tejido cardíaco humano y refleja las condiciones fisiológicas o patológicas del miocardio humano. Recientemente, a través de la optimización de los componentes de los medios de cultivo y las condiciones de cultivo para incluir la estimulación eléctrica continua a 1,2 Hz y la oxigenación intermitente del medio de cultivo, desarrollamos una nueva configuración del sistema de cultivo que preserva la viabilidad y la funcionalidad de las rebanadas de corazón humano y de cerdo durante 6 días en cultivo. En el protocolo actual, estamos detallando el método para cortar y cultivar el corazón del cerdo como ejemplo. El mismo protocolo se utiliza para cultivar rebanadas de corazones humanos, de perros, ovejas o gatos. Este sistema de cultivo tiene el potencial de convertirse en un potente modelo predictivo humano in situ para pruebas de cardiotoxicidad aguda que cierra la brecha entre los resultados de las pruebas preclínicas y clínicas.
Introduction
La cardiotoxicidad inducida por fármacos es una de las principales causas de retirada del mercado1. En la última década delsiglo XX, ocho fármacos no cardiovasculares fueron retirados del mercado, ya que resultaron en la muerte súbita debido a arritmias ventriculares2. Además, varias terapias contra el cáncer (aunque en muchos casos eficaces) pueden conducir a varios efectos cardiotóxicos incluyendo cardiomiopatía y arritmias. Por ejemplo, las terapias tradicionales (por ejemplo, antraciclinas y radiación) como las dirigidas (por ejemplo, trastuzumab) pueden dar lugar a complicaciones cardiovasculares en un subconjunto de pacientes3. Una estrecha colaboración entre cardiólogos y oncólogos (a través del campo emergente de la "cardiooncología") ha ayudado a que estas complicaciones sean manejables asegurando que los pacientes puedan ser tratados eficazmente2. Menos claros son los efectos cardiovasculares de los agentes más nuevos, incluyendo los inhibidores Her2 y PI3K, especialmente cuando las terapias se utilizan en combinación. Por lo tanto, existe una creciente necesidad de estrategias de detección preclínica según la vida para las toxicidades cardiovasculares asociadas con las terapias emergentes contra el cáncer antes de los ensayos clínicos en humanos. La falta de disponibilidad de sistemas de cultivo para el tejido cardíaco humano que es funcional y estructuralmente viable para más de 24 h es un factor limitante para las pruebas de cardiotoxicidad confiables. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de desarrollar un sistema confiable para el cultivo del tejido cardíaco humano en condiciones fisiológicas para probar la toxicidad de los medicamentos.
El reciente avance hacia el uso de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (hiPSC-CP) en las pruebas de cardiotoxicidad ha proporcionado una solución parcial para abordar este problema; sin embargo, la naturaleza inmadura de los hiPSC-CP y la pérdida de integridad tisular en comparación con la naturaleza multicelular del tejido cardíaco son las principales limitaciones de esta tecnología4. Un estudio reciente ha superado parcialmente esta limitación a través de la fabricación de tejidos cardíacos a partir de hiPSC-CM en hidrogeles y sometiéndolos a un aumento gradual de la estimulación eléctrica en el tiempo5. Sin embargo, sus propiedades electromecánicas no alcanzaron la madurez vista en el miocardio humano adulto. Por otra parte, el tejido cardíaco es estructuralmente más complicado, siendo compuesto de varios tipos de células incluyendo células endoteliales, neuronas y varios tipos de fibroblastos estromales unidos junto con una mezcla muy específica de proteínas de matriz extracelular6. Esta heterogeneidad de la población celular no cardiomiocito7,8,9 en el corazón adulto de mamífero es un obstáculo importante en el modelado de tejido cardíaco utilizando tipos de células individuales. Estas principales limitaciones ponen de relieve la importancia de desarrollar métodos para permitir el cultivo del tejido cardíaco intacto para estudios óptimos que impliquen condiciones fisiológicas y patológicas del corazón5.
