Summary
本研究の目的は、心筋細胞を成体から再現的に単離し、DNAの含有量と核形成を測定する方法を開発することです。
Abstract
成人哺乳類の心臓は、心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞を含む様々な細胞タイプで構成される。組織学的セクション上の心筋細胞の核を確実に同定することは困難であるため、多くのグループは、免疫染色を行うために固定前に生存可能な心筋細胞を単離することに依存しています。しかし、これらの生きた心筋細胞分離技術は、最大の最適化にもかかわらずサンプルからサンプルまでの固有の変動を伴い、サンプルの収量、生存率、品質を最大化するための最適化を必要とします。ここでは、個々の心筋細胞の生体内形態を維持しながら最大収量をもたらす心臓の酵素消化前の固定を含む再現性プロトコルを報告する。さらに、個々の心筋細胞の核およびDNA含有量を決定する自動分析プラットフォームを開発しました。胸腔を露出させた後、心臓はPBSで60mM KClで灌流することによって拡張期に逮捕された。次に、心臓を4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に固定し、次いで60mg/mLコラゲナーゼ溶液で消化した。消化後、細胞をトリチュレーションによって単発化し、心筋細胞画分を差動遠心によって濃縮した。孤立した心筋細胞は、得られた集団の純度を評価するためにトロポニンTおよびαアクチニンのために染色された。さらに、DAPI染色後の心筋細胞核形成とプロイディ状態を決定する画像解析プラットフォームを開発しました。画像ベースの策略評価により、一貫した再現性のある結果が得られました。このように、このプロトコルを用いて、個々の心筋細胞の天然型を保存し、最大収量を達成しながら免疫細胞化学およびDNA含有量分析を可能にすることができる。
Introduction
心臓病は、何十年もの間、西側諸国の大多数で主要な死因となっています1,,2.心血管疾患の治療における多くの改善は生存率を改善しているが、現在、失われた心筋細胞に代わる治療法はない。したがって、心筋細胞機能、増殖、アポトーシスおよび肥大に関する研究は、科学界の主要な焦点であり続けている。成人哺乳類の心臓は再生能力が非常に限られているため、心筋細胞の再生率は年間1%未満と推定され、心筋細胞増殖事象を確実に同定することが極めて重要である3,4。4増殖事象を測定するほとんどの戦略は、以前または現在の増殖を評価するために組み込まれたDNAヌクレオチド類似体の染色、または活性増殖の核マーカーの染色のいずれかに依存する。増殖性心筋細胞の総数が,3,6と非常に少ないため、心筋細胞増殖事象を確実に同定することが特に重要3である。例えば、1%の内因性心筋細胞の1%の更新率に基づいて、1つは、成人マウス心臓77、88において任意の時点で25〜50の心筋細胞が増殖することを見つけることが期待できる。心筋細胞核の同定に不正確な場合は、偽陽性の結果をもたらす可能性があります。したがって、組織学的セクション9から困難で信頼性が低いことが証明されている心筋細胞核を確実に同定することが重要である。心筋細胞の同定は、αアクチニンなどのマーカーを用いても他の細胞型から心筋細胞を区別することは難しいかもしれないので、組織切片からよりもはるかに正確であるが、PCM1は組織学的セクション10における心筋細胞核の信頼できるマーカーであるかもしれない。
現在のプロトコルは、固定前に生きた心筋細胞を単離することに依存しており、これは心筋細胞の少なくとも30%の死を引き起こすことが知られており、心筋細胞11の特定の集団の不注意な選択につながる可能性がある。さらに、これらのプロトコルは、再現性のある結果を提供するために最適化することが困難で有名です。最適化された分離技術でさえ、通常、生きている、様々な収量を持つ棒状の心筋細胞を65%以下に生み出すことができる12.