Culturing human heart slices es un modelo prometedor de miocardio humano intacto. Esta tecnología proporciona acceso a un sistema multicelular 3D completo que es similar al tejido cardíaco humano que podría reflejar de manera confiable las condiciones fisiológicas o patológicas del miocardio humano. Sin embargo, su uso se ha visto severamente limitado por el corto período de viabilidad en el cultivo, que no se extiende más allá de las 24 h utilizando los protocolos más robustos reportados hasta 201810,11,12. Esta limitación se debió a múltiples factores, incluyendo el uso de la interfaz aire-líquido para cultivar las rodajas, y el uso de un medio de cultivo simple que no soporta las altas demandas energéticas del tejido cardíaco. Recientemente hemos desarrollado un sistema de cultivo sumergido que es capaz de proporcionar estimulación eléctrica continua y optimizado los componentes de los medios de cultivo para mantener las rebanadas de tejido cardíaco viables hasta 6 días13. Este sistema de cultivo tiene el potencial de convertirse en un potente modelo predictivo humano in situ para pruebas de cardiotoxicidad aguda para cerrar la brecha entre los resultados de las pruebas preclínicas y clínicas. En el artículo actual, estamos detallando el protocolo para cortar y cultivar las rodajas del corazón usando un corazón de cerdo como ejemplo. El mismo proceso se aplica a los corazones humanos, perros, ovinos o gatos. Con este protocolo, esperamos difundir la tecnología a otros laboratorios de la comunidad científica.
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Protocol
Todos los procedimientos de los animales estaban de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Louisville y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal.
1. Preparación para el corte (un día antes del corte)
- Preparación del microtome vibratorio
- Coloque la hoja de cerámica en su soporte siguiendo estos pasos: después de desenvolver cuidadosamente la hoja, coloque el borde afilado primero en la ranura de la herramienta de la hoja. A continuación, coloque la hoja en el soporte aflojando los dos tornillos de los brazos del soporte y deslice la hoja debajo de cada arandela y empújela firmemente contra los topes traseros. Apriete los tornillos para fijar la cuchilla.
NOTA: Los tornillos no deben apretarse demasiado. - Calibre la cuchilla utilizando el protocolo de calibración y las herramientas de acuerdo con el protocolo del fabricante.
NOTA: En resumen, con el fin de facilitar la alineación de la hoja con el eje de recorrido y minimizar las desviaciones del eje Z, el microtome vibratorio utiliza un dispositivo de calibración desmontable. Cuando el dispositivo de calibración está conectado al instrumento, su presencia se detectará automáticamente, y el microtomo vibratorio tomará el control de ajustar los ajustes de amplitud y frecuencia de la hoja a una magnitud que permita mejor el ajuste del error de alineación de la hoja.- Pulse el botón Cortar para iniciar el proceso de alineación que moverá automáticamente la hoja de modo que el filo de corte esté en una posición óptima en relación con el dispositivo de calibración para una mejor evaluación de la alineación. Siga las instrucciones en pantalla para realizar ajustes en la cuchilla utilizando el destornillador proporcionado para asegurarse de que la alineación En Z está dentro de 1 m.
- Autoclave el baño interior y todas las partes metálicas del microtome vibratorio.
- Coloque la hoja de cerámica en su soporte siguiendo estos pasos: después de desenvolver cuidadosamente la hoja, coloque el borde afilado primero en la ranura de la herramienta de la hoja. A continuación, coloque la hoja en el soporte aflojando los dos tornillos de los brazos del soporte y deslice la hoja debajo de cada arandela y empújela firmemente contra los topes traseros. Apriete los tornillos para fijar la cuchilla.
- Autoclave de las grandes bandejas de metal (para recoger las rodajas y remojar las cubiertas de la placa de estimulación eléctrica), cualquier recipiente de vidrio, cuchillas rectangulares regulares, fórceps, tijeras, correa de distribución de impresora (cortarlas en trozos de 6 mm de ancho), arandelas metálicas y 5 L de agua destilada doble (ddH2O).
- Esterilice un frasco de 1 L, un frasco de 500 ml y una bandeja de plástico para el corazón in situ y perfusión in vitro con la solución cardiopléjica.
- Prepare 2 L de la solución de Tyrode de corte en un vaso de precipitados de 2 L.
- Para 1 L de la solución de Tyrode de corte, mezclar 3 g/L 2,3-butanediona monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucosa (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml de solución de 1 M), 1,8 mM de CaCl2 (1,8 ml de solución de 1 M), hasta 1 L de ddH2O. Ajuste el pH a 7.40 usando NaOH. A continuación, filtre la solución utilizando un sistema de filtro/almacenamiento de vacío de 1.000 ml, 0,22 m, y guárdela a 4 oC durante la noche.
- Preparar 4 L de la solución cardiopléjica.
- Para 1 L de la solución cardiopléjica, mezclar 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM de CaCl2 (1,2 ml de solución de 1 M), 16 mM de KCl (1,19 g), 16 mM mgcl2 (3,25 g), 10 mM de NaHCO3 (0,84 g), 1 U/ml de heparina, hasta 1 L de ddH2O. Ajuste el pH a 7.40 utilizando NaOH. A continuación, filtre la solución utilizando un sistema de filtro/almacenamiento de vacío de 1.000 ml, 0,22 m, y guárdela a 4 oC durante la noche.
NOTA: Añadir 1.000 U/L de heparina en solución de cardioplejia el día del corte (ver paso 2.1).
- Para 1 L de la solución cardiopléjica, mezclar 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM de CaCl2 (1,2 ml de solución de 1 M), 16 mM de KCl (1,19 g), 16 mM mgcl2 (3,25 g), 10 mM de NaHCO3 (0,84 g), 1 U/ml de heparina, hasta 1 L de ddH2O. Ajuste el pH a 7.40 utilizando NaOH. A continuación, filtre la solución utilizando un sistema de filtro/almacenamiento de vacío de 1.000 ml, 0,22 m, y guárdela a 4 oC durante la noche.
- Recién preparado 500 ml de medio de cultivo en el frasco original en un gabinete de bioseguridad: medio de mezcla 199, 1 suplemento de insulina-transferrina-selenio (ITS), 10% suero bovino fetal (FBS), factor de crecimiento endotelial vascular de 5 ng/ml (VEGF), 10 ng/ml FGF-básico, y 2 x antibiótico-antimético. El filtro esteriliza a través del sistema de filtro/almacenamiento de vacío de 0,22 m y guárdalo a 4 oC durante la noche.
NOTA: No ajuste el pH, añada VEGF y FGF recién antes de su uso. - Preparar placas de gel de agar 4%.
- Añadir 200 ml de ddH2O esterilizado en un matraz esterilizado de 500 ml. Pesar 8 g de agarosa, y verter suavemente en el matraz. Hervir durante 2 minutos en un microondas, luego enfriar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Vierta 25 ml en cada plato Petri de 100 mm en un armario de bioseguridad (prepare 6 platos) y espere 1 h para solidificar. Luego, selle las placas con película de parafina, envuelva con una envoltura limpia y guárdelas a 4oC.
- Preparar 4 L de 70% de etanol diluyendo el etanol absoluto a prueba de 200 en autoclave ddH2O.
- Preparar 2 x antibiótico-antimicótico en ddH2O esterilizado: mezclar 980 ml de ddH2O esterilizado con 20 ml de antibiótico-antimicótico bajo el gabinete de bioseguridad.
2. Perfusión del corazón de cerdo
- Añadir 1 ml de 1.000 U/ml de heparina a cada 1 L de solución cardiopléjica. Mantenga la solución en hielo.
NOTA: Se necesitan al menos 3 L para la perfusión y preservación del corazón durante la transferencia a la sala de cultivo de tejidos. - Lleve los siguientes artículos a la sala de cirugía de cerdo: un cubo de hielo grande lleno de hielo, una bandeja de metal esterilizada (mantener en cubo de hielo para la perfusión del corazón), un frasco esterilizado de 500 ml, un frasco de 1 L (para transferir el corazón en solución de cardioplejia de nuevo a la sala de cultivo de tejidos , sobre hielo), y una bandeja de plástico esterilizada llena de hielo (para mantener la solución cardiopléjica sobre hielo).
- Prepare un sistema de perfusión cardíaca in situ que contenga un tapón de 3 vías, una jeringa de 60 ml, un catéter de aguja de mariposa de 18 G y un tubo de extensión al depósito de la solución cardiopléjica.