これらの問題を克服するために、研究者が固定心筋細胞を分離できるプロトコルを開発しました。試料は分離前に固定されるため、収率は最大化され、生体内形態は十分に保存されます。さらに、このプロトコルを使用すると、臨床サンプルから心筋細胞を分離することが可能であり、これは通常、調達直後に固定される。さらに、新たに生成された心筋細胞を同定するためには、個々の心筋細胞の核形成およびプロイド状態を測定することが重要であり、二量心筋細胞のみが典型的には新たに形成されると仮定される。フローサイトメトリーは多核化と多重性を区別できず、比較的時間とリソースを消費するプロトコルです。画像内の核の手動のアウトラインと測定は、非常に低いスループットであり、人間の偏見を起こしやすいです。固定された、分離されたDAPI染色型心筋細胞の画像の自動定量化は、これらの問題の両方を解決します。核生成およびプロイド分布のイメージングベースの定量は、基本的な装置を用いた最低時間と試薬で得ることができます。
Protocol
すべての動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインに準拠し、ミネソタ大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. ソリューションと手術器具の準備
- 分離する前に、70%エタノール溶液を使用して外科用器具を殺菌する。
- 500 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 溶液に KCl の 2.24 g を加え、60 mM の最終濃度を得る。KCl-PBS溶液を室温で保存してください。マウスあたり3 mLのKCl-PBS溶液を使用してください。
- 32%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液をPBSで希釈し、4%PFAの最終濃度を得た。1個のマウスにつきPBSで4%PFAの10mLを準備します。希釈PFA溶液は、ガラス容器に2〜3週間4°Cで保存することができます。
注:調製された4%PFA溶液は、より長い期間-20°Cで保存することができます。 - 60mgのコラゲターゼを加えて1マウス当たり1mLのコラゲターゼ溶液を調製し、PBS1mLあたり2種類を加えます。
2. 心臓の灌流と固定
- 酸素流量1 L/minの2-5%イオブルランを使用して動物を麻酔します。動きの欠如と呼吸数の低下を確認して麻酔を確認します。
注:安楽死の前にヘパリン(100-500 U /kg)を注入すると、血栓を防ぐことによって細胞の質と収量を増加させ、それによって固定性で心臓のより効率的な灌流を可能にする。 - 承認された方法論に従って動物を安楽死させる。
注:動物安楽死に関する米国獣医医師会のガイドラインに従い、安楽死に関する地元のIACUC承認を得ました。 - 安楽死させた動物を上肢に置き、伸びた手足をテープで留めます。
- 胸を切り裂いて、鈍い端のはさみを使って心臓を露出させろ。下降大大静脈と劣った騎兵静脈をカットします。
- 23Gバタフライニードル(新生児用26G)を用いた注入セットに付着した蠕動ポンプを用いて、3mL/minの流量で左心室を通して3mLのKCl-PBS溶液を注入して心臓を浸透させる。中隔を貫通しないようにしてください。
注: または、注射器に取り付けられた針を使用して溶液を注入します。 - 1 mL/minの速度で蠕動ポンプを使用して10分間、4%PFA溶液の10 mLを注入することにより心臓を浸透させます。
- はさみを使って心臓全体を取り除きます。心臓を除去した後、切開することによって心臓の特定の領域を単離することができる。心臓を入れ、または4%PFA溶液の1 mLを含む1.5 mLマイクロ遠心分離管にそれのセグメントを入れる。20~30rpmのロッキング速度で、1時間の間に、常温でロッカーに心臓をインキュベートします。
3. 固定心筋細胞の分離
- PBS溶液を含むペトリ皿に心臓を入れます。心室に残っているPFAを取り除くために心臓を絞り、PBSで洗います。
- コラゲナーゼ溶液(60mg/mL)を含む新しい1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに固定心臓を入れます。一晩インキュベーションのために37 °Cでロッカー(20-30 rpm)にチューブを置きます。
注:インキュベーション時間を1週間まで延長し、2日ごとにコラゲラーゼ溶液を補充して、心臓が線維性であると予想される場合の収量の変動を減らし、細胞外コラーゲンを消化するためにコラゲラーゼ消化の時間が長くなる可能性があります。 - コラゲナーゼ溶液と心臓を35mmのペトリ皿に入れます。鉗子またははさみを使用して、心臓を1mmに解体します。
- 転写ピペットを使用して、解離した組織をさらに2分間トリチュレートします。ティッシュ粒子がまだ皿の中に残っている場合は、狭い開口部を持つ移管ピペットを使用し、トリアーレーションを継続します。組織の大部分が分解されるまで続けます。
注:トリアーレーションを超えると、個々の心筋細胞が壊れます。顕微鏡で定期的にチェックして、トリチュレートを超えないようにしてください。 - 200~600 μm のナイロンメッシュを15 mL遠心管の開口部に配置します。