- Anestetizar el cerdo macho de Yorkshire (2 x 3 meses de edad, 20 x 25 kg) primero con una inyección intramuscular de un cóctel de ketamina (20 mg/kg)/xilazina (2 mg/kg). Confirme la anestesia adecuada por la pérdida de tensión de la mandíbula. A continuación, transferir el cerdo a la sala de cirugía, intubar y ventilar mecánicamente los pulmones como se describió anteriormente14.
- Mantener la anestesia con (1,5-2%) Isoflurano.
- Coloque el animal en la posición lateral derecha y aseque el pelaje de la zona del pecho. Limpie la piel con exfoliación con alcohol y, a continuación, esterilice el sitio quirúrgico con una solución de povidona-yodo al 10% (p/v).
- Abra el pecho por la incisión de toracotomía izquierda usando un bisturí en el espaciointercostal 4, y use un retractor torácico entre las costillas para mantener el pecho abierto y exponer el corazón.
NOTA: Utilice todos los instrumentos esterilizados para este procedimiento. - Inserte el catéter de aguja de mariposa en la aurícula izquierda y fije la aguja con un cierre de cuerda de la bolsa. Después de la inyección intravenosa de una dosis de bolo de heparina (100 U/kg), comience a perfumar el corazón in situ con 500 ml de solución cardiopléjica helada (para disminuir la frecuencia cardíaca) a través del catéter auricular izquierdo.
- Anestesia profundamente al cerdo con 5% de isoflurano. Exbote rápidamente el corazón del pecho con tijeras quirúrgicas. Cannute la aorta con una cánula aórtica y percanda el corazón in vitro con otra 1 L de solución cardiopléjica helada (100 ml/min) para eliminar la sangre de la vasculatura.
- Después de la perfusión cardíaca, mantenga el corazón en un frasco de 1 L lleno de solución de cardioplejia helada y mantenga el hielo durante la transferencia a la sala de cultivo de tejidos.
3. Corte de tejido cardíaco de cerdo
- Configure el baño de tejido en el vibratome, agregue hielo a la chaqueta de enfriamiento del baño de tejido y, a continuación, agregue la solución de Tyrode al baño de tejido. Configure un frasco de plástico de 1 L para recoger la eliminación de hielo derretido de la chaqueta de enfriamiento del baño de tejido.
- Debajo del armario de bioseguridad, transfiera el corazón del cerdo a una bandeja que contenga 1 L de solución cardiopléjica fría fresca.
- Diseccionar el corazón para aislar el ventrículo izquierdo usando bisturíes estériles retráctiles. Luego, corta el ventrículo izquierdo en bloques de 1 x 2 cm3 cada uno usando cuchillas rectangulares de afeitar. Utilice una pieza para cortar y mantenga las piezas restantes en un tubo de 50 ml en solución fría de Tyrode sobre hielo para cortar más tarde, si es necesario.
NOTA: Masajear el tejido antes de cortar con las manos, especialmente si este es el segundo bloque. El masaje ayuda a restaurar la configuración correcta de la fibra muscular y previene cualquier rigidez dentro del bloqueo cardíaco. - Añadir 1 x 2 gotas de pegamento tisular(Tabla de Materiales) al soporte de la muestra de metal y pegar un pedazo del bloque de agar 4% con una superficie de aproximadamente 1 cm2.
- Agregue 1 x 2 gotas de pegamento tisular en el agar.
- Pegue el bloqueo del corazón al agar con el lado del epicardio cardíaco mirando hacia abajo en el pegamento del tejido y asegúrese de que sea lo más plano posible. A continuación, transfiera el soporte de tejido con el bloqueo cardíaco a su posición en el baño de corte del vibratome.
- Fije el tubo de oxígeno al baño de corte y la bandeja de metal llena con la solución de Tyrode para recoger las rodajas (baño de Tyrode oxigenado). A continuación, agregue los coladores de celdas de 40 m en la bandeja de metal para recoger las rodajas después del corte.
- Ajuste de la posición de corte
- Usando el software de funcionamiento vibratome y el tablero de control, ajuste la altura de la hoja/muestra. Seleccione el botón de altura y siga las instrucciones en pantalla para ajustar la altura. Idealmente, tener la hoja cerca de la parte superior del tejido, pero por debajo de los músculos papilares y asegúrese de que hay líquido que cubre el tejido y la hoja antes de cortar.
- Ajuste dónde comenzar a cortar el tejido seleccionando el botón de avance. Presione el botón de corte y aumente la velocidad usando la perilla para mover la hoja hacia el borde del tejido. A continuación, pulse slice de nuevo para detener y pulse el botón de avance para desactivar el proceso.
- Ajustar los parámetros de corte: velocidad de avance de 0,03 mm/s, frecuencia de vibración a 80 Hz y amplitud de vibración horizontal a 2 mm. A continuación, inicie el corte seleccionando el botón de corte.
- Dejar que el vibratome se rebane hasta que llegue al extremo del tejido, pero antes de que llegue al extremo posterior del soporte de la muestra. En este punto, presione slice de nuevo para detenerlo. Pulse el botón Retorno para volver a la posición inicial.
- Seleccione la repetición automática (haciendo clic dos veces) que permitirá que el microtome vibratorio repita automáticamente el proceso de corte hasta 99 veces.
- Recolección de rebanadas
- Espere hasta que las rebanadas estén completas y parezcan buenas (después de pasar las capas musculares papilares), y luego comience a recoger las rebanadas.
- Recoge las rodajas con una pipeta Pasteur de plástico llena de solución fría de Tyrode para agarrar suavemente el tejido del baño. Si es necesario, utilice fórceps y tijeras de resorte para disociar la rebanada del bloqueo cardíaco si el tejido todavía está unido.
- Transfiera la rebanada a un colador de células en el baño de Tyrode oxigenado (ver paso 3.7) y use el líquido en la pipeta de plástico Pasteur para hacer que el tejido se acueste en uno de los coladores celulares, luego agregue una lavadora de metal en la parte superior para sujetar el tejido hacia abajo.
NOTA: Las rodajas deben ser incubadas al menos durante 1 h en la solución del Tyrode antes del procesamiento (esto es para que el BDM relaje el tejido).
4. Culturing Heart Slices
-
Preparar las rebanadas para la cultura
- Recorte la rebanada de los bordes para evitar bordes desiguales. A continuación, colarlo desde ambos extremos a la correa de distribución de la impresora de poliuretano esterilizado de 6 mm de ancho con cables metálicos incrustados con pegamento de tejido.
- Transfiera las rodajas de corazón apoyadas a 6 platos de pozo que contengan 6 ml de medio de cultivo en cada pocal.
- Coloque la cubierta de la placa de estimulación(Tabla de materiales)en la parte superior de la placa de 6 pocillos y conecte la cubierta al estimulador eléctrico de cultivo celular (Tabla de materiales). Ajuste el estimulador para estimular eléctricamente las rodajas del corazón a 10 V, 1,2 Hz continuamente todo el tiempo.
NOTA: Después de conectar la estimulación, las rodajas del corazón comenzarán a latir, y este movimiento será visualmente obvio. - Transfiera las placas a una incubadora y manténgalas a 37oC con aire humidificado y 5% CO2.
- Cambiar el medio de cultivo 3 veces al día y añadir 6 ml de medio de cultivo por pozo durante cada cambio de medio.
NOTA: El medio de cultivo se oxigena durante 5 minutos antes de cada cambio de medio. El medio debe cambiarse al menos 1 veces al día; esto está bien los fines de semana si es necesario. Dos días de solo 1 cambio de medios por día es el máximo que se prueba. -
Cambie la cubierta de la placa de estimulación todos los días para evitar la liberación de partículas de grafito tóxicas en el medio de cultivo (generalmente durante el cambio de medios del mediodía).
- Retire la cubierta de la placa de estimulación de la placa de cultivo e inserte el tapón de espuma blanca donde la cubierta se conecta al cable para el estimulador eléctrico del cultivo celular, para evitar daños por agua en el circuito eléctrico.
- Coloque la cubierta de la placa en un baño de agua autoclave con 2 x antibiótico-antimicótico. Guárdelo en este baño (es decir, un baño de ingle) durante la noche.
- Al día siguiente, mueva la cubierta de la placa a un baño de etanol del 70% durante 5 x 15 minutos para descontaminar. Agitar tanto líquido del dispositivo antes de cambiar de baño.
- A continuación, transfiera la cubierta de la placa al tercer y último baño (es decir, un baño limpio), que consiste en agua autoclave y 2x antibacteriano-antimicótico, para enjuagar cualquier rastro de etanol restante.