注意:肥大した心筋細胞の場合、200 μmではなく400 μmのナイロンメッシュを使用することをお勧めします。 - 解き分け細胞を含むペトリ皿に5mLのPBSを加え、組織粒子を含むナイロンメッシュを通して溶液をろ過する。追加の4 mL PBSを渡すことによってナイロンメッシュを洗浄します。
- 10〜100 x g でフィルター液を1分間遠心する。
注:100 x g 遠心分離は100%純粋な心筋細胞集団を生み出さないし、いくつかの非心筋細胞細胞が含まれる可能性が高い。 - 心臓細胞の非心筋細胞を染色/評価したい場合を除き、上清を捨てます。染色前に10mLPBSでペレットを再懸濁します。
4. 心筋細胞の染色
- 100 x g で 1 分間の遠心分離により細胞を収集し、5 mL の透過液 (例えば、PBS で 0.5% トリトン X-100) を加えます。ロッカーの室温で20分間インキュベートします。
注:ステップ4.1、4.2および4.4のために1.5 mLのマイクロ遠心分離管と比較して細胞のペレットを邪魔することなく上清を除去する容易であるように15 mL遠心管を使用する。 - 100 x g で1分間遠心分離して細胞を回収し、5 mLのブロッキングバッファー(例えば、PBSで3%のウシ血清アルブミン[BSA])を加え、ロッカー上の室温で30分間インキュベートします。
- 100 x g で 1 分間の遠心分離により細胞を回収し、適切な希釈比で 1 mL の一次抗体溶液 (PBS) を加えます。最適な条件下で1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに溶液を移し、一次抗体溶液中の心筋細胞をインキュベートします(例えば、一晩4°C)。
- 15 mL遠心分離チューブに一次抗体溶液を含む心筋細胞を移管し、PBS 9 mLを加える。ロッカーの室温で10分間心筋細胞をインキュベートします。
- 100 x g で 1 分間遠心分離して細胞を回収し、PBS を 10 mL 加えます。ロッカーの室温で10分間心筋細胞をインキュベートします。この手順をもう一度繰り返します。
- 100 x gで100 x g で遠心分離して細胞を1分間回収し、DAPIを含む二次抗体溶液を添加します。ロッカーの室温で30分間インキュベートし、続いてステップ4.5を2回繰り返して心筋細胞を洗浄する。
- 細胞をカバーリップまたは顕微鏡対応プレートに置き、イメージングを進めます。
注:原稿に含まれる画像は、10倍と40倍の目的で撮影されました。使用されたレーザーは、DAPI用405nm、アルファアクチン用561nm、Edu用640nmであった。
5. セットアップイメージングソフトウェア
注: 補足ファイル1-ソフトウェアスクリーンショット.pdfを使用して、これらの手順に従ってください。
- フィジー版の ImageJ のディストリビューションをダウンロードします。
- フィジーを開きます。 [ヘルプ] > [更新]をクリックします。> 更新サイトの管理「IJPBプラグイン」と「バイオメッドグループ」のアップデートサイトをチェックして、依存関係プラグインの楕円スプリットとモルフォリビをダウンロードしてください。
- [ 閉じる] をクリックします。フィジーは、依存関係のダウンロードを開始する必要があります。完了したらフィジーを再起動します。
- Rstudio をダウンロードして開きます。
- install.packages(c) ("ggplot2", "自動スレッショナー","dplyr","purrr", "jsonlite", "光沢のある")を R コンソールのコマンドラインにコピーし、Enterキーを押します。すべての R 依存関係をインストールするプロンプトに応答して「y」と入力します (補足ファイル 1のスクリーンショット 1)。
6. 画像定量
- フィジーを開き、フィジーのステータス バーに "AnalyzeNucleation.py" (補足コード ファイルとして提供) をドラッグします。これにより、スクリプト編集ウィンドウが開きます。左下隅の [ 実行 ] をクリックして開始します ( 補足ファイル 1のスクリーンショット 2 )。
- ダイアログボックスがポップアップします (補足ファイル 1: スクリーンショット 3) 出力データディレクトリの場所を尋ねる.このソフトウェアで使用されるすべての解析データ、数値、およびその他のデータは、このフォルダに保存されます。もう 1 つの大きなダイアログ ボックスがポップアップし、すべての画像解析設定 (補足ファイル 1: スクリーンショット 4) が表示されます。
- 分析するイメージを含むディレクトリの場所を選択します。
- 正規表現を使用して、イメージのファイル名の形式を入力します。イメージファイル名の形式を入力し、正規表現を使用して、ファイル名のどの部分が行、列、チャンネル、および (オプションで) 中かっこ内のサイトに対応するかを示します。中かっこ内にスペースを入れないでください。ファイル名形式の変数部分を中かっこ {} で囲みます。ファイルの保存方法はイメージングソフトウェアによって異なり、この手順ではイメージファイル名から関連情報を取得します。
注: たとえば、書式文字列
r"プレート1-(?P<行>[A-Za-z]+)(?[0-9]+)-(?P<チャンネル>[A-Za-z]+)。tif"
"Plate 1-" で始まるファイル名を表し、その後に行を示す 1 つ以上のアルファベット文字が続き、その後に列を示す 1 つ以上の数字が続き、その後に "-" が続き、その後にチャネルを示す 1 文字以上の文字が続き、その後に ".tif" が続きます。山かっこ内の文字は、"<>" などの変数名で、収集されるときに自動的にデータにコピーされます。変数名の 1 つは "" でなければなりません。 - 核染色が見えるチャンネルの名前と、心筋細胞が見えるチャンネルの名前を示します。これらの名前は、正規表現のファイル名の "
" 変数と一致する部分と 正確 に一致する必要があります。 - コンマ区切りの変数名を使用して、イメージをグループ化する方法を指定します。特定のグループ内のすべての画像が開かれ、1 つのバッチで分析されます。たとえば、画像が各ウェルのセットに分割され、行と列の一意の組み合わせごとにウェルがある場合は、このフィールドに「行、列」と書き込みます。
注: これらのグループ化変数は、書式文字列で使用される変数のサブセットである必要があります。グループ変数として"channel"を使用しない、これは互いに対応するチャンネル画像を分離します。 - 画像を 1 つのウェル イメージにステッチするか、サイトごとに別々にステッチするかを指定します。前者の場合、site はファイル名のフォーマット文字列で示すべきではありません。
- 背景から核を分離するために使用するしきい値方法を選択します。フィジーの標準的なしきい値方式はすべて利用可能です。さまざまなしきい値方法をテストして、イメージ セットに最適な方法を判断します。この例では、大津メソッドを選択します。
- 各サイト イメージについてしきい値を再計算するか、グループ内のすべてのイメージに同じしきい値を使用するかを指定します。心筋細胞画像が明視野であるか蛍光マーカーを使用しているかを示します。
- 心筋細胞の閾値法を示す。前の手順で brightfield を選択した場合、このしきい値の方法は、エッジ フィルターされた明視野画像に適用されます。各サイト イメージについてしきい値を再計算するか、グループ内のすべてのイメージに同じしきい値を使用するかを指定します。
- 各ウェルをカバーするサイト イメージの行数を示します。各ウェルをカバーするサイト イメージの列数を示します。核の最小面積をピクセル単位で示します。寛大に低い最小サイズを使用し、より高く、より正確なしきい値は、分析ステップで計算されます。心筋細胞の最小面積を示す。
- 必要な設定を選択したら 、[OK]をクリックします。
- 図 3と図 4に似た画像が画面に表示され、分析パイプラインのさまざまな段階が表示されます。これらのイメージを調べて、しきい値とセグメンテーションが正しく行われていることを確認します。
- 選択した結果フォルダーが分析データ (補足ファイル 1: スクリーンショット 5) で埋められます。解析データ以外のファイルは、名前が「cm_」、「nuclei_」、または「nucleilink_」でない限り、このフォルダーに安全に保存できます。
7. データ分析
注: 生成される csv ファイルは、手動で分析できます。各分析された画像サブセットは、「nuclei(metadata.csv)」、「核(メタデータ)csv」、「心筋細胞(メタデータ)、csv」という名前のcsvファイルのトリプレットを生成し、(メタデータ)は、(name)と(値)という形式の名前と値のペアのシーケンスに置き換えられます。(たとえば、行と列がファイル名に示されている場合、"_row=F" や "_column=8" などの文字列が存在します)。各核および核リンクファイルの無名の左端列は、核 ID 番号です。核リンクファイルの「最小」列は、前記核を完全に含む心筋細胞のIDまたは0以外の場合は0である。核の「最大」列は、一部に前記核を含む最も番号の高い心筋細胞のID、またはそうでなければ0である。心筋細胞ファイルの「平均」列は心筋細胞ID番号である。
- Rstudio で 「多核化サーバー.R を分析する」を開きます (補足コード ファイルとして提供されます)。
- このファイルの先頭には、"folderName" という名前の変数があります。その隣にファイルパスがあります。ここでは、最後の手順で選択した出力データ フォルダへのパスを最後のスラッシュ (補足ファイル 1: スクリーンショット 6) なしで入力します。
- スクリプト編集ウィンドウの左上隅に、実行 アプリケーションという緑色の矢印が表示されているはずです。この矢印をクリックします。データが読み込まれ、アプリがポップアップ表示されるには、しばらく時間がかかる場合があります。
- 最初に、3つの格子グラフが表示され、1つは最小有効な核面積閾値を示し、1つは最小有効な核平均強度しきい値を示し、1つは心筋細胞の最大有効な最小フェレットの直径を示す。スライダーを使用してこれらのしきい値を設定します (補足ファイル 1: スクリーンショット 7)。