- Después de enjuiciar la cubierta de la placa en el baño limpio, utilice una toallita limpia sin pelusas (pulverizada con etanol) para secar cualquier agua residual en las piezas de plástico, luego retire la pieza de espuma blanca y coloque cuidadosamente la cubierta de la placa de nuevo en la placa de cultivo.
NOTA: No toque los electrodos de grafito negro que van en el pozo, ya que el dispositivo ya no será estéril. - Usando fórceps estériles, asegúrese de que el tejido está en el centro del pozo para que la cubierta de la placa no toque el tejido. Asegúrese de que el lado curvo de la cubierta de la placa coincida con el lado en ángulo de la placa y que las esquinas cuadradas se alineen.
NOTA: Para minimizar la contaminación de las cubiertas de las placas de estimulación, manténgalas limpias y vacías 6 placas de pozos después de terminar el experimento.
- Realizar un ensayo MTT, mediciones de calcio y evaluaciones de la función contráctil en rodajas de corazón de cerdo fresco (día 0), y después de 6 días en cultivo según Ou et al.13.
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Representative Results
Utilizando un estimulador eléctrico de cultivo celular disponible comercialmente que puede acomodar ocho 6 placas de pozos a la vez, emulamos el entorno cardíaco adulto induciendo la estimulación eléctrica a la frecuencia fisiológica (1,2 Hz), y examinamos los componentes medios fundamentales para prolongar la duración de las rodajas funcionales de corazón de cerdo en el cultivo13. Dado que los corazones de cerdo y humanos son similares en tamaño y anatomía15,desarrollamos un sistema de cultivo de rebanadas de corazón biomimético utilizando corazones de cerdo y posteriormente lo validamos en rebanadas de corazón humano. Aquí, detallamos el protocolo para las rodajas de corazón de cerdo que es el mismo procedimiento para el corte y el cultivo del corazón humano. La nueva configuración de cultivo biomimético descrita aquí, mantuvo la viabilidad de las rodajas de corazón de cerdo durante 6 días según lo evaluado por el ensayo MTT(Figura 1A). Confirmamos la viabilidad funcional de estas rodajas durante 6 días evaluando su homeostasis de calcio y fuerza contráctela. En los primeros 6 días, no hay transitorios espontáneos de calcio en los cardiomiocitos, y los cardiomiocitos respondieron a la estimulación eléctrica externa, así como a la estimulación adrenérica similar a las rebanadas de corazón fresco(Figura 1B). Además, la fuerza contráctela y las respuestas al isoproterenol se mantienen en rodajas de corazón cultivadas durante un máximo de 6 días, similares a las de las rebanadas de corazón fresco(Figura 1C,D).
Figura 1: Validación de la viabilidad y funcionalidad del cultivo de rebanadas de corazón de cerdo. (A) Cuantificación de la viabilidad de las rebanadas de corazón a lo largo del tiempo utilizando el ensayo MTT en un sistema de cultivo estimulado o no estimulado en medio optimizado (n 5 corazones de cerdo cada uno en triplicado, SEM se representa como barras de error; se llevó a cabo una prueba de ANOVA bidireccional para comparar entre grupos, *p < 0,05). (B) Rastro representativo de la señal de calcio de una rebanada de corazón fresco (día 0) y después de 6 días en cultivo (día 6) con y sin 1 M de estimulación del isoproterenol (Iso). Los transitorios se registraron después de cargar las rodajas del corazón con el tinte de calcio Fluo-4 y usar estimulación eléctrica de 1 Hz/20 V en el momento de la grabación. La cuantificación de la amplitud de la señal de calcio con y sin estimulación con isoproterenol muestra un patrón similar de transitorios de calcio en el día 0 y el día 6 en cultivo (n 4 corazones de cerdo, 10 a 15 células analizadas en cada una, SEM se representa como barras de error; se llevó a cabo la prueba anova bidireccional para comparar entre grupos, *p < 0.05 comparando la línea de base con la estimulación iso en el mismo punto de tiempo, el valor pD0 vs D6 a 0,95, y el valor pD0 Iso vs D6 Iso a 0,93). (C) Configuración de la evaluación de la fuerza contratada (panel izquierdo); la rebanada del corazón (HS) se cuelga entre un transductor de fuerza (FT) y un poste estable (P) entre dos electrodos eléctricos (EE) para la estimulación eléctrica. Tras la estimulación, los contratos de sectores y las contracciones se registran utilizando el software designado (panel derecho). (D) El gráfico de barras muestra la cuantificación de la fuerza contráctil en presencia o ausencia de isoproterenol (Iso) generado por rodajas de corazón de cerdo fresco (día 0) y después de 6 días en cultivo biomimético (n 4 corazones de cerdo cada uno en triplicado, SEM se representa como barras de error; se llevó a cabo la prueba de ANOVA bidireccional para comparar entre grupos, *p < 0.05 comparando la línea de base con la estimulación Iso al mismo punto de tiempo, fuerza de contracción: valor pD0 vs D6 a 0,96, valor pD0 Iso vs D6 Iso a 0,81; tiempo a 50% de relajación: valor p-valor: p-valor de relajación: valor p D0 vs D6 a 0,47, valor pD0 Iso vs D6 Iso a 0,43). Esta cifra ha sido modificada de Ou et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Condición | 16 | 13 |
| Especies | Humano | Cerdo y humano |
| Enfermedad | Corazones fallidos | Corazones sanos normales |
| Preservación | Tejido preservado | Tejido fresco |
| Espesor de la rebanada | 300 m | 300 m |
| Oxigenación media | No | Oxigenación intermitante |
| Medio de cultura | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| Agitación | Sí | No |
| Tasa de ritmo | 0,2 Hz | 1.2 Hz |
| Duración de la cultura | 4 meses con compromiso | 6 días sin compromiso |
| Temperatura de corte | 37 | 37 |
| Carga mecánica | carga auxiliar | sin carga |
| Puntos de tiempo probados sin cambios en la expresión génica en comparación con la rebanada de corazón fresco | N/A | 2 y 6 días |
| Primer punto de tiempo probado para mostrar el cambio en la expresión génica | Día 8 | Día 10 |
Cuadro 1: Comparación entre las condiciones de corte y cultivo utilizadas en Fischer et al.16 y Ou et al.13.
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Discussion
Aquí describimos el protocolo de vídeo detallado para nuestro método publicado recientemente para el método de rendimiento medio simplificado (procesos de hasta 48 rebanadas/dispositivo) que permite el cultivo de rodajas de corazón de cerdo durante un período lo suficientemente largo como para probar la cardiotoxicidad aguda13. Las condiciones propuestas imitan el entorno del corazón, incluyendo la frecuencia de estimulación eléctrica, la disponibilidad de nutrientes y la oxigenación intermitente. Atribuimos la viabilidad prolongada de las rodajas de corazón en nuestro cultivo estimulado biomimético a nuestro enfoque en recrear las condiciones fisiológicas experimentadas por el corazón intacto. Este concepto está respaldado por nuestros datos que muestran que la estimulación eléctrica por sí sola, sin proporcionar nutrientes esenciales, no es suficiente para mantener la viabilidad de las rebanadas cardíacas13. Por lo tanto, los nuevos componentes del medio de cultivo son el principal impulsor para prolongar la viabilidad y la funcionalidad de la división cardíaca en la cultura. Encontramos que es esencial incluir FBS en el medio para mantener la viabilidad, que es probablemente debido a la necesidad de una variedad de ácidos grasos, oligoelementos, enzimas, proteínas, macromoléculas, componentes químicos, y hormonas, que generalmente están presentes en el suero y entregados al tejido cardíaco in vivo17. Además, encontramos que la adición de FGF y VEGF al medio de cultivo son necesarios para mejorar la viabilidad del tejido. FGF y VEGF son factores angiogénicos conocidos que son esenciales para el mantenimiento de células endoteliales cultivadas18. Por lo tanto, es probable que FGF y VEGF son necesarios para mantener las células endoteliales y los tejidos conectivos en el cultivo para apoyar la viabilidad del tejido. Nuestro trabajo es el primero en modificar el medio de cultivo simplificado previamente reportado para el cultivo de rebanadas de corazón, y abre la posibilidad de una mayor optimización de los componentes de medios en estudios posteriores.