注:これらの各グラフでは、有効な核または心筋細胞に対応する大きな広いピークが存在し、破片または誤ったセグメント型心筋細胞を表す広い尾に横たわっているべきです。しきい値を使用して、各ピークの 1 つの尾を切り取ります。 - 下にスクロールします。[ 選択したしきい値を適用 する]ボタンをクリックします( 補足ファイル1の下部: スクリーンショット7)。
- [ 印刷強度分布] ボタンをクリックします。これにより、各グループ変数のサンプル全体と個別のサブプロットの両方の核強度分布のプロットがレンダリングされます。
注: たとえば、および
グループ変数がフィジーダイアログの正規表現に入力された場合、行と列ごとの強度分布を示すプロットがここに表示されます (補足ファイル 1: スクリーンショット 8)。照明と染色条件がサンプルの異なる部分にわたって一定であった場合、これらのプロットはすべて、二量体核用の2つの強度ピーク、調光器、背の高いピーク、四トラフィド核用のより明るく短いピークを明確に示す必要があります。 - サンプル内変動は、このパターンがサンプルプロット全体で見えなくなる結果となり、行、列、またはその他のグループ変数によって、二数と四量体のピークの位置に大きな多様性があります。後者の場合は、このバリエーションを考慮するために、[ グループ別に正規化 ]チェックボックスを下にスクロールします(補足ファイル1:スクリーンショット9)。
- ボタンをクリックして 計算プロイディ (補足ファイル 1: スクリーンショット 9)。[ 推定プロイディ分布をプロット] ボタンをクリックします。グラフは、右側の空のウィンドウに表示されます。正規化されたサンプル全体グラフでは、2 つのピーク パターンが以前でなければ表示されます。
- しきい値を選択して、スライダを使用してディプロイドと四肢のピークを互いに分離し、外れ値をスライダーで分離します (補足ファイル 1: スクリーンショット 9)。下にスクロールします。ボタンをクリックして 、プロイドと核生成を計算 します (補足ファイル 1: スクリーンショット 10)。
- [ 印刷] ボタンをクリックし、[結果フォルダに保存]をクリックします。選択した結果フォルダに保存されたプロットも、このインタラクティブウィンドウ(補足ファイル1:スクリーンショット10)に表示されます。
Representative Results
心筋細胞は、上記のプロトコルに従って単離した。この方法を用いて、我々は通常、非心筋細胞細胞を汚染することなく比較的純粋である均一に単一化された心筋細胞を得る(図1A)。心筋細胞は、特性サイズと複屈折により明視野顕微鏡で容易に同定されます。この技術は実装が容易で、同等の心筋細胞の収量と品質を持つ異なる分離から一貫した結果を提供します(図1B)。分離された心筋細胞は、さらに使用する前に、数週間4°Cで保存することができます。
上記のプロトコルに従って単離された心筋細胞は、心筋細胞サイズ、心筋細胞プロイド、免疫細胞化学などの様々な下流用途に使用することができる。代表的な結果として、このプロトコルに従って単離された心筋細胞は、特異的タンパク質の局在を検出したり、それぞれ心筋細胞DNA複製を検出するために、クリック化学用の抗体およびフルオロクロム共役アジドを使用して染色できることを示した。例えば、サルコメアの特徴的なz線染色パターンを示すαアクチニンを認識する抗体を用いて心筋細胞を染色した(図2A)。別の実験では、固定心筋細胞を単離する前に、チミジンアナログ5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)をマウスに投与した。心筋細胞単離後、標準的なプロトコル13を用いてEdUを組み込み、単核、二核、三核心筋細胞のいずれかでS相を受けた心筋細胞を検出することができた(図2B)。
分離法の有用性をさらに拡大するため、DNA染色の統合に基づく心筋細胞プロイドの定量を可能にするパイプラインを開発しました。細胞や核のプロイドステータスを測定するには、核および心筋細胞をセグメント化する必要があります。図 3は、個々の核を特定するために使用した戦略の表現を示しています。まず、元の画像DNA染色像(図3A)が強度に基づいて閾値される(図3B)。ここでは、DAPIを使用してDNAを染色しましたが、DNA含有量と線形相関を示す他の核色素は機能します。このプログラムではフィジーの強度閾値法を選択できますが、この例では大津の方法が使用されました。画像の端に触れている、または指定された最小ピクセル領域のしきい値より小さい核マスクは除外されます。次いで、楕円は核マスクにフィットし、個々の核をセグメント化する。図 3Cは、元のイメージにこれらの楕円を重ねて示しています。次に、マスクに穴が埋め込まれ、画像のピクセルは、それらが最も近い楕円に基づいて領域に分割されます (図3D)。これらの領土の境界は、核クラスターを通して線を引くために使用され、核セグメンテーションプロセスを終える(図3E)。