De manera oportuna con nuestro nuevo método, hubo otros tres estudios que han demostrado la importancia de la estimulación electromecánica continua en el mantenimiento de las rodajas en cultivo en los sistemas bioingenieros16,,19,20. Sin embargo, estos estudios utilizaron el medio basal M199/ITS, que no es suficiente para mantener las necesidades metabólicas de las rodajas de corazón. Esto llevó a varios compromisos en la contractilidad de la rebanada y la homeostasis de calcio temprano durante el cultivo16,,19,20. 19 desarrollaron un altamente sofisticado sano chips bioingenieros, que pueden mantener las propiedades electrofisiológicas de las rodajas de corazón durante 4 días, pero no se proporcionó ninguna evaluación de la función contráctile. 20 han bioingeniería de un sistema de cultivo de bajo rendimiento (procesos de hasta 4 rebanadas/dispositivo) para demostrar la importancia de la longitud del sarcomere diastólico para el mantenimiento de las propiedades musculares cardíacas durante 24 horas. Por último, Fischer16 han demostrado que las rebanadas de corazón humano que fallan se pueden mantener in vitro durante un máximo de 4 meses cuando se cultivan bajo estimulación de 0,2 Hz, carga auxotónica y agitación de medios en un dispositivo de bioingeniería. Sin embargo, estas condiciones indujeron una variedad de cambios en las rebanadas del corazón, como se refleja en sus datos de RNAseq, que mostraron más de 10 veces la regulación de la expresión génica cardíaca tan pronto como el primer punto de evaluación de tiempo (día 8)16. Sin embargo, en nuestro sistema de cultivo optimizado, sólo 2 y 5 transcripciones se expresaron significativamente diferencialmente después de 2 y 6 días en cultivo en comparación con el tejido fresco del corazón, respectivamente. Sin embargo, después de 10 días en la cultura, hubo cambios significativos en la expresión de más de 500 transcripciones. Los genes regulados después de 10 días en cultivo estaban relacionados principalmente con el músculo cardíaco, mientras que los genes regulados están relacionados con fibroblastos, matriz extracelular e inflamación13. El Cuadro 1 incluye una comparación completa de los protocolos de corte y cultivo entre Fischer et al.16 y Ou et al.13. Por lo tanto, nuestro sistema de cultivo estimulado biomimético emula las condiciones controlables experimentadas por el corazón in situ y, por lo tanto, debe proporcionar una lectura fiable de los resultados funcionales y estructurales del tratamiento farmacológico con respecto a la cardiotoxicidad aguda o eficacia en comparación con los sistemas de cultivo comprometidos.
Una de las principales limitaciones de este sistema de cultivo es que aunque nuestro sistema de cultivo puede emular varias condiciones fisiológicas, no puede imitar cambios en la carga mecánica y el estrés por cizallamiento durante el ciclo contráctilo cardíaco. Una mayor optimización de los factores fisiológicos y metabólicos podría ayudar a prolongar la viabilidad y la función de las rebanadas cardíacas. Además, notamos una adaptación temprana que conduce a la disminución de la fosforilación oxidativa que podría instigar el deterioro de la viabilidad de la rebanada del corazón13. Desafortunadamente, hasta ahora, no hemos podido identificar un método óptimo para mantener la fosforilación oxidativa. Es probable que mejorar el metabolismo de los ácidos grasos en las rodajas de corazón no es tan simple como añadir ácidos grasos al medio de crecimiento, y requerirá una mayor optimización, que podría abordarse en futuros estudios. Además, una debilidad general de este enfoque es la falta de medición de los potenciales de acción en cardiomiocitos individuales dentro de la rebanada del corazón, que es esencial para demostrar la interrupción en el electrocardiograma y la arritmia ventricular. Por lo tanto, es necesario optimizar los protocolos para aislar cardiomiocitos individuales de las rodajas del corazón después del tratamiento con cardiotoxinas que inducen la interrupción en el electrocardiograma y evaluar su efecto sobre el potencial de acción en los cardiomiocitos aislados.
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Disclosures
TMAM tiene participación en Tenaya Therapeutics. Los otros autores no informan de conflictos.
Acknowledgments
TMAM es apoyado por la concesión DE NIH P30GM127607 y la concesión 16SDG29950012 de la American Heart Association. RB es compatible con P01HL78825 y UM1HL113530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
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