次のステップは心筋細胞の検出を含む。蛍光染色された細胞に基づいて得られる心筋細胞画像(図4A)では、このプロセスは核の場合と非常によく似ています。画像は、選択したしきい値方式(この場合は三角形法)によって計算された強度値に基づいてしきい値を設定します。画像の境界に接触しているか、特定のサイズを下回っている特定の心筋細胞マスクは除外され、正しくセグメント化された心筋細胞を提供するためにマスクに穴が埋められます(図4B)。心筋細胞は核よりも不規則な形状を有するため、心筋細胞クラスターをセグメント化する試みは行われなかった。これらのクラスターは、解析ステップ中に、その最小フェレットの直径の高さにもとづいて除外されます。明るいフィールド画像からのセグメンテーションは、わずかに異なる方法で進行します。まず、元の明視野画像(図4C)は、Sobelエッジフィルタで処理されます。このフィルターは、イメージ内の各ピクセルのグラデーションの絶対値を計算します。急速な変化のある領域のピクセルは高い値を受け取り、画像の滑らかな領域のピクセルは低い値を受け取ります。このエッジフィルターされた画像は、トライアングル法を用いて強度によって閾値され、マスクされた心筋細胞が生じる(図4D)。これらの非常に不規則なマスクは、2ピクセルの半径を持つ円を使用して形態学的閉鎖を介して平滑化され、リンクされ、黒い領域を重ねることなく円が収まらない画像内のすべての白い領域を埋めます(図4E)。最後に、マスク内の穴が埋まり、境界に接触する領域が除外され、小さな粒子が除去され、心筋細胞のセグメンテーションプロセスが終了する(図4F)。
その後、分節化戦略を用いて、個々の心筋細胞の核形成状態を決定することができます。このアプローチを用いて、出生後の早期タイムポイントで、外血CD-1マウスの心臓から単離された心筋細胞の核形成状態を決定した。新生児マウスの心臓(生後1日目)は、その時点で心筋細胞の大部分が単核化されていることを示した(図5:新生児)。この高頻度の単核化心筋細胞は、単核化心筋細胞が全心筋細胞集団の約25%を占める若年マウス(2週齢)でははるかに低い(図5:若年)最後に、心筋細胞内の個々の核のプロイド状態を測定し、それらが二量体か四量体かを判断することができます。これらの結果は、青年期マウスにおける四量体核の高頻度を示す(図6)。
図1:固定後の心筋細胞分離の効率。 (A) 核を示すためにDAPIで染色された単離された心筋細胞の代表的な画像。(DAPI(青)、ブライトフィールド(グレー))(B)生後3ヶ月で異なるマウスから分離された心筋細胞の収率。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単離型心筋細胞の免疫細胞化学 (a) αアクチニン(αアクチニン(赤)およびDAPI(青))に染色された心筋細胞の代表的な画像。(B) EdU(赤)とDAPI(青)を組み込んだ心筋細胞に染色した。単核化された代表的な心筋細胞(左)、二核(中央)および三核化(右)およびEdU陽性が示されている。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:原子力セグメンテーションの戦略 (A) 元の DAPI チャネルイメージ。(B)しきい値画像(この例では、大津の方法を使用した)。(C) 元の DAPI 染色画像上にオーバーレイされたしきい値イメージから識別されたマスク。(D) 核マスクに基づくボロノイテッセレーション(E) 分割クラスターが強調表示された最終セグメント化された核。スケールバー= 100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:心筋細胞のセグメンテーションの戦略(A)元の蛍光トロポニンI染色心筋細胞画像。(B)三角形の閾値画像、穴を埋め、小さなオブジェクトと境界に触れたものを除外した後。(C) 元の明視野心筋細胞画像 (D) エッジフィルターおよび三角形閾値心筋細胞画像 (E) 2ピクセルの半径でモルフォロジークロージング後のエッジフィルター画像 (F) 穴を埋め、小さな物体と境界に触れたものを除いた画像を除く。スケールバー= 100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:核数に基づく心筋細胞の分類 新生児の心臓(1日齢)は、若年性心臓(生後14日)よりも多くの単核心筋細胞を含む。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:核1個あたりの心筋細胞DNA含有量の分布 新生児(左)では、単核化CM核の13.5%が四価数であり、二核化CM核の11.9%が四トラピドである。若年(右)では、単核化CM核の33.9%が四価数であり、2核化されたCM核の31.2%が四トラピドである。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:ソフトウェアのスクリーンショット。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
補足ファイル 2: AnalyzeNucleation.py。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
補足ファイル 3: 多核化サーバー.R を分析します。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
Discussion
心筋細胞は培養で維持することができないので、そのアーキテクチャと機能11を研究できるように原発性心筋細胞を分離することが重要である。したがって、心筋細胞の分離技術は、心臓フィールドで広く使用されています。目標が心筋細胞の機能的側面を決定することであるならば、実行可能な心筋細胞を分離することが重要である。これらの生きた心筋細胞はまた、単離された心筋細胞に対する免疫染色を行うために使用することができる。しかし、生きた心筋細胞を単離する技術を最適化することは技術的には困難であり、最良の技術でさえ、通常は60〜65%の生きた棒状心筋細胞しか得られ、残りの心筋細胞はすべてボールアップして死んでいるか死んでいるか11,12,12である。ここでは、研究者が最初に心臓を固定し、心筋細胞を効率的に分離できる技術を開発しました。この新しいプロトコルは、以前に公開されたプロトコルと比較して、棒状の心筋細胞のはるかに高い収率を可能にします。さらに、核形成とプロイドに基づいて心筋細胞を自動的に分類するイメージング解析プラットフォームを開発しました。これらの新しい方法論により、グループは異なるタンパク質の心筋細胞を染色し、心臓の再生可能性のサロゲートとして心筋細胞の精始および核形成状態を研究することができる。
ここで説明するプロトコルは比較的簡単で、高度な機器なしで実行できます。消化のためのコラゲナーゼの量とインキュベーション時間は、コラゲナーゼロットとそれを提供する会社によって異なる場合があります。コネラゲーゼ2型は、生きた心筋細胞を得るための心臓を消化するのに最も広く用いられているため、2型を用いた。我々の観察に基づいて、我々は線維化のレベルに関係なく、60mg/mLコラゲナーゼタイプ2での夜間インキュベーションがほぼすべてのマウス心臓に最適であると判断した。細胞内タンパク質は固定されており、細胞外コラーゲンほどアクセスできないので、消化過剰の問題は一度もありませんでした。しかし、心臓が適切に消化されない場合、より活発なトリチュレーションが必要になる可能性があり、せん断応力による細胞の断片化を引き起こす。したがって、トリアーレーションに進む前に心臓が適切に消化されていることを確認することが重要です。心臓の硬さは、消化の程度を評価するために鉗子で絞ることによってテストすることができる。コラゲナーゼによるインキュベーションに続いて、心臓は硬くなく、引き裂きやすいはずです。他のタイプのコラゲザーゼも使用できる。以前のレポートでは、コラベナーゼBとD14の組み合わせを使用しました。
さらに、このプロトコルは、心臓15の心筋細胞の総数を評価するために使用できると考えています。しかし、心臓から全ての心筋細胞を得て定量することが目標である場合、コラゲターゼ溶液中で長期間(例えば、3~7日間)、コラゲターゼ溶液を1日1回補充することが重要です。これは、心筋細胞の収量に対するトリウレーションの程度の影響を排除することにより、分離効率の不整合を最小限に抑えます。
DNA含有量を使用して策略を測定することは新しいものではなく、何十年もの間、フローサイトメトリーで使用されてきました。近年、顕微鏡検査を用い、核16あたりのDNA含有量を推定することが同様に可能であることが示された。ここでは、新たに形成された心筋細胞の代理として、心筋細胞核のプロイドを測定するためにこの戦略を実施した。心臓再生の分野における独断は、単核化されたジプロイド心筋細胞のみがサイトカネシスを受け、新しい心筋細胞を生じさせることができるということです。生体内での新しい心筋細胞形成を測定することは非常に困難であるため、DNAヌクレオチドアナログの投与後に追い込まれた心筋細胞を単離し、単核化のレベルを決定し、新しい心筋細胞を生成する心臓の能力の近似として使用されてきた。ここでは、心筋細胞のプロイドを容易に定量化できるImageJのマクロを提供する。G1ピークの位置を正確に推定するには、最低でも500個の核を測定する必要があります。染色および画像化条件が画像プレートの全ウェルにわたって一貫していることを確認するために注意が払われる場合、サンプル全体で500個の核のみを画像化する必要があり、そうでなければ、画像群18、19,19あたり500個の核が必要である。核化とプロイドのイメージングベースの測定の制限は、2次元画像を使用する場合、実際の心筋細胞核から核と接着細胞を区別することが困難である。このような付着細胞は、多核細胞の量を過大評価し、四肢位心筋細胞核集団の測定の精度を低下させる可能性がある。この問題を解決するための1つの可能な戦略は、心筋細胞核マーカーPCM166、2020を使用することです。しかし、適切に固定された細胞や組織に対して信頼性の高いPCM1染色を得ることは困難でした。
もう一つの潜在的な制限は、一部の核染色画像が重要なバックグラウンド細胞質染色を有し、広範な前処理なしでフィジーの組み込みの方法を使用して適切な閾値を防ぐことである。さらに、このバックグラウンド蛍光の予測値への不規則な寄与は、その精度を低下させる。また、細胞がDNA染色液に十分な時間放置されない場合、蛍光色素は核内の飽和に結合せず、核積分強度とDNA含有量の線形関係の仮定は正確ではなくなります。
ソフトウェアは心筋細胞クラスターをセグメント化できず、代わりに分析からそれらを除去する点に留意すべきである。したがって、比較的低密度(例えば、1000細胞/cm2)で心筋細胞を播種することが極めて重要である。さらに、ソフトウェアは、エンドツーエンドと長い、特異な心筋細胞を並べた2つの心筋細胞を区別することはできません。このようなクラスターは、誤って多核化推定を膨らませる可能性があります。
上記の方法では生存可能な心筋細胞を得ることができず、動的細胞プロセスの測定には使用できませんが、免疫染色を行うことが目的であれば、上記の方法は、心筋細胞の収率が高く、形態およびタンパク質局在化の面でより良い品質を有する既存のプロトコルよりも優れていると考えています。最後に、説明した方法は、臨床サンプル14、21,21から心筋細胞を単離するために使用することができる。私たちは、記載された方法論は、異なる研究者が高品質の心筋細胞を取得し、新しい心筋細胞形成の代理人として核形成と策略を測定するのに役立つと信じています。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
JHvBは、NIH、再生医療ミネソタ、ハートウェル財団の個別生物医学研究賞からの助成金によって支援されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
| Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
| Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
| Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
| Cytation3 | BioTek | - | Used for automated imaging for DNA analysis |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
| donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
| Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
| ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | - | Used for analyzing images |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
| Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
| Nikon A1R HD25 | Nikon | - | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
| Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
| Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
| Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
| R | r-project.org | - | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), e146 (2017).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).
- Eschenhagen, T., et al. Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement. Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
- Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Shaklee, J., et al. Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry. Scientific Reports. 8 (1), 6657 (2018).
- Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
- Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
- Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy. Cell Division. 13, 6 (2018).
- Woo, L. A., et al. High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).
- Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation. Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